彭鄒君，邱 萍

（南昌大學 化學系，江西 南昌 330031）

農(nóng)藥自問世以來就被用于保護農(nóng)作物，對高產(chǎn)豐收方面具有十分重要的意義［1］。根據(jù)現(xiàn)有農(nóng)藥的化學成分可將其大致歸為有機氯農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和有機磷農(nóng)藥四類［2－4］。其中有機磷農(nóng)藥（OPs）因成本低、合成簡單、殺蟲活性高和防治對象范圍廣而得到了廣泛的使用，是改革開放以來我國農(nóng)業(yè)中使用量最多的一類農(nóng)藥，也是世界上發(fā)展中國家最常見的殺蟲劑之一［5－6］。

為了達到更好的殺蟲效果，農(nóng)民經(jīng)常會將多種農(nóng)藥混合使用以增強其毒性，但這些農(nóng)藥最終會通過食物鏈進入到人體內(nèi)，極大地威脅人類的身體健康和生命安全［7－9］。世界各國和各組織對農(nóng)藥殘留量均有相關規(guī)定，其中歐盟農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫中報告的果蔬最大殘留限量為0.01 mg/kg［7］，美國環(huán)境保護署（EPA）規(guī)定的水體最大污染水平為0.001～0.25 mg/L［10］。有機磷農(nóng)藥使人中毒的機制是容易與乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性位點相結合，使酶發(fā)生磷酰化反應，致使其失去酶活性。與此同時，神經(jīng)遞質乙酰膽堿（ACh）因無法被失去活性的AChE水解，而在體內(nèi)大量累積，導致膽堿能受體神經(jīng)長期處于興奮狀態(tài)，對大腦的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均造成難以彌補的影響，最終導致死亡［6，11－13］。

目前常見的有機磷農(nóng)藥檢測技術主要有高效液相色譜法、液相色譜－質譜聯(lián)用法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等［14－17］。雖然這些檢測技術的最低檢出限能達到相關要求，但是耗時較長、價格昂貴，且必須由專業(yè)技術人員操作執(zhí)行，不適合在現(xiàn)場條件下，尤其是在緊急情況下進行快速檢測。隨著生物技術和傳感技術的快速發(fā)展，酶生物傳感器因具有靈敏度高、選擇性好、對環(huán)境友好和攜帶便捷等諸多優(yōu)點，已成為近年來國內(nèi)外研究的熱點，是上述經(jīng)典方法最有前途的替代方法，可更快、更簡單地檢測有機磷農(nóng)藥［18］。

當前已查閱到11篇相關的綜述，介紹了各種基于酶抑制作用檢測有機磷農(nóng)藥的方法，以及收集了不同性質農(nóng)藥的信息，如反應機理、催化酶以及特定類別的納米材料。本綜述總結了近年來，基于AChE的抑制作用檢測有機磷農(nóng)藥的新方法和新生代實時檢測技術，以及應用于農(nóng)藥檢測領域的傳感裝置，例如量子點材料、速測卡和智能手機可視化技術。同時，分析了酶抑制法生物傳感器改進的復雜性和局限性，并對其檢測有機磷農(nóng)藥的前景進行了展望。

1 傳感原理

對有機磷農(nóng)藥（OPs）檢測的AChE生物傳感器，主要通過AChE作為識別元件和催化元件。根據(jù)底物不同，存在兩條不同的催化路線。如圖1所示，在A線路中，底物為乙酰硫代膽堿（ATCh），在AChE的作用下能被催化分解為硫代膽堿（TCh）和乙酸。TCh上的巰基（—SH）具有還原性和絡合能力，乙酸能使環(huán)境中的pH值發(fā)生變化。在B線路中，底物為乙酰膽堿（ACh），在AChE的作用下能被催化分解為膽堿（Choline）和乙酸，而膽堿作為底物在膽堿氧化酶（ChO）的催化下能被分解為甜菜堿（Glycine betaine）和過氧化氫。同樣，在這條線路中，乙酸能使環(huán)境中的pH值發(fā)生變化，而過氧化氫的產(chǎn)生使得檢測策略更加豐富多彩。

圖1 基于AChE抑制檢測有機磷農(nóng)藥的不同策略示意圖Fig.1 Different strategies for detecting organophosphorus pesticides based on AChE inhibition

1.1 基于氧化還原反應的檢測策略

眾所周知，含有長共軛封閉結構的有機物質通常具有熒光性質，如4-氨基-3-羥基-1-萘甲酸（AHNSA）在460 nm處有較強熒光強度。使用二氧化錳納米片（MnO2NS）作為熒光探針能夠使AHNSA的熒光發(fā)生猝滅，基于該原理可實現(xiàn)甲基對硫磷的檢測最低檢出限為0.18 ng/mL。該傳感策略是通過OPs抑制AChE來阻斷TCh與MnO2NS發(fā)生氧化還原反應，從AHNSA的熒光強度變化可以定量計算出OPs的濃度［19］。在另一項研究中，MnO2NS還可以直接將無色形態(tài)的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化成藍色的氧化形態(tài)（oxTMB），其特征吸收峰位于652 nm。由于MnO2NS被TCh上的巰基分解，TMB不會被氧化，導致吸光度降低。通過快速監(jiān)測吸光度，該策略可用于1～100 ng/mL對氧磷的檢測［20］。Li等［21］采用簡單的一鍋水熱法，分別使用20種天然氨基酸作為原始材料，合成了一系列熒光碳點（CDs）。實驗結果表明，苯丙氨酸合成的CDs具有類過氧化物酶活性，可在H2O2存在下有效催化TMB。該策略測試甲基對硫磷、敵敵畏和樂果的最低檢出限可分別低至7.12、8.47、14.6 nmol/L。

近年來，上轉換納米粒子（UCNPs）已成為基于熒光檢測分析物的合適選擇。這種納米材料可通過多光子或雙光子機制在近紅外光的激發(fā)下發(fā)出強可見光，從而將長波長輻射轉換為熒光。此外，UCNPs還具有許多優(yōu)勢，如特殊的化學和光學結構，更強的組織穿透性、細胞低毒性和光漂白抗性。Li等［22］使用MnO2NS制備了NaY/GdF4∶Yb和Er UCNPs用于快速、高選擇地檢測OPs。Wang等［23］以MnO2包覆的金納米粒子（GNP@MnO2SPs）為探針，在單粒子水平上設計了一種用于OPs定量分析的生物傳感器。基于GNP的局域表面等離子體共振原理，暗場光學顯微鏡可在單粒子水平上觀察到粒子的顏色和散射強度的變化（如圖2）。通過計算綠色和紅色通道中單個GNP@MnO2SPs的散射強度比（Rg/r），可以精確量化OPs的含量，最低檢出限為0.006 pg/mL，遠低于其他方法。

圖2 GNP@MnO2 SPs的檢測原理［23］Fig.2 Detection principle of GNP@MnO2 SPs［23］

1.2 基于絡合反應的檢測策略

Liu團隊［24］構建了一種基于羅丹明B覆蓋金納米粒子（RB－AuNPs）的高靈敏雙讀數(shù)法——比色法和熒光法，檢測復雜溶液中的OPs。檢測機制是AuNPs能夠猝滅RB的熒光，同時溶液為紅色，而TCh的巰基能與AuNPs結合恢復RB的熒光強度，并使溶液的顏色保持藍色。通過這種雙讀數(shù)法測定策略，獲得甲萘威、二嗪磷、馬拉硫磷和甲拌磷的最低檢出限分別為0.1、0.1、0.3、1 ng/mL，均低于歐盟農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫和美國農(nóng)業(yè)部報告的最大殘留限量。類似地，牛血清白蛋白（BSA）包裹金銀復合納米團簇（BSA@AuAgNC）后在650 nm處有強烈的熒光強度，而二價銅離子（Cu2+）能夠猝滅該納米復合物的熒光強度［25］。Suo等［26］基于碳量子點（CQD）和金納米團簇（AuNCs）之間的熒光共振能量轉移（FRET）原理，開發(fā)了一種比例熒光系統(tǒng)用于靈敏檢測OPs的含量。通過一鍋法合成的CQD－AuNCs分別在420 nm和680 nm處有發(fā)射峰，通過測量F680/F420與OPs的增加比率進行線性擬合。與之類似的是，銀納米顆粒（AgNPs）能夠降低改性石墨烯氮化碳（g－C3N4）的熒光強度。AChE催化ATCh水解后形成TCh，能誘發(fā)AgNPs的聚集，導致g－C3N4的藍色熒光恢復，最低檢出限為0.032 4 ng/mL［27］。

Zhao團隊［28］報道了一種基于AChE活性抑制和功能化DNA，銅催化點擊化學高靈敏檢測OPs的均相熒光分析方法。Cu2+作為DNA探針點擊化學連接的催化劑，在鏈置換后，使得熒光信號降低（如圖3）。值得注意的是，由于Cu2+介導的信號放大效應，即使Cu2+的微小變化也能極大地影響點擊效率，提高OPs檢測的靈敏度。寡綠是一種非熒光染料，但其熒光強度在不同堿基或DNA結構的存在下變化很大，已被廣泛用于生物分析。Zhou等［29］發(fā)現(xiàn)，寡綠在剛性T－Hg2+－T DNA結構中具有非常強的熒光強度?；诠丫G對該結構的特異性選擇以及巰基與Hg2+的強親和力，開發(fā)出一種寡綠響應的無標記熒光傳感器用于檢測OPs，最低檢出限可達2.9 pg/mL。

圖3 Cu2+作為DNA探針策略的檢測原理［28］Fig.3 Detection principle of Cu2+as DNA probe strategy［28］

1.3 基于pH值變化的檢測策略

導體量子點（QDs）由于超小的尺寸、高的水分散性和強的熒光性，通常被認為是構建傳感器熒光團的期望替代物。碲化鎘量子點（CdTe QDs）具有良好的水分散性，能發(fā)射出明亮的橙紅色光，而質子化的CdTe QDs會降低熒光強度。AChE催化ACh水解為CH3COOH后，可使CdTe QDs質子化，從而實現(xiàn)對OPs的靈敏檢測，最低檢出限為0.027 ng/mL［30］。Zhao等［31］發(fā)現(xiàn)4-嗎啉基硼酸（4-MPBA）在pH 3.0～5.8范圍內(nèi)變化敏感，從而將其設計成一種新型pH響應熒光探針，用于檢測果汁中的OPs。Li等［32］將二硫蘇糖醇（DTT）與氯金酸（HAuCl4）通過一步氧化還原反應合成S－S－AuNCs。該化合物能在655 nm處發(fā)射出超小尺寸和高分散度的亮紅光。令人感興趣的是，S－S－AuNCs對低pH值表現(xiàn)出獨特的響應，可作為檢測OPs的高效生物傳感器。

1.4 基于蝕刻反應的檢測策略

隨著科學研究的發(fā)展，金納米棒（AuNRs）的刻蝕技術已發(fā)展成為一種多色的檢測技術。AuNRs的棒長度不同，表觀的顏色不同，最大吸光度的出峰位置也不同。碘單質分子（I2）能對AuNRs進行刻蝕，使之長度縮短，表觀顏色發(fā)生變化，最大吸光度的出峰位置發(fā)生偏移；存在于底物ATCh中的碘離子（I-）能與額外加入的碘酸根離子（IO3-）發(fā)生歸中反應，生成I2；而TCh中的巰基能與I2反應生成二硫鍵，阻斷其對AuNRs的刻蝕［33］，檢測原理如圖4所示。

圖4 基于AuNRs刻蝕技術的檢測原理［23］Fig.4 Detection principle of AuNRs etching technology［23］

作為金屬有機骨架（MOFs）的典型代表，類沸石咪唑骨架結構材料（ZIFs）因其孔徑微小、比表面積高和生物可降解而被廣泛用于生物傳感器領域。ZIFs所具有的獨特孔隙率使得各種納米材料均可嵌入其中，并用于熒光傳感。Cai團隊［34］通過AChE和ChO的酶解產(chǎn)物H2O2在AuNCs@ZIF－8上的雙重作用，實現(xiàn)了熒光和比色信號相結合檢測OPs。該方法通過破壞ZIF-8的菱形十二面體結構，以削弱對AuNCs的限制，從而使熒光猝滅，且釋放的AuNCs作為過氧化物模擬酶可催化TMB呈藍色。

1.5 基于電化學技術的檢測策略

電化學發(fā)光（ECL）技術一直致力于解決比色和熒光傳感器中存在的問題，可作為靈敏可信的OPs殘留測定方法。Li等［35］基于二氧化錳納米片（MnNFs）和三（2，2’-聯(lián)吡啶）合釕（［Ru（bpy）3］2+）研制出一種均相ECL傳感器。通過靜電相互作用，形成MnNFs－Ru納米復合材料，由于［Ru（bpy）3］2+被限制在納米復合材料中，導致MnNFs呈現(xiàn)微弱的ECL信號。然而，當ATCh水解為TCh后，MnNFs－Ru納米復合材料中的MnNFs被還原成Mn2+，［Ru（bpy）3］2+釋放到溶液中?；谠摬呗砸约癘Ps對AChE活性的抑制作用，可測定對氧磷的含量，最低檢出限為0.053 ng/mL。He等［36］設計了一種以羧基功能化的納米粒子（c-PFBT NPs）為陽極ECL探針，L－半胱氨酸封端的CdS量子點（L－CdS QDs）為陰極ECL探針的新型雙信號組合納米探針。通過酶催化反應原位產(chǎn)生的H2O2被開發(fā)為同時調(diào)節(jié)兩種信號的雙功能調(diào)節(jié)劑（如圖5所示）。類似地，Oana等［37］將羧酸功能化的單壁碳納米管和聚（3，4-亞乙基二氧噻吩）（CSWCNT：PEDOT）均勻電沉積在工作電極上，開發(fā)了基于AChE的生物傳感器；該研究發(fā)現(xiàn)敵敵畏對AChE的抑制信號與其質量濃度在1～600 ng/mL范圍內(nèi)成正比，使用微分脈沖伏安法的檢出限為0.447 ng/mL［37］。

圖5 c-PFBT NPs@CdS QDs雙信號組合納米探針的檢測原理［36］Fig.5 Detection principle of c-PFBT NPs@CdS QDs dual signal combination nano-probe［36］

然而，與電化學技術相關的工作均需在電極表面進行繁瑣復雜的修飾和固定，這可能會干擾分子的生物活性和電極制造的重復性，且成本高，反應條件苛刻，程序繁瑣。

1.6 其他檢測策略

Yang團隊［38］合成了一種多酶靶向熒光探針（3CP）用于靶向多種水解酶，其具有大的斯托克斯位移（130 nm）和良好的生物相容性。在酶催化水解時產(chǎn)生強烈熒光，釋放熒光的物質命名為HPQ，可用于檢測多種農(nóng)藥的存在。受水凝膠的長效化學發(fā)光性質和MOF-Pt材料的高度穩(wěn)定類過氧化氫酶活性的啟發(fā)，Lu等［39］構建出一種具有長效化學發(fā)光體系的N-（4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾/Co2+/殼聚糖（ABEI/Co2+/CS）傳感器。在MOF－Pt和Co2+的協(xié)同催化下，H2O2分解產(chǎn)生的羥基自由基和超氧陰離子能夠緩慢擴散到水凝膠的孔徑中，產(chǎn)生強烈的熒光發(fā)射信號。由于水凝膠的高粘度性質，分子在體系中擴散緩慢，ABEI－H2O2體系的熒光強度非常持久，在2 h后仍有60%的保留。

總之，基于AChE抑制檢測OPs的生物傳感器因易于操作、靈敏度高和響應快速的特點而受到越來越多的關注。近年來構建的多種用于OPs檢測的生物傳感器，具有不同的AChE作用環(huán)境，不同的特性、工作范圍和檢出限［40－49］（如表1）。

表1 基于乙酰膽堿酯酶抑制檢測有機磷農(nóng)藥的策略總結Table 1 Summary of strategies for detecting of OPs based on AChE inhibition

2 傳感裝置

2.1 紙基傳感裝置

基于AChE抑制的實驗室紙基生物傳感器因價格低廉、便攜式和可視化讀出模式的實際優(yōu)勢，已成為檢測OPs的一種強有力方法。最近，Huang等［50］利用γ-MnOOH納米線（NWs）作為可降解納米酶，以TMB為指示劑，設計了一種比色紙傳感器。這種便攜式傳感器在溶液和固體狀態(tài)下均表現(xiàn)出良好的選擇性和抗干擾能力，在真實血清和蔬菜樣品中的測試結果準確度較高。這表明了紙基傳感裝置在食品、環(huán)境和醫(yī)療領域應用的優(yōu)越性。在其他研究中，研究者基于海藻酸鹽水凝膠的混合纖維素酯（MCE）濾紙，以AChE作為傳感元件構建了一種定量紙基傳感器［51］。該策略借助ACh水解改變?nèi)芤旱乃釅A度，以釋放Ca2+引發(fā)海藻酸鹽的水凝膠化進行檢測。溶液的粘度變化能夠導致濾紙上斑點溶液的擴散直徑發(fā)生顯著變化，通過測量擴散直徑能夠定量確定OPs的濃度（如圖6所示）。

圖6 用海藻酸鹽水凝膠的混合纖維素酯濾紙為傳感平臺［5］Fig.6 Sensing platform of cellulose ester filter paper mixed with alginate brine gel［5］

類似地，Chen等［52］利用聚集誘導發(fā)射（AIE）原理制作了一種高性能的熒光紙分析裝置（PAD）。該試紙條具有較高穩(wěn)定性，能夠獲得無設備的OPs視覺傳感效果，最低檢出限為1.60 ng/mL。此外，基于化學發(fā)光（CL）的多酶偶聯(lián)可折疊紙基傳感器具有良好的準確性和穩(wěn)定性，可用于現(xiàn)場甲基毒死蜱的檢測［53］。而利用多酶偶聯(lián)反應，能構建使用羥基氧化鈷納米片（CoOOH NFs）的CL測試條用于甲基對硫磷檢測［54］。但多酶偶聯(lián)的原理使得檢測系統(tǒng)較為復雜，試紙制作成本相應提高。總之，便攜式紙基傳感裝置能夠破除地域限制，為OPs的分析檢測走出實驗室提供了新途徑。

2.2 智能手機可視化技術

由于現(xiàn)代智能手機攝像頭強大的成像功能，使用手機進行比色和定量檢測越來越受到科研工作者的關注，但一個主要限制因素是照明條件對觀察的顏色強度會產(chǎn)生影響。為了克服這一影響，研究人員已轉向制作外部附件或手機內(nèi)部的軟件分析和校正圖像［55－58］。Yu等［59］設計了一種條形碼格式的檢測芯片，通過位于部分條形碼下方的聚二甲基硅氧烷（PDMS）通道板，制作整個條形碼，以便智能手機上的條形碼掃描應用程序能直接讀取。當目標農(nóng)藥的存在或缺失導致條形碼上編碼的數(shù)據(jù)發(fā)生變化時，可獲取檢測的定性信息，使用應用軟件對編碼數(shù)據(jù)進行分析可實現(xiàn)定量檢測。

便攜式紙基傳感裝置雖成本低廉，但僅能通過裸眼大致估計OPs的殘留含量，無法得到較為精確的具體數(shù)值。而與智能手機結合使用時，可以將比色卡顯示出的顏色分解為三原色，以獲得R（紅）、G（綠）、B（藍）值。通過R、G、B三者之間的數(shù)量關系，可進一步得到OPs的具體濃度?；诰奂T導發(fā)射（AIE）納米粒子（PTDNPs－0.10）和二維MnO2納米片（2D－MnNF）設計的紙基分析裝置［60］，可通過G值和B值的數(shù)量關系，得到對氧磷含量的最低檢出限為0.73 ng/mL，低于相關文件所規(guī)定的最大殘留限量（10 ng/mL）［7］。同樣，基于AuNCs@ZIF－8設計的體系中，灰度值與OPs含量具有線性關系，最低檢出限為0.4 ng/mL［34］。將多酶偶聯(lián)系統(tǒng)的水凝膠試劑盒與智能手機檢測技術相結合，同樣能用于OPs的現(xiàn)場篩選。通過將MnO2NFs嵌入到海藻酸鈉水凝膠中，可構建基于靶向響應水凝膠的試劑盒。通過比較，獲得的結果與傳統(tǒng)實驗室微孔板讀數(shù)器得到的結果一致［61］。

智能手機可視化技術顯示出超高便攜性、易于普及性和操作可控性，將OPs的實時檢測與新生代互聯(lián)網(wǎng)技術相結合，可為未來目標物的檢測提供新思路。

2.3 3D打印技術

3D打印技術是一種制造成本低、效益好、可面向客戶定制的強大技術，在單個物體的制造過程中能夠做到逐層構建器件的要求，近年來展現(xiàn)出強大的表面改造性和功能化的能力［62］。微型馬達（SPM）是一種真正實現(xiàn)在線檢測的新系統(tǒng)。利用3D打印技術構建的微型馬達，能夠在水下不同深度巡航，以現(xiàn)場探測不同水域中的OPs殘留量［63］。這種方法是第一次將OPs檢測同3D打印技術相結合，為未來現(xiàn)場檢測設備的發(fā)明提供了新的可能。在另一項研究中，利用熔融沉積建模（FDM）技術的3D打印機實現(xiàn)了設備組件的快速原型制作［53］。利用三維設計平臺創(chuàng)建設備組件的三維模型，然后使用專有軟件對3D模型進行切片，將其轉換為一系列薄層進行打印。這些工作為設計迷你暗箱提供了有利支撐，為化學發(fā)光的折疊式紙基生物傳感器用于現(xiàn)場檢測提供了穩(wěn)定條件，也為智能手機的穩(wěn)定成像發(fā)揮了重要作用。

3 結 論

多年來，基于AChE抑制的生物傳感器已成為檢測OPs殘留的最佳候選，并在環(huán)境和食品分析應用中變得越來越重要。本綜述總結了基于AChE抑制的各種檢測OPs傳感策略的工作原理和分析性能。盡管大多數(shù)OPs生物傳感器顯示出超強的靈敏度、精確度和穩(wěn)定性，但使用更加新穎的方法將這些OPs生物傳感器從實驗室推向商業(yè)市場仍差強人意。這是因為大多數(shù)OPs生物傳感器的設計經(jīng)過了繁瑣的過程，并且涉及有毒有害物質和高濃度的酶。此外，大多數(shù)OPs生物傳感器所使用的AChE從電鰻和果蠅體內(nèi)提取，在實際樣品中因受溫度和pH值影響并不十分穩(wěn)定。

基于相關報道的檢索可發(fā)現(xiàn)，由于熒光和紫外測試所需時間少、操作簡單、樣品無須另外加工、數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠和靈敏度高，因此大部分傳感策略的數(shù)據(jù)處理集中在熒光分光光度計和紫外可見分光光度計。在上述傳感策略中某些策略使用到雙酶甚至三酶的系統(tǒng)。對于大規(guī)模的實際應用，基于AChE的生物傳感裝置易于制造，成本低，并且有足夠的保存時間，而在傳感策略中使用雙酶或者三酶顯然增加了難度，提高了成本。因此，較少考慮使用多酶系統(tǒng)來設計傳感裝置和應用程序進行OPs的檢測。

在對現(xiàn)有研究工作進行深入分析的基礎上，本綜述討論了制約OPs生物傳感器領域應用的局限，并提出了AChE輔助OPs生物傳感器設計的改進策略。設計高靈敏度的基于AChE抑制的生物傳感系統(tǒng)，仍是未來一部分科技工作者的主要課題。