方林鑫 李志紅 張守科 張 威 舒金平 王浩杰

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 杭州 311400)

黃脊竹蝗(Ceracriskiangsu)是重要的森林害蟲，危害100多種竹子，分布廣、暴發(fā)頻繁，常造成重大經(jīng)濟損失，制約我國竹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展(徐天森等，2004)。2020年，黃脊竹蝗飛躍中老邊境侵入我國，引發(fā)蝗災(zāi)，損失慘重。利用黃脊竹蝗的“趨泥行為”誘殺成蟲是當前防治該蟲的主要手段，而明確黃脊竹蝗“趨泥行為”的發(fā)生機制是制定高效行為調(diào)控策略的關(guān)鍵(滕瑩，2012；張守科等，2017；張威等，2018)。目前，僅在行為和生理生化層面上對竹蝗“趨泥行為”的內(nèi)在機制進行了探索，要進一步揭示其分子機理，基因調(diào)控層面的解析是必要的研究內(nèi)容，其中相關(guān)基因的定量表達分析至關(guān)重要，但至今尚未有黃脊竹蝗內(nèi)參基因篩選和鑒定方面的報道。

反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)具有定量準確、靈敏、通量大等優(yōu)點，是驗證基因特異性表達及研究基因功能的有效方法(Yanetal.，2012；Ibanezetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。在RT-qPCR試驗中，RNA濃度、cDNA轉(zhuǎn)換效率、擴增效率等因素存在誤差且無法避免，最終影響試驗結(jié)果的準確性。為了減輕誤差因素的干擾，在檢測基因表達水平變化時常需要引入內(nèi)參基因作為參照物(Radonietal.，2004；Huggettetal.，2005；Mughaletal.，2018)，借助樣品中內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達量對試驗結(jié)果進行校正和標準化，以提升結(jié)果的可信度，而篩選不同試驗條件下合適的內(nèi)參基因是開展相關(guān)研究的關(guān)鍵(陳孝仁等，2012；Liangetal.，2014)。理論上，內(nèi)參基因應(yīng)在任何試驗條件或任意部位組織細胞中均可穩(wěn)定表達，并且其表達量不受任何因素影響(Kozeraetal.，2013；Jansketal.，2013)，因此內(nèi)參基因一般選用傳統(tǒng)的管家基因，如β-肌動蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、α-延伸因子基因(EF1-α)、核糖體蛋白基因(RPS、RPL)和18S核糖體RNA基因(18SrRNA)等(S?kalskaetal.，2006；史彩華等，2016)。同時，理想的內(nèi)參基因不存在假基因，具有高度特異性，與目的基因也具有相似的表達量(Wanetal.，2010；Caoetal.，2012；Ferdousetal.，2015)。但研究表明，同一種內(nèi)參基因常因物種、發(fā)育條件、環(huán)境脅迫等因素的差異，其表達穩(wěn)定性存在顯著差異，并不存在絕對穩(wěn)定的萬能內(nèi)參基因(Yuanetal.，2014；Shakeeletal.，2018)，且內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達也是相對的(Lüetal.，2018)。在開展基因定量研究時，需選擇在同試驗條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，且通常會選用2個或以上內(nèi)參基因，以保證獲取更為準確的數(shù)據(jù)(史彩華等，2016；Shivhareetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。本研究使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件對不同齡期、成蟲不同性別及不同組織黃脊竹蝗的內(nèi)參基因進行篩選和穩(wěn)定性分析，以期為黃脊竹蝗及直翅目其他昆蟲基因定量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及處理

黃脊竹蝗卵采自湖南省益陽市桃江縣竹蝗發(fā)生區(qū)(111°85′32″ E，28°42′89″ N)，置于溫室中(26 ±4 ℃，RH70%±5%)孵化，孵化后的蝗蝻轉(zhuǎn)移至2.0 m×2.0 m×2.0 m的60目大網(wǎng)中用2年生盆栽毛竹(Phyllostachysedulis)飼養(yǎng)至成蟲。對孵化前3天的卵粒，孵化后不同齡若蟲(1～5齡)及成蟲進行隨機取樣，3個重復(fù)，每重復(fù)4粒卵或4頭蝗蟲(雌、雄各2頭)。解剖成蟲頭部、觸角、唇須、精巢、卵巢和飛行肌等器官/組織樣品。所有樣品用液氮速凍，并保存于 -80 ℃冰箱中供試。

1.2 試劑及主要儀器

試劑盒：RNAprep Pure Tissue Kit(天根生化科技有限公司，中國)、FastQuant RT Super Mix(天根生化科技有限公司，中國)、2 × Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，中國)、PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystem，美國)；化合物：β-巰基乙醇(CAS：60-24-2，中國國藥集團)；主要儀器：LifeECO-PCR儀(杭州博日科技有限公司，中國)、Q225 q-pcr熒光定量PCR儀(北京酷搏科技有限公司，中國)、SIGMA-3K15離心機(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，德國)、Q6000-Quawell超微量可見分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，美國)。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

按照試劑盒說明對不同齡若蟲、成蟲不同部位進行總RNA提取，利用可見分光光度計對總RNA的質(zhì)量和濃度進行檢測，樣品OD260/OD280=1.94 ～ 2.02，凝膠電泳結(jié)果均清晰可見28S與18S條帶，隱約可見5S條帶。每個樣品按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成總cDNA。反轉(zhuǎn)錄過程采用20 μL反應(yīng)體系：4 × FQ-RT Super Mix 5 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O補充至20 μL。反轉(zhuǎn)錄步驟：42 ℃持續(xù)15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，95 ℃持續(xù)3 min(酶滅活過程)。總RNA于 -80 ℃低溫保存，用于合成cDNA；總cDNA于 -20 ℃低溫保存，用于RT-qPCR。

1.4 引物的設(shè)計和合成

基于黃脊竹蝗的二代和三代轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選擇了9種昆蟲常用的內(nèi)參基因：TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin和18SrRNA。NCBI上檢索獲得9種內(nèi)參基因序列(表1)，利用SeqHunter 2軟件在黃脊竹蝗全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(本試驗室構(gòu)建)中比對同源序列；基于同源性最高的序列，使用NCBI在線工具Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計定量PCR特異性引物(表2)，引物長度為20～22個堿基；退火溫度：18SrRNA為59 ℃，其余均為60 ℃；擴增產(chǎn)物長度大于90 bp、小于250 bp。引物均由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 RT-qPCR

采用10 μL反應(yīng)體系：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物(2 μmol·μL-1)各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O補充至10 μL。qPCR采用3步標準反應(yīng)模式：UDG酶激活50 ℃ 120 s；預(yù)變性95 ℃ 120 s；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，熒光信號收集于延伸階段。qPCR反應(yīng)結(jié)束后，立即進行溶解曲線的分析，溶解曲線條件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s(此過程進行熒光采集)。每樣品進行3次平行技術(shù)重復(fù)，Ct值取3次結(jié)果平均值。取1齡～5齡若蟲頭部及雄性與雌性成蟲的觸角、唇須、頭部、肌肉組織和精巢/卵巢共15個組織樣品，每樣品3個重復(fù)。

1.6 標準曲線的繪制和引物擴增效率驗證

將總cDNA模板進行倍數(shù)為5的梯度稀釋，即獲得50、5-1、5-2、5-3、5-4ng·μL-1濃度的cDNA模板，按照1.5節(jié)流程進行qPCR。依據(jù)結(jié)果，以lg(cDNA模板濃度)為橫坐標，Ct值為縱坐標，利用SPSS 20軟件分析二者線性關(guān)系，估計線性方程，得到判定系數(shù)(R2)與斜率，根據(jù)公式E=(10(-1/slope)-1)× 100求得擴增效率E(Radonietal.，2004)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

不同組織分析時選用雄成蟲頭部、觸角、唇須、肌肉組織和精巢，不同性別分析時分別選用雌、雄成蟲頭部、肌肉、精/卵巢，不同發(fā)育期分析選用1齡～5齡若蟲。采用SPSS 20軟件對RT-qPCR所得Ct值整體進行方差分析，利用GeNorm(Vandesompeleetal.，2002)、NormFinder(Andersenetal.，2004)和BestKeeper(Pfaffletal.，2004)軟件評價9種候選內(nèi)參基因在不同條件下的穩(wěn)定性，進行分析與篩選。將Ct進行2-Δt轉(zhuǎn)換相對表達量，在一個內(nèi)參基因中，同一條件下所有樣品Ct與最小Ct之差為Δt，再計算2-Δt，2-Δt用于GeNorm與NormFinder的分析。GeNorm通過計算會得出每個候選內(nèi)參基因的M，M越小的內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，該軟件的特點是最終挑選2個或2個以上最適內(nèi)參基因，內(nèi)參基因個數(shù)判定值為V。當Vn/Vn+1<0.15，n取最小值時，n即為最適內(nèi)參基因個數(shù)；Vn/n + 1均大于0.15時，則以最小Vn/n + 1值時的內(nèi)參基因個數(shù)作為篩選標準(馬飛，2012)。NormFinder計算原理與GeNorm相似，也是通過計算獲得每個內(nèi)參基因穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小，代表該內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定，依據(jù)其穩(wěn)定值進行排序，該軟件的特點是計算樣品間的變異，而且只篩選出一個最合適的內(nèi)參基因。BestKeeper最多只能進行10個內(nèi)參基因和10個目標基因表達水平的比較，將Ct輸入后，自動計算標準變異系數(shù)(SD)與差異值(P)等數(shù)據(jù)用以判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD越小，該內(nèi)參基因越穩(wěn)定，若P大于0.05，則結(jié)果無意義，該軟件的特點是可以分析目的基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種內(nèi)參基因分析與Ct值比較

參照其他昆蟲已公布序列(馮波等，2016；Dzakietal.，2017；Quetal.，2018)，篩選到9種候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(表1)。9種黃脊竹蝗的內(nèi)參基因均首次被鑒定，與其他昆蟲相應(yīng)基因序列一致性均高于70%；另外，黃脊竹蝗9種候選內(nèi)參基因匹配期望值(E)為0(或近為0)，表明比對基因完全匹配，這也說明了這些內(nèi)參基因的高度保守性。

表1 黃脊竹蝗內(nèi)參基因比對Tab.1 Comparison with hit species on reference genes of Ceracris kiangsu

2.2 引物特異性評價與擴增效率檢驗

9種候選內(nèi)參基因不同濃度梯度cDNA模板與Ct值間存在顯著的線性相關(guān)性(P<0.001，0.988 ≤R2≤ 0.998，表2)。每種內(nèi)參基因RT-qPCR溶解曲線圖都呈現(xiàn)明顯單一峰，驗證了引物的特異性(圖1)。計算擴增效率，E均在93%～114%之間，表明RT-qPCR反應(yīng)有效。

表2 候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物序列、擴增效率及判定系數(shù)Tab.2 Sequence,amplification efficiency and determination coefficient of the RT-qPCR primers for candidate reference genes

圖1 不同濃度梯度9種內(nèi)參基因溶解曲線Fig.1 Melting curve of nine reference genes with different concentration gradients

2.3 9種內(nèi)參基因在不同樣品中的表達水平

所有樣品RT-qPCR結(jié)果顯示，整體Ct范圍為7.54～36.22之間，各內(nèi)參基因Ct值組間差異顯著(F=181.95，P<0.0001)。其中，EF1A基因Ct(30.08 ± 2.26)最大，顯著大于除AK(28.23 ± 3.45)和GAPDH(28.76 ± 1.99)外的其他候選基因(圖2)。Actin(23.55 ± 3.84)18SrRNA(10.78 ± 2.58)作為傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，表達豐度相對較高；除18SrRNA與Actin外，各基因Ct表達豐度均在25以上(圖2)。Actin的Ct波動最大，變異值達到13.98；GAPDH在各樣品中表達量波動最小，變異值為6.33。除AK(5.10)和Actin(6.12)外，各基因四分位差(IQR)均小于4，樣品Ct數(shù)據(jù)集中(圖2)。

圖2 9種候選內(nèi)參基因在所有樣品中的CtFig.2 Ct value of nine reference genes in all samples不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05)。Different lowercase letters mean significant difference(P <0.05).

2.4 GeNorm軟件分析

不同組織分析中，V4/5(0.323)的值最小，所以9種待選基因中有4種基因適合作為成蟲不同組織qPCR的內(nèi)參基因，依照M排序依次為RPL10、TUB、GAPDH和RPS27A(圖3A)。不同性別分析與不同組織分析V的結(jié)果相似，均大于0.3，且V2/3為最小值，故RPL10與GAPDH為不同性別qPCR最適內(nèi)參基因(圖3B)。在不同齡若蟲分析時，V3/4=0.149 <0.15，因此有3種基因適合作為不同齡若蟲qPCR的內(nèi)參基因，依照M排序依次為RPS3、RPL10和GAPDH(圖3C)。

圖3 GeNorm軟件評價9種內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig.3 Stability of nine reference genes estimated by GeNorm softwareA：不同組織Different tissues；B：不同性別Different genders ；C：不同齡若蟲Different instars；1:TUB;2:RPS27A;3:RPL10;4:AK;5:GAPDH;6:EF1A;7:RPS27A;8:Actin;9:18S rRNA。括號內(nèi)外數(shù)字表示基因穩(wěn)定值一致。The two gene in and outside the round bracket mean the same stability.

2.5 NormFinder軟件分析

不同組織分析時，最穩(wěn)定內(nèi)參基因為GAPDH(0.320)，RPL10(0.739)次之；不同性別分析時，最穩(wěn)定內(nèi)參基因為GAPDH(0.318)，RPL10(0.458)次之；不同齡若蟲分析時，最穩(wěn)定的2種內(nèi)參基因依次為RPS3(0.107)和RPL10(0.237)(表3)。

表3 NormFinder軟件評價9個內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab.3 Stability of nine reference genes estimated by NormFinder software

2.6 BestKeeper軟件分析

不同組織分析時，穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因為RPL10，18SrRNA次之(雖然EF1A與TUB2種基因的SD比18SrRNA小，但其P均大于0.05，穩(wěn)定值無意義，不適合作為內(nèi)參基因)。不同性別分析時，SD最小的2種內(nèi)參基因為RPL10與GAPDH，EF1A的P大于0.05，穩(wěn)定值無意義，不適合作為內(nèi)參基因。不同齡若蟲分析時，僅4種基因的P小于0.05，按SD由小到大依次為RPL10、RPS3、AK、Actin，可作為內(nèi)參基因(表4)。

表4 BestKeeper軟件評價9種內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab.4 Stability of nine reference genes estimated by BestKeeper software

3 討論

本研究選擇昆蟲常用的內(nèi)參基因在黃脊竹蝗不同發(fā)育階段、不同性別及不同組織中的穩(wěn)定性進行評估，篩選出了穩(wěn)定值合適的基因作為不同條件下的內(nèi)參基因。首次對黃脊竹蝗9種候選內(nèi)參基因(TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin、18SrRNA)進行評價驗證，發(fā)現(xiàn)這9種內(nèi)參基因與其他昆蟲相應(yīng)基因序列一致性極高，匹配差異小，是較佳的內(nèi)參基因候選者，同時也進一步證明了這些內(nèi)參基因在昆蟲進化中具備高度保守性。

內(nèi)參基因的篩選通常采用專業(yè)軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值進行分析，并基于各軟件判定的穩(wěn)定值進行綜合排序以選定合適的內(nèi)參基因。大量研究結(jié)果表明，多內(nèi)參基因組合較單一基因更具優(yōu)勢，但過多的內(nèi)參基因會造成試驗數(shù)據(jù)冗雜，使后續(xù)的基因表達量計算更為繁瑣，因此內(nèi)參基因的最佳數(shù)目通常為2個(王金星等，2014；Shuetal.，2018；Wangetal.，2018)。本研究使用3個軟件對不同條件下的黃脊竹蝗內(nèi)參基因穩(wěn)定值進行了獨立分析，盡管各軟件的計算原理不同，但在不同條件分析時，給出穩(wěn)定性排名前2位的內(nèi)參基因高度重合(圖3、表3、表4)，因此2個內(nèi)參基因是本研究最理想的數(shù)目，與多數(shù)學(xué)者的建議一致。

內(nèi)參基因的選擇因物種或發(fā)育等條件的差異而不同。不同物種之間，最合適內(nèi)參基因的選擇往往不同，GAPDH與UCCR可以作為斜紋夜蛾(Spodopteralitura)不同蟲態(tài)的內(nèi)參基因(Luetal.，2013)，而金紋細蛾(Lithocolletisringoniella)不同蟲態(tài)的最適內(nèi)參基因為β-TUB和β-actin(郭長寧，2014)；東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)在不同齡進行內(nèi)參基因篩選時，最合適內(nèi)參基因為β-actin和RP49(崔淼等，2014)。而本研究結(jié)果表明，在黃脊竹蝗不同齡若蟲階段最適內(nèi)參基因組合為RPS3與RPL10(圖3、表3、表4)。除物種因素外，內(nèi)參基因的選擇與蟲態(tài)和昆蟲身體組織密切相關(guān)。Zhang等(2015)研究表明棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)幼蟲的不同組織中RPS15和RPL13是最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而成蟲的最合適內(nèi)參基因為EF與RPL27。本研究結(jié)果表明黃脊竹蝗成蟲不同組織間最穩(wěn)定內(nèi)參基因與若蟲期最適內(nèi)參基因一致，均為RPS3與RPL10。另外，性別也是影響內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估的重要因素之一。馮波等(2016)發(fā)現(xiàn)，在松褐天牛不同性別內(nèi)參基因篩選時，GAPDH與TUB是最合適的組合；對于牧草盲蝽(Lyguspratensis)，SDHA+GST的組合是不同性別成蟲穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因(賈冰等，2019)；而本研究結(jié)果顯示RPL10+GAPDH組合是黃脊竹蝗不同性別成蟲最適合的內(nèi)參基因(圖3B,表3、4)。

研究表明，RPL10基因在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、二化螟(Chilosuppressalis)等植食性昆蟲不同組織、不同種群密度飼養(yǎng)及不同取食條件下表達非常穩(wěn)定，適合做內(nèi)參基因(Luetal.，2013；徐紅星等，2019)，而本研究中，GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件分析表明，RPL10基因在黃脊竹蝗不同齡期若蟲、雌、雄成蟲及不同組織中均穩(wěn)定表達(圖3B，表3、4)。不同若蟲齡分析時，基于GeNorm與NormFinder評價，RPS3是穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因(圖2、表3，表4)。RPS3的穩(wěn)定性在粉莖螟(Sesamianonagrioides)、家蠶(Bombyxmori)、步甲(Carabidae)中也得到印證，可以作為特定條件下基因表達的內(nèi)參基因(杜暢，2013；Luetal.，2015；劉小強等，2018)。GAPDH是參與糖酵解反應(yīng)的酶，廣泛分布于各種組織中，在進化上高度保守。作為傳統(tǒng)的持家基因，GAPDH常常被作為內(nèi)參基因用于各種昆蟲基因表達研究中。GAPDH在松褐天牛不同發(fā)育階段、不同性別的化學(xué)感受組織中表達非常穩(wěn)定(馮波等，2016)；美國白蛾(Hyphantriacunea)內(nèi)參基因的篩選中，在不同溫度處理下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合是EF1A和GAPDH(陶蓉等，2019)。本研究進一步證實了GAPDH基因的穩(wěn)定性，GAPDH符合BestKeeper軟件對內(nèi)參基因穩(wěn)定性的要求(表4)；同時在NormFinder軟件分析不同組織與不同性別時，穩(wěn)定性最高(表3)。GeNorm分析認為，GAPDH與RPL10是不同性別下基因表達研究中最合適的內(nèi)參基因組合(圖3)。

4 結(jié)論

本研究首次在黃脊竹蝗轉(zhuǎn)錄組基因中鑒定9種內(nèi)參基因，并成功設(shè)計這些基因RT-qPCR特異性引物。利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個軟件對這9種候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行評價，綜合參考3個軟件的優(yōu)勢與特點，在不同組織分析時，最合適內(nèi)參基因為RPL10和RPS3；在不同性別分析時，RPL10與GAPDH為穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因組合；在不同若蟲齡分析時，RPS3和RPL10是最合適的內(nèi)參基因。本研究為后續(xù)黃脊竹蝗功能基因驗證及相對表達量研究奠定了基礎(chǔ)。