宋佳楠，于佳瀅，馮磊，甄簫斐，李海洋，于躍玲，李福強(qiáng)

（1.沈陽航空航天大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110136；2.沈陽航空航天大學(xué)民用航空學(xué)院，遼寧 沈陽110136；3.蘭州交通大學(xué)新能源與動(dòng)力工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

0 引言

隨著化石燃料的供應(yīng)緊張和環(huán)境問題的日益突出，尋找替代能源刻不容緩。生物質(zhì)能源是重要的可再生能源，我國(guó)生物質(zhì)的年產(chǎn)量居世界第一，其中農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量達(dá)7億多t[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年的畜禽糞便產(chǎn)生量高達(dá)40億t，但綜合利用率卻不足60%[2]，[3]。雞糞中含有飼料中未被消化的35%的氮和16%的磷，處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致持久污染[4]。如果能夠合理地利用這部分生物質(zhì)資源，不僅能夠?qū)Νh(huán)境起到保護(hù)作用，還能夠生產(chǎn)沼氣等清潔能源[5]～[7]。同時(shí)，相關(guān)政策的支持也為厭氧消化技術(shù)的工程應(yīng)用帶來了較大的機(jī)遇。

歐洲各國(guó)的沼氣工程發(fā)展迅速，為各國(guó)帶來了巨大的環(huán)境經(jīng)濟(jì)效益。截至2010年，歐盟各國(guó)的大、中、小型沼氣工程已有將近9 000座。在隨后的幾年中，沼氣工程數(shù)量不斷增多，年平均增長(zhǎng)約28%。伴隨著我國(guó)農(nóng)村能源的逐漸匱乏，國(guó)家鼓勵(lì)發(fā)展農(nóng)村沼氣工程，大中型沼氣工程迎來了快速發(fā)展期[8]。單一地對(duì)農(nóng)作物秸稈或畜禽糞便進(jìn)行厭氧發(fā)酵，容易產(chǎn)生氨化、酸化和纖維素不易降解等問題。因此，我國(guó)進(jìn)行了許多關(guān)于混合干發(fā)酵的研究，如混合干發(fā)酵原料配比對(duì)產(chǎn)氣量的影響，溫度和pH值對(duì)產(chǎn)氣效率的影響等，混合干發(fā)酵將是沼氣工程的重要發(fā)展方向[9]。

針對(duì)沼氣工程運(yùn)行過程中微生物學(xué)機(jī)制研究較少的現(xiàn)狀，本文以雞糞為底物，添加10%的玉米秸稈開展中溫連續(xù)式干發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定期監(jiān)測(cè)甲烷日產(chǎn)量、pH值、VFAs濃度、COD濃度和氨氮濃度等參數(shù)的變化，重點(diǎn)分析了發(fā)酵過程的產(chǎn)氣性能以及不同種類酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為雞糞與秸稈混合干發(fā)酵沼氣工程的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行提供一定的技術(shù)支持和微生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以新鮮雞糞為原料，雞糞取自取自遼寧北票宏發(fā)食品有限公司旗下的東官黃古屯肉雞養(yǎng)殖基地，為成年白羽肉食雞的新鮮糞便。玉米秸稈取自沈陽郊區(qū)農(nóng)田，為研磨后的新鮮玉米秸稈（進(jìn)過鍘草機(jī)，處理后長(zhǎng)度≤2 mm）。接種物為含水率80%的新鮮活性污泥，取自沈陽市北部污水處理廠，取回后中溫馴化24 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1為本實(shí)驗(yàn)所用的厭氧消化裝置示意圖。該裝置主要由4聯(lián)30 L厭氧發(fā)酵罐和中央控制系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)時(shí)，雞糞與玉米秸稈的總質(zhì)量為3 000 g，質(zhì)量比為9：1，接種污泥的量為3 000 mL，啟動(dòng)過程中的溫度設(shè)置為37±0.2℃，實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)周期為20 d。實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)后，通過加料（加料的雞糞和玉米秸稈質(zhì)量比也為9：1）使系統(tǒng)內(nèi)的總固體（TS）含量達(dá)到15%以上，根據(jù)產(chǎn)氣情況繼續(xù)加料以提高TS含量，直到系統(tǒng)內(nèi)TS含量達(dá)到20%以上。實(shí)驗(yàn)溫度為37℃，為保證實(shí)驗(yàn)過程中微生物有充足的可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，第0～30天間隔兩日加1 000 g原料，第31～90天每日加1 000 g原料，第91～103天每日加2 000 g原料。

圖1 厭氧消化裝置示意圖Fig.1 Anaerobic reaction digestion device

1.3 檢測(cè)方法

甲烷產(chǎn)量采用LML-1型濕式氣體流量計(jì)和GT901型甲烷氣體檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)量；TS含量采用重量法進(jìn)行測(cè)定；COD濃度采用重鉻酸鉀法進(jìn)行測(cè)定；氨氮（NH4+-N）濃度采用納氏試劑分光光度法進(jìn)行測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）濃度采用分光光度計(jì)比色法進(jìn)行測(cè)定；pH值采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；酶活采用連續(xù)法進(jìn)行測(cè)定；微生物群落采用16 S rRNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣特性分析

雞糞與玉米秸稈混合干發(fā)酵的甲烷日產(chǎn)量和累積產(chǎn)量變化情況如圖2所示。

圖2 甲烷日產(chǎn)量和累積產(chǎn)量的變化情況Fig.2 The changes of daily and cumulative methane production

從圖2（a）可以看出：實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)后，隨著原料的添加，甲烷日產(chǎn)量整體呈上升趨勢(shì)；在前30天，由于進(jìn)料間隔較長(zhǎng)，每次增加原料后，甲烷日產(chǎn)量均呈現(xiàn)出新的峰值；90 d之后的甲烷日產(chǎn)量均值明顯高于前期的甲烷日產(chǎn)量均值；在第100天左右出現(xiàn)了甲烷日產(chǎn)量最高峰，為50.32 L。隨著厭氧消化反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，在每次加料的間隔，雞糞與玉米秸稈的厭氧消化進(jìn)入饑餓階段，消化液中可生化降解的有機(jī)物逐漸被利用，微生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消失殆盡，甲烷產(chǎn)量逐漸降低，直至下一次添加原料，甲烷日產(chǎn)量出現(xiàn)新的峰值。從圖2（b）可以看出，甲烷累積產(chǎn)量的主要變化趨勢(shì)為先快后慢，這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)后半階段的加料間隔明顯縮短且加料量增加，系統(tǒng)內(nèi)的TS含量明顯升高，進(jìn)而造成甲烷日產(chǎn)量和累積產(chǎn)量的上升。

2.2 氨氮濃度的變化情況

氨態(tài)氮是指厭氧消化液中以游離氨（NH3）和銨離子（NH4+）形態(tài)存在的氮，消化液中的氨態(tài)氮通常是由水解細(xì)菌在分解蛋白質(zhì)過程中形成的，簡(jiǎn)稱氨氮。一定濃度的氨氮可以為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供氮源，但是，當(dāng)消化液中的氨氮濃度過高時(shí)，氨氮會(huì)通過阻礙酶的合成而抑制甲烷的產(chǎn)生，氨氮還會(huì)通過被動(dòng)運(yùn)輸?shù)男问竭M(jìn)入微生物細(xì)胞膜中，從而影響細(xì)胞內(nèi)部質(zhì)子和鉀離子的平衡，嚴(yán)重抑制厭氧微生物的活性[10]。因此，控制消化液中的氨氮濃度對(duì)提高厭氧消化效率和甲烷累積產(chǎn)量至關(guān)重要。雞糞與玉米秸稈混合干發(fā)酵過程中氨氮濃度的變化情況如圖3所示。

圖3 混合干發(fā)酵過程中氨氮濃度的變化情況Fig.3 The change of ammonia nitrogen concentration in the process of mixed dry fermentation

從圖3可以看出：在整個(gè)厭氧消化過程中，氨氮濃度整體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；在實(shí)驗(yàn)前期，隨著厭氧消化反應(yīng)的進(jìn)行，水解細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)等大分子進(jìn)行分解，生成大量的氨氮，同時(shí)由于不斷加入反應(yīng)物料，使得氨氮累積量逐漸上升，氨氮濃度在第37天和40天出現(xiàn)峰值，為1 044 mg/L；之后，隨著產(chǎn)甲烷古菌的活性逐漸增強(qiáng)，其以消化液中的氨氮作為合成自身細(xì)胞的氮源，從而導(dǎo)致氨氮濃度逐漸下降[11]；在整個(gè)厭氧消化過程中，氨氮濃度維持在700～1 050 mg/L，消化反應(yīng)過程中無明顯的拮抗反應(yīng)現(xiàn)象出現(xiàn)。厭氧消化液中的氨氮濃度是維持消化系統(tǒng)穩(wěn)定的重要指標(biāo)，若能控制氨氮濃度在適宜的范圍內(nèi)，對(duì)提高甲烷產(chǎn)率和厭氧消化的效率有關(guān)鍵作用。

2.3 pH值和VFAs濃度的關(guān)系

pH值可以反映厭氧消化系統(tǒng)的酸堿狀態(tài)、水解酸化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的活性。VFAs作為生物代謝的中間或最終產(chǎn)物而存在，其積累和消耗對(duì)厭氧消化反應(yīng)有直接影響。圖4反映了雞糞與玉米秸稈混合干發(fā)酵過程中pH值與VFAs濃度的變化情況。結(jié)合圖2和圖4可以看出：甲烷日產(chǎn)量與pH值和VFAs濃度有密切的關(guān)系，pH值與甲烷日產(chǎn)量成正比，當(dāng)pH值升高到最大時(shí)，甲烷日產(chǎn)量也相應(yīng)達(dá)到峰值；而VFAs濃度與甲烷日產(chǎn)量和pH值成反比，VFAs濃度越高，則甲烷日產(chǎn)量和pH值越低。

圖4 混合干發(fā)酵過程中pH值與VFAs濃度的變化情況Fig.4 Changes of pH value and VFAs concentration during mixed dry fermentation

在實(shí)驗(yàn)初期（1～6 d），水解性細(xì)菌產(chǎn)生水解酶把非水溶性大分子（碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等）水解成可溶性的單糖、脂肪酸和氨基酸等較小分子化合物，酸化細(xì)菌將這些小分子化合物轉(zhuǎn)化成了VFAs。此時(shí)消化系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷古菌未完全適應(yīng)環(huán)境，其利用乙酸的速率與各種產(chǎn)酸菌的生產(chǎn)速率不能達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)甲烷速率處于較低水平，從而導(dǎo)致VFAs積累，pH值降低[11]。在第7～24天，每隔兩天加料1 000 g，pH值上升至6±0.2后保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；產(chǎn)甲烷菌數(shù)量逐漸增加，積累的有機(jī)酸被利用，VFAs濃度先減小后逐漸累積。從第31天起，每天加料1 000 g，隨著發(fā)酵底物的增加，VFAs逐漸累積，VFAs濃度在第50天達(dá)到峰值，為19.07 mg/mL，此時(shí)pH值開始從5.87逐漸下降。在第55～78天，系統(tǒng)出現(xiàn)酸化現(xiàn)象，pH值較低，產(chǎn)氣效果較差。加入適量的NaOH調(diào)節(jié)后，pH值在第78天達(dá)到峰值，為6.8～7.3，之后趨于穩(wěn)定。研究表明，甲烷菌適宜的pH值為6.8～7.8，低于6.5或高于8.0均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時(shí)，過低的pH值還會(huì)降低蛋白質(zhì)的生物催化效果，不利于厭氧消化反應(yīng)的進(jìn)行。因此，保持厭氧消化系統(tǒng)適宜的pH值對(duì)提高厭氧消化效率和甲烷產(chǎn)量至關(guān)重要。

2.4 COD濃度和不同種類酶活性的變化關(guān)系

在厭氧消化過程中，多種具有水解作用的酶會(huì)參與到厭氧消化過程中的大部分生物化學(xué)反應(yīng)。消化液的COD濃度可以代表溶解在消化液中的有機(jī)物濃度，因此，根據(jù)消化液的COD濃度可以判斷厭氧消化反應(yīng)器的運(yùn)行狀態(tài)。本研究的發(fā)酵基質(zhì)為雞糞和玉米秸稈，因此，根據(jù)雞糞和玉米秸稈組成，本文研究了厭氧消化過程中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性變化，并分析了消化液中COD濃度的變化與這些酶活性變化的關(guān)系。圖5為雞糞與玉米秸稈混合干發(fā)酵過程中不同種類酶活性與COD濃度的變化情況。

圖5 混合干發(fā)酵過程中COD濃度和不同種類酶活性的變化情況Fig.5 Changes of COD concentration and activities of different enzymes during mixed dry fermentation

從圖5可以看出，COD濃度的總體變化趨勢(shì)為先上升后下降，這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)初期的微生物活性不高，隨著添加物料的增加，消化液中的有機(jī)物濃度逐漸增加，表現(xiàn)為COD濃度逐漸上升，隨著厭氧消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，微生物開始大量繁殖，有機(jī)物被微生物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，導(dǎo)致COD濃度有下降的趨勢(shì)。隨著厭氧消化反應(yīng)的進(jìn)行，各類水解細(xì)菌逐漸適應(yīng)生存環(huán)境，各類水解酶的豐富度逐漸增大，水解類細(xì)菌分泌的纖維素酶和半纖維素酶在促進(jìn)纖維素和半纖維素水解的同時(shí)，還可以提高植物細(xì)胞壁的溶解效率，使植物細(xì)胞內(nèi)更多的內(nèi)溶物通過細(xì)胞壁釋放出來，從而提高厭氧消化反應(yīng)的原料利用效率[12]。從圖5還可以看出，纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的最大值分別為2.44×105，0.34，153.06，471.93，307.76 IU/L，COD濃度的最大值為110 400 mg/L；隨著厭氧消化反應(yīng)的進(jìn)行，這5種酶的活性逐漸降低，最后趨于穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)后期，通過人為調(diào)控將pH值調(diào)到6.8以上并維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，此階段的進(jìn)出料相對(duì)穩(wěn)定，COD濃度逐漸降低，產(chǎn)甲烷量逐漸升高，系統(tǒng)內(nèi)的有機(jī)質(zhì)得到有效降解，VFAs濃度保持在18 mg/mL左右，產(chǎn)酸細(xì)菌的產(chǎn)酸效率與產(chǎn)甲烷菌對(duì)VFAs的利用效率達(dá)到相對(duì)平衡的狀態(tài)，此時(shí)的厭氧消化效率較高且較為穩(wěn)定。

2.5 干發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況

厭氧消化過程中水解酸化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的動(dòng)態(tài)平衡有利于消化反應(yīng)的穩(wěn)定運(yùn)行。厭氧消化系統(tǒng)中的微生物是動(dòng)態(tài)變化的，在每個(gè)時(shí)期都有其特定的優(yōu)勢(shì)菌群。本實(shí)驗(yàn)分別在第1（D1），5（D5），10（D10），15（D15），20（D20），30（D30），40（D40），50（D50），60（D60），70（D70），80（D80），90天（D90）對(duì)消化液進(jìn)行取樣，并利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)的微生物群落進(jìn)行鑒定和分析。

圖6為古菌在門和屬水平的菌群相對(duì)豐度變化情況。從圖6可以看出；實(shí)驗(yàn)各階段的優(yōu)勢(shì)菌群均為廣古菌門（Euryarchaeota），因此，可進(jìn)一步尋找廣古菌門活性最高的生存環(huán)境，并與厭氧消化的反應(yīng)條件相結(jié)合，從而提高產(chǎn)氣量；在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度增加至27%；古菌屬水平的優(yōu)勢(shì)菌在初期為甲烷絲菌屬（Methanosaeta），隨著厭氧消化的進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)菌逐漸演變?yōu)榧淄閿M桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷球形菌屬（Methanosphaera）。甲烷球形菌屬和甲烷擬桿菌屬為實(shí)驗(yàn)過程中的主要優(yōu)勢(shì)菌種，均屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，主要利用H2、甲醇和乙酸等物質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)甲烷代謝，將其轉(zhuǎn)化為CH4和CO2。甲烷絲菌屬（Methanosaeta）屬于乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，是實(shí)驗(yàn)前期的優(yōu)勢(shì)菌，其相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化而逐漸降低，且受玉米秸稈添加量的影響，主要將甲基胺或甲醇歧化為CH4和CO2，或?qū)2，CO2和乙酸轉(zhuǎn)化為CH4[12]。

圖6 古菌門和屬水平的菌群相對(duì)豐度變化情況Fig.6 Changes in the relative abundance of bacterial groups at the phylum and genus levels

圖7為細(xì)菌在門和屬水平的菌群相對(duì)豐度變化情況。從圖7可以看出；在反應(yīng)初始階段，細(xì)菌門水平上的優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），隨著反應(yīng)的進(jìn)行，變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度逐漸減少，而厚壁菌門在整個(gè)反應(yīng)過程中均為優(yōu)勢(shì)菌；細(xì)菌屬水平上相對(duì)豐度有所降低，沒有特別明確的優(yōu)勢(shì)菌；前15天的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）。第50～70天的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌屬，80天后的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌屬和厭氧球菌屬（Anaerococcus）。乳酸菌屬屬于乳桿菌目，在實(shí)驗(yàn)中期的相對(duì)豐度較高，可產(chǎn)生乳酸和多種脂肪酶，增加厭氧消化系統(tǒng)的丁酸含量；厭氧球菌屬在實(shí)驗(yàn)中期和后期的相對(duì)豐度較高，屬于專性厭氧菌，可以將蛋白質(zhì)和葡萄糖水解為有機(jī)酸和醇類等物質(zhì)。綜上可以得出，接種的污泥菌屬主要由擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門等微生物構(gòu)成，該類微生物主要參與纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物的水解，對(duì)促進(jìn)厭氧消化底物的水解起著重要作用，具有發(fā)酵氨基酸（半胱氨酸、亮氨酸、絲氨酸、色氨酸）產(chǎn)生小分子有機(jī)物的功能，這些細(xì)菌共同參與水解酸化反應(yīng)，為產(chǎn)酸細(xì)菌提供可利用的的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[13]。因此，可通過對(duì)這些細(xì)菌的進(jìn)一步培養(yǎng)，增加其豐富度，以加速對(duì)底物中纖維素和半纖維素的水解，提高反應(yīng)的產(chǎn)氣效率。

圖7 細(xì)菌門和屬水平TOP10菌群相對(duì)豐度變化情況Fig.7 Changes in relative abundance of TOP10 flora at the phylum and genus levels

3 結(jié)論

①雞糞與玉米秸稈混合干發(fā)酵時(shí)所表現(xiàn)出來的產(chǎn)甲烷規(guī)律，主要與物料的添加和產(chǎn)甲烷菌的活性有明顯關(guān)系；在一定有機(jī)負(fù)荷內(nèi)，加料量越大、加料頻率越高，甲烷的日產(chǎn)量越高。

②在整個(gè)厭氧消化過程中，氨氮濃度表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，氨氮濃度沒有對(duì)厭氧微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生拮抗作用；消化液的pH值呈現(xiàn)出先穩(wěn)定后減小，最后上升至7±0.2并保持穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，VFAs濃度的變化趨勢(shì)為先上升后趨于穩(wěn)定。

③COD濃度最大值為110 400 mg/L，纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的最大值分別為2.44×105，0.34，153.06，471.93，307.76 IU/L。

④細(xì)菌在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌為廣古菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，屬水平上各微生物的相對(duì)豐度明顯下降，沒有明顯的優(yōu)勢(shì)菌。