朱曉艷,古淑青,孫 欣,鈕 冰,鄧曉軍
(1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 食品工程系,上海 200436;2.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)
明膠是一種重要的食品添加劑,通常用于糖果、果凍等食品的生產(chǎn)[1-2],此外,還應(yīng)用于藥品膠囊等醫(yī)療領(lǐng)域[3-5]。食用明膠主要來源于豬、牛、魚等動(dòng)物的骨和皮,是膠原蛋白的水解產(chǎn)物[6]。在伊斯蘭教中,嚴(yán)禁食用含豬源性成分的非清真產(chǎn)品。一些伊斯蘭國(guó)家制定嚴(yán)格的法規(guī)[7],要求生產(chǎn)商和進(jìn)口商在產(chǎn)品上標(biāo)明清真認(rèn)證,以區(qū)別非清真產(chǎn)品。清真食品以其“健康”的理念,同樣吸引著非穆斯林消費(fèi)者,清真產(chǎn)業(yè)成為快速增長(zhǎng)的消費(fèi)領(lǐng)域[8],然而部分不法商家為降低成本采用較廉價(jià)的原材料(如豬明膠),導(dǎo)致?lián)郊俸唾N錯(cuò)標(biāo)簽的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。而不同物種間DNA和蛋白質(zhì)的相似性、加工過程中DNA和蛋白質(zhì)的降解,對(duì)食品中明膠來源的鑒定造成困難,因此迫切需要開發(fā)一種用于檢測(cè)豬源性明膠的可靠且靈敏的分析方法。
目前,已建立了多種檢測(cè)明膠及含明膠食品中豬源性成分的方法,主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[9-15]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[16-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-25]和衰減全反射傅立葉變換紅外光譜法(ATR-FTIR)[26-28]等,方法可大致分為基于DNA的方法和基于蛋白質(zhì)的方法(如圖1)。本文主要對(duì)不同分析方法的優(yōu)點(diǎn)與不足進(jìn)行綜述,以期為明膠中豬源性成分的鑒定提供參考。
圖1 加工食品中豬源性明膠的檢測(cè)方法Fig.1 Detection methods of porcine gelatin in processed food
PCR檢測(cè)的可靠性和敏感性取決于DNA的質(zhì)量[29],脂肪、多糖和礦物質(zhì)等PCR抑制劑的存在,可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果[30];此外,食品加工過程會(huì)導(dǎo)致DNA的降解[31-32]。因此,對(duì)加工食品進(jìn)行前處理以制備高質(zhì)量DNA對(duì)PCR擴(kuò)增至關(guān)重要。目前加工食品中DNA的提取方法主要分為裂解液提取法和試劑盒提取法。
1.1.1裂解液提取
該法可通過直接裂解釋放DNA,常用裂解液有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和異硫氰酸胍。通常步驟為:加入蛋白酶K降解蛋白質(zhì),使DNA充分游離;以酚-氯仿-異戊醇抽提,去除雜質(zhì);加入異丙醇或無水乙醇沉淀DNA,并將沉淀溶解于三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)緩沖液中。王瑞元等[33]比較了5種不同裂解液對(duì)奶糖中DNA的提取效果,結(jié)果表明改良SDS裂解液提取的DNA濃度、純度及PCR擴(kuò)增效果最佳。
1.1.2試劑盒提取
市售DNA提取試劑盒多采用旋轉(zhuǎn)柱技術(shù)和/或移動(dòng)固相提?。?4],可最大限度回收DNA片段以確保DNA的高質(zhì)量。Lee等[9]利用試劑盒從明膠膠囊中提取的DNA得率為6.5~131 ng/μL;Sultana等[11]從高度加工的食品樣品中得到的DNA提取量仍可達(dá)到約4~12 ng/μL。但該方法成本高昂、操作繁瑣。
1.2.1常規(guī)PCR
常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)又稱傳統(tǒng)PCR,通過DNA聚合酶在一定反應(yīng)體系中對(duì)DNA目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增,如圖2所示。常用的遺傳標(biāo)記12S rRNA、16S rRNA、細(xì)胞色素b(Cytb)和細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因以及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和置換環(huán)(D-loop)區(qū)域,拷貝數(shù)高且高度保守,已被廣泛用于哺乳動(dòng)物、魚類等物種的鑒定[35]。與單拷貝基因相比,這些多拷貝基因的使用可使PCR方法達(dá)到更低檢出限(LOD)。Lee等[9]利用16S rRNA基因成功區(qū)分了市售膠囊中的明膠來源,其中豬源性DNA的檢出限(LOD)達(dá)0.01 ng/μL。
圖2 PCR特異性引物原理圖Fig.2 Schematic diagram of PCR specific primer
1.2.2多重PCR
多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)指在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上使用兩對(duì)及以上不同引物,同時(shí)擴(kuò)增或檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。此方法較常規(guī)PCR具有高通量、特異性好、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)[36]。Nikzad等[10]利用線粒體DNA(mtDNA)同時(shí)檢測(cè)膠囊中豬和牛的DNA,檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%;Sultana等[11]針對(duì)Cyt b基因?qū)η逭嫫放铺枪M(jìn)行四重PCR測(cè)定,成功區(qū)分了產(chǎn)品中的豬、牛和魚明膠,LOD可達(dá)0.001 ng。此方法由于在體系中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng),對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高,技術(shù)要素和影響因素控制不當(dāng)易造成特異性和靈敏度降低,甚至無法檢出[37]。需控制引物個(gè)數(shù),并在保證引物特異性前提下減少引物間的非特異性結(jié)合。
1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitine PCR,qPCR)指在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上向體系中加入熒光基團(tuán),通過熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的一種核酸定量技術(shù)[38]。其擴(kuò)增與檢測(cè)在封閉體系中進(jìn)行,避免了常規(guī)PCR檢測(cè)中電泳帶來的污染問題。目前常用的熒光系統(tǒng)包括SYBR green、Taq Man探針和分子信標(biāo)(MB),原理如圖3所示。Sudjadi等[12]采用D-loop序列檢測(cè)市售膠囊中豬源性DNA,LOD為5 pg;Mohamad等[13]利用染色體MPRE42重復(fù)序列結(jié)合MB檢測(cè)實(shí)際樣品中的豬DNA,LOD低至1 pg;Cai等[14]利用Taq Man探針在低至1 pg/mL的濃度下靈敏地檢測(cè)到膠囊中的豬DNA。
圖3 qPCR常用熒光系統(tǒng)原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of common fluorescence system of qPCR
1.2.4多重?zé)晒舛縋CR
多重?zé)晒舛縋CR(Multiple fluorescence quantitative PCR)指在qPCR基礎(chǔ)上使用兩對(duì)及以上不同引物和相應(yīng)探針,同時(shí)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。此方法兼具多重PCR和熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn),重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng),可進(jìn)行定量和定性分析,同時(shí)減少了環(huán)境污染[37]。Taq Man探針是多重?zé)晒舛縋CR體系中的常用探針,通過在不同序列末端標(biāo)記不同熒光基團(tuán)(Reporter)及相應(yīng)的猝滅基團(tuán)(Quencher),即可形成不同的Taq Man探針[39]。Sultana等[15]建立的qPCR方法對(duì)混合明膠的檢出限可達(dá)0.005 ng/μL,并成功應(yīng)用于口香糖、果凍等市售清真樣品的鑒定。
1.2.5PCR-Southern雜交
PCR-Southern雜交是通過將變性生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段與固定在膜上的特異性探針雜交,對(duì)物種特異性進(jìn)行識(shí)別的方法,其流程圖見圖4。Mutalib等[40]針對(duì)mt DNA Cytb基因設(shè)計(jì)引物,在Olipro?豬基因芯片上進(jìn)行Southern雜交,LOD可達(dá)0.001 ng,而常規(guī)PCR方法均未檢出。將Southern雜交和PCR技術(shù)相結(jié)合,可以檢測(cè)到極少量的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物,方法靈敏、重復(fù)性好,但操作繁瑣。
圖4 PCR-Southern雜交流程圖Fig.4 Flow chart of PCR-Southern blot
食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)深加工后遭到嚴(yán)重破壞,因此對(duì)加工食品中微量蛋白質(zhì)的提取顯得尤為重要。樣品前處理與檢測(cè)方法有關(guān),在衰減全反射傅立葉變換紅外(ATR-FTIR)光譜法測(cè)定中,所有樣品不需要任何預(yù)處理[27-28];采用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)通常需要將提取的樣品進(jìn)行酶解[19-21,23-24]。蛋白質(zhì)的提取方法主要包括有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法和表面活性劑吸附法。
2.1.1有機(jī)溶劑沉淀法
有機(jī)溶劑可通過降低水溶液的介電常數(shù),破壞蛋白質(zhì)的水化膜,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和沉淀[41]。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇和丙酮。但該方法易造成蛋白質(zhì)變性,需將有機(jī)溶劑預(yù)冷(-20℃)并在低溫下操作。沉淀后還需將有機(jī)溶劑吹干,并將蛋白顆粒溶解在緩沖溶液中,加入適量保護(hù)劑(如2-巰基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS)穩(wěn)定蛋白質(zhì)[17,42-43]。
2.1.2鹽析法
向含有蛋白質(zhì)的溶液中加入鹽溶液,可以改變蛋白質(zhì)的疏水相互作用,增強(qiáng)或減少蛋白質(zhì)的溶解性[41]。常用的中性鹽主要有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。此法不易使蛋白質(zhì)變性,但提取效率較低,可通過適當(dāng)加大樣品濃度、調(diào)節(jié)pH值和溫度提高分離效率。
2.1.3表面活性劑吸附法
由于蛋白質(zhì)包含極性、非極性和帶電基團(tuán),故表面活性劑可與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。這一原理被廣泛應(yīng)用于提取和純化蛋白質(zhì)[44]。根據(jù)極性基團(tuán)的解離性質(zhì),表面活性劑可分為陽(yáng)離子型表面活性劑(Cationic surfactant,CS)、陰離子型表面活性劑(Anionic surfactant,AS)、兩性表面活性劑(Zwitterionic surfactant,ZS)以及非離子型表面活性劑(Non-ionic surfactant,NIS)。聚山梨醇20(Tween20)是一種典型的食品級(jí)低分子量NIS,可以充分提取吸附蛋白[42,45]。較有機(jī)溶劑沉淀法和鹽析法,表面活性劑吸附法可減少試劑使用和實(shí)驗(yàn)步驟。
2.2.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)
酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbnent assay,ELISA)是一種將抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的免疫分析方法[46],最常用的兩種ELISA方法為間接法和夾心法。由于該方法樣品制備簡(jiǎn)單,并且具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),成為一種檢測(cè)商業(yè)產(chǎn)品中明膠的可行方法,但近緣物種之間膠原蛋白序列的高度同源性,導(dǎo)致抗體受到交叉反應(yīng)的限制,表現(xiàn)出較差的物種特異性。
Tukiran等[16]建立了3種競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA方法用于快速檢測(cè)食用燕窩(EBN)中的豬明膠,LOD分別為0.033、0.082、0.052 mg/mL;進(jìn)一步研究表明,該方法同樣適用于果凍、棉花糖等加工產(chǎn)品的檢測(cè),LOD為0.05μg/mL[17];Doi等[18]建立了兩種適用于分析不含熟肉制品的加工食品中豬明膠的夾心ELISA方法,檢測(cè)限可達(dá)0.78 ng/mL。
2.2.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同進(jìn)行分離,通過物種特異性蛋白質(zhì)條帶分析明膠來源,方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)。Yap等[47]通過SDS-PAGE方法對(duì)市售膠囊進(jìn)行檢測(cè),觀察到豬明膠樣品在110 kDa處有明顯條帶;Azira等[42]結(jié)合主成分分析(PCA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,可以檢測(cè)到牛明膠中5%的豬明膠摻雜率。但此方法分辨率較低,不適用于檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中的明膠來源,可結(jié)合等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì),經(jīng)酶切成肽段后以高分辨率質(zhì)譜進(jìn)一步分析[48]。
2.2.3基于特征肽段的質(zhì)譜法
2.2.3.1液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法質(zhì)譜是表征和鑒定蛋白質(zhì)的首選方法。將蛋白質(zhì)酶解成肽段后進(jìn)行質(zhì)譜分析,可根據(jù)氨基酸組成和物種特征肽段,確定復(fù)雜基質(zhì)中蛋白質(zhì)的來源[49]。此方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏,被廣泛應(yīng)用于食品的摻假鑒定[50-51]。Zhang等[19]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)得到豬特征肽段GPPGSAGAPGK,并發(fā)現(xiàn)脯氨酸羥基化引起的質(zhì)量差異可影響多肽鑒定;Ward等[20]經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)到加工產(chǎn)品中的豬特異性識(shí)別肽AGPAGPDGPLGPAGSR、LNGPAPGR和LGPLGSPGL,其響應(yīng)強(qiáng)且無雜峰;Guo等[21]在UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下,以AGVMGPOGSR作為特征肽段,對(duì)豬明膠的檢測(cè)具有較高專一性,在0.04%低含量下仍可檢出。
2.2.3.2高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱(LTQ/Orbitrap)質(zhì)譜利用離子在特定靜電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)頻率不同進(jìn)行質(zhì)量分析,具有極高的分辨率和質(zhì)量精確度[52],可以明確地區(qū)分明膠來源。Sha等[22]采用LTQ/Orbitrap質(zhì)譜通過各自特征肽段對(duì)混合物中的牛皮明膠、豬皮明膠和阿膠明膠進(jìn)行了明確區(qū)分。每種明膠中可檢測(cè)到的特征肽段的數(shù)量隨著混合物中目標(biāo)明膠濃度的降低而減少;在目標(biāo)明膠含量較低(<10%)情況下仍可檢測(cè)到多個(gè)目標(biāo)特征肽段。
2.2.3.3基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDITOF MS)是一種簡(jiǎn)單、高效、低成本的物種鑒定常規(guī)技術(shù)。Flaudrops等[23]利用MALDI-TOF MS從豬明膠中鑒定出10個(gè)特異峰,豬明膠添加量降至1%時(shí),仍在10個(gè)豬物種特征峰中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)峰。但該項(xiàng)技術(shù)由于需要高性能質(zhì)譜儀與色譜聯(lián)用,其應(yīng)用受到限制。
2.2.3.4納升級(jí)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法納升級(jí)分離技術(shù)是使用流速在10~1 000 nL/min范圍內(nèi)的色譜柱進(jìn)行食品分析的一種方法[53]。該技術(shù)提供了一種更快、更好的食品成分分離手段,具有前所未有的靈敏度和特異性,特別是當(dāng)與MS檢測(cè)聯(lián)用時(shí),有助于解決復(fù)雜樣品中低濃度物質(zhì)的分析問題。此外,該方法的新穎之處在于,可在不依賴數(shù)據(jù)的采集模式下工作,并借助交替的高、低碰撞能量提供明膠的母離子和子離子信息。但與傳統(tǒng)的HPLC儀器相比,該方法耗時(shí)、成本高,不適宜常規(guī)分析[53-55]。
Yilmaz等[24]利用納升級(jí)超高效液相色譜和電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(nanoUPLC-ESI-QTOF MS)成功地區(qū)分了奶酪、酸奶和冰激凌中的豬和牛明膠;Dal Belloa等[25]開發(fā)了一種基于納升級(jí)高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(nanoUPLC-HRMS)的方法檢測(cè)紅酒中的豬明膠,最低檢出限為5μg/mL。
2.2.4衰減全反射傅立葉變換紅外光譜法(ATR-FTIR)
傅立葉變換紅外光譜(FTIR)基于不同化合物的分子結(jié)構(gòu)不同,通過不同和特定的紅外光譜(生物分子指紋)區(qū)分明膠來源,具有快速、簡(jiǎn)便、無損且只需制備少量樣品的優(yōu)點(diǎn),成為鑒別不同食品中摻假和真?zhèn)螁栴}的有效工具[43]。但FTIR光譜法的數(shù)據(jù)結(jié)果通常需要結(jié)合主成分分析(PCA)和化學(xué)計(jì)量學(xué)等現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)工具進(jìn)行處理。Cebi等[26]依據(jù)由肽鍵的C==O伸縮振動(dòng)引起的酰胺-Ⅰ吸收帶以及酰胺-Ⅱ吸收帶成功區(qū)分了牛明膠和豬明膠,并成功應(yīng)用于軟糖的分析[27];Aloglu等[28]結(jié)合模糊的多元規(guī)則建設(shè)專家系統(tǒng)(FuRES)和支持向量機(jī)(SVM)的分類方法成功區(qū)分了牛、豬和魚明膠。
2.2.5微生物酶法
微生物酶法是利用微生物中天然明膠酶的特異性作用水解豬明膠的一種方法。該方法環(huán)保、快速,可以通過重組或定向進(jìn)化提高酶活與特異性,但菌種篩選可能不盡人意[56],需有針對(duì)性的采集樣品并通過大量實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)條件。Shahimi等[57]對(duì)可能的產(chǎn)明膠酶菌落進(jìn)行篩選,并確定了可能與豬明膠特異性水解表達(dá)相關(guān)的基因序列,重組酶的檢出限為微摩爾(μmol)級(jí)。雖未確定特異性水解豬明膠的蛋白酶,但該方法有望成為利用微生物資源鑒定豬明膠的新型方法,并為開發(fā)基于蛋白質(zhì)的快速試紙條法和生物傳感器提供了參考。
表1~2分別列出了部分基于DNA與基于蛋白質(zhì)檢測(cè)明膠中豬源性成分的方法及特點(diǎn)。
表1 PCR檢測(cè)明膠中豬源性DNA的方法Table 1 Detection methods of porcine DNA in gelatin by PCR
表2 基于蛋白質(zhì)檢測(cè)豬源性明膠的方法Table 2 Methods for determination of porcine gelatin based on protein
本文總結(jié)了各種分析方法在純明膠樣品和在食品系統(tǒng)中辨別明膠來源的潛力。其中,傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)等理化分析方法為豬明膠的檢測(cè)提供了良好的途徑,SDS-PAGE電泳、ELISA和實(shí)時(shí)熒光PCR等生物學(xué)分析方法對(duì)豬明膠的檢測(cè)具有良好的特異性。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索現(xiàn)代技術(shù)對(duì)明膠來源進(jìn)行分類的有效性。此外,為提高清真產(chǎn)品鑒定中明膠分析的精密度和準(zhǔn)確度,今后應(yīng)進(jìn)一步將兩種或兩種以上分析方法聯(lián)合應(yīng)用;同時(shí)應(yīng)探索新的快速和非破壞性的方法,如生物傳感器、高光譜成像技術(shù)[58]和化學(xué)成像方法[59-60]。