白靜科 何雷 吳彥輝 陳玉國(guó) 楊晉燕 牛龍龍 李成軍 李淑君

摘 ?要：為進(jìn)一步明確河南煙區(qū)主要病毒種類及侵染類型，2020年從河南9個(gè)煙區(qū)分別采集疑似煙草普通花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）和煙草蝕紋病毒（TEV）侵染的煙草樣本共407份，分別利用上述4種病毒的特異性引物進(jìn)行單重RT-PCR病原檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，河南煙區(qū)病毒病樣本的總檢出率為98.28%，其中，檢出率最高的是CMV為89.19%，其余依次為TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。侵染類型分為單一病毒侵染和復(fù)合病毒侵染，單一病毒侵染率為23.34%，該侵染類型中CMV所占比例最高，為16.71%;復(fù)合病毒侵染率為74.94%，復(fù)合病毒侵染類型中CMV+TMV所占比例最高，為36.86%，其次分別為CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY兩種侵染類型，侵染比例均是7.62%。因此，CMV是2020年河南煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒，田間侵染以復(fù)合病毒侵染為主，侵染類型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY。

關(guān)鍵詞：河南煙區(qū);病毒病;侵染類型

Abstract： To further clarify the main virus species and infection type in Henan Province， 407 samples were collected from nine tobacco-growing areas in Henan Province in 2020. The samples were suspicious of being infected by Tobacco mosaic virus （TMV）， Cucumber mosaic virus （CMV）， Potato virus Y （PVY） and Tobacco etch virus （TEV） respectively. Then four pairs of specific primers were used to detect viruses that infected tobacco samples by single RT-PCR. The results showed that the infection percentage of virus diseases in Henan tobacco-planting areas was 98.28%， in which CMV （89.19%） took the top spot followed by TMV （63.88%）， PVY （28.99%） and TEV （24.32%）. It also suggested that infection type included single infection and co-infection. What's more， single infection rate was 23.34%， in which CMV had the highest infection percentage with 16.71%. And co-infection percentage was 74.94% which was much higher than the single infection rate. Furthermore， there were three main co-infection types， including CMV+TMV with the highest infection percentage 36.86%， followed by CMV+TMV+PVY and CMV+TEV+PVY which both had an infection percentage of 7.62%. Therefore， CMV was the dominant virus in Henan Province in 2020. And the infection types were CMV+TMV， CMV+TMV+PVY and CMV+TEV+PVY， which indicated that co-infection types occurred seriously in tobacco field.

Keywords： Henan tobacco-growing area; virus disease; infection type

煙草是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物，煙草病毒病是危害煙草生長(zhǎng)的主要病害，其造成的產(chǎn)量損失可達(dá)30%～50%，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕產(chǎn)。目前在中國(guó)煙草上報(bào)道的病毒超過(guò)25種，較常見(jiàn)的有煙草普通花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、煙草蝕紋病毒（TEV）和煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）等[1-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，RT-PCR技術(shù)憑借其高靈敏度特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)中，孔寶華等[4]、楊金廣等[5]、鄭軒等[6]、張俊祺等[7]、楊洋等[8]分別建立了幾種主要病毒的單重RT-PCR和多重RT-PCR檢測(cè)方法，為準(zhǔn)確快速檢測(cè)煙草病毒病提供了技術(shù)保障。截止到目前，煙草病毒研究學(xué)者基于RT-PCR技術(shù)分別明確了廣西[5]、陜西[6]、云南[2，9]、湖南[10]、畢節(jié)[11]等地?zé)煵莶《静〉姆N類、分布及侵染情況。

河南煙區(qū)作為我國(guó)濃香型烤煙風(fēng)格的重要產(chǎn)區(qū)，學(xué)者們對(duì)其煙草病毒病的關(guān)注度也較高，李淑君等[12]鑒定發(fā)現(xiàn)2000年許昌煙區(qū)病毒病主要有PVY、CMV、馬鈴薯X病毒（PVX）、TMV、煙草環(huán)斑病毒（TRSV）等;李義強(qiáng)等[13]報(bào)道河南地區(qū)2000—2002年主要病毒種類是PVY和CMV;青玲等[1]在2005—2008年間僅發(fā)現(xiàn)PVY單獨(dú)侵染河南煙草;羅朝鵬等[14]發(fā)現(xiàn)2010年侵染河南煙草的病毒以CMV和TMV為主;張全民等[15]調(diào)查發(fā)現(xiàn)2012年TMV、CMV是平頂山煙區(qū)的主要病毒，PVY、TEV在河南各地普遍發(fā)現(xiàn)并日趨嚴(yán)重;白靜科等[3]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2015—2017年河南煙區(qū)危害最為嚴(yán)重的病毒依次為TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV。

就同一煙區(qū)而言，不同年份引起煙草病毒病流行的優(yōu)勢(shì)毒原會(huì)發(fā)生變化[1]，目前對(duì)河南煙區(qū)病毒種類的研究也局限于ELISA方法，鑒于此，本研究選取前人研究發(fā)生較多的TMV、CMV、TEV和PVY 4種病毒，于2020年在河南煙區(qū)分別采集疑似該4種病毒侵染的樣本，利用單重RT-PCR技術(shù)對(duì)這4種病毒分別進(jìn)行病原檢測(cè)，以期進(jìn)一步明確近年來(lái)河南煙草主要病毒的發(fā)生種類及侵染類型，為病毒病的精準(zhǔn)有效防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

于2020年5—8月在河南省9個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)采集疑似TMV、CMV、TEV、PVY癥狀的樣本共407份，其中三門峽76份、洛陽(yáng)60份、濟(jì)源10份、許昌80份、平頂山52份、漯河25份、駐馬店30份、南陽(yáng)62份、信陽(yáng)12份。樣本癥狀主要表現(xiàn)有植株矮化，葉片花葉、畸形、閃電紋，蝕刻斑，脈壞死等。所采集樣本為單株樣本，采集部位為植株上部幼嫩葉片，采集樣本放入紙袋中，液氮速凍后于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?總RNA提取 ?采用Trizol法提取植物總RNA，取0.1 g煙葉樣本，使用Trizol（Thermo Fisher Scientific 公司）試劑提取總RNA，具體方法參照試劑說(shuō)明書(shū)，以健康煙草葉片為陰性對(duì)照。用Eppendorf D30紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得RNA的濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 ?cDNA第一鏈的合成反應(yīng) ?按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect real-time），TaKaRa公司]說(shuō)明書(shū)，去除基因組DNA后，RT-PCR合成cDNA，?20 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 ?PCR擴(kuò)增和目的片段克隆 ?用于TMV、CMV、TEV、PVY擴(kuò)增的特異性引物參考文獻(xiàn)[6]，具體見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix II（天根生化科技有限公司）10 μL，用ddH?O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min，然后是94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，于紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相記錄。

1.2.4 ?PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序與序列分析 ?將上述PCR產(chǎn)物分別在紫外透射儀上切下相應(yīng)條帶，參照膠回收試劑盒（TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit，TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)定序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比較分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草總RNA提取質(zhì)量檢測(cè)

用Trizol法提取煙草樣本總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)28 S和18 S兩條清晰的條帶，無(wú)DNA條帶，結(jié)果如圖1所示。提取樣本的OD260/OD280比值均在1.7～1.9，表明樣本組織中蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)基本去除。提取的RNA純度較理想，可用于后續(xù)研究。

2.2 ?煙草病毒RT-PCR擴(kuò)增片段序列分析

TMV、CMV、PVY和TEV的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，結(jié)果顯示TMV擴(kuò)增片段約為237 bp，CMV擴(kuò)增片段約為273 bp，PVY擴(kuò)增片段約為456 bp，TEV擴(kuò)增片段約為347 bp，而健康煙草中均未檢測(cè)到4種病毒片段的存在（圖2）。此外，上述4種病毒的PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果也表明，TMV、CMV、PVY和TEV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為237、273、456和347 bp，片段大小與引物設(shè)計(jì)預(yù)期相符，獲得序列與Genebank中各病毒外殼蛋白基因序列比對(duì)結(jié)果表明，同源性均在98%以上，表明本研究中所用引物對(duì)煙草中TMV、CMV、PVY和TEV的檢測(cè)具有很高的特異性。

2.3 ?不同病毒種類侵染率及區(qū)域分布

表2結(jié)果顯示，4種煙草病毒在全省分布不均勻，檢出率最高的是CMV 89.19%，其余依次為TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。全省各煙區(qū)中，洛陽(yáng)、漯河和南陽(yáng)地區(qū)4種病毒檢出率順序與全省一致，均是CMV>TMV>PVY>TEV;許昌、駐馬店地區(qū)則是CMV>TMV>TEV>PVY;三門峽地區(qū)是CMV>PVY>TMV>TEV;信陽(yáng)地區(qū)TMV與CMV檢出率相同，PVY與TEV檢出率相同;平頂山、濟(jì)源地區(qū)則是TMV>CMV，且全省只有濟(jì)源地區(qū)未檢測(cè)到TEV，其他地區(qū)均檢測(cè)到這4種病毒。因此，CMV是河南煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒，且全省不同煙區(qū)主要病毒種類及數(shù)量均存在差異。

2.4 ?單一病毒侵染和復(fù)合病毒侵染數(shù)量及分布

由表3可知，407份疑似病毒侵染的煙草葉片樣本分別經(jīng)4種特異性引物擴(kuò)增檢測(cè)后，7份未檢測(cè)到病毒，樣本病毒檢出率為98.28%。檢測(cè)到病毒的400份樣本中，有95份被單一病毒侵染，單一病毒侵染率為23.34%，其余305份樣本分別被多種病毒侵染，復(fù)合侵染率為74.94%，明顯高于單一病毒侵染率，由此可知，復(fù)合侵染現(xiàn)象在田間普遍發(fā)生。復(fù)合侵染病毒種類為2、3、4種不等，侵染比例分別為47.17%、22.36%、5.41%，顯然，隨著復(fù)合侵染病毒種類的增多，復(fù)合侵染比例逐漸降低。

全省單一病毒侵染類型中CMV所占比例最高，為16.71%（表3），可見(jiàn)CMV是河南煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒。單一病毒侵染種類與數(shù)量在全省9個(gè)地區(qū)中均有差異（圖3），許昌地區(qū)分別檢測(cè)到CMV、TMV、PVY和TEV等4種病毒的單一病毒侵染;洛陽(yáng)、南陽(yáng)、平頂山、信陽(yáng)地區(qū)分別檢測(cè)到CMV和TMV兩種病毒的單一病毒侵染;三門峽地區(qū)分別檢測(cè)到CMV和PVY兩種病毒的單一病毒侵染;漯河地區(qū)分別檢測(cè)到CMV和TEV兩種病毒的單一病毒侵染;駐馬店地區(qū)僅檢測(cè)到CMV的單一病毒侵染;濟(jì)源地區(qū)僅檢測(cè)到TMV的單一病毒侵染;且全省除平頂山和濟(jì)源地區(qū)TMV所占比例最高外，其他產(chǎn)區(qū)均是CMV居最高。

所有復(fù)合病毒侵染類型中CMV+TMV所占比例最高（表3），為36.86%，其次分別為CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY，侵染比例均是7.62%。復(fù)合侵染類型與數(shù)量在產(chǎn)區(qū)間也表現(xiàn)不一（圖4），其中三門峽地區(qū)CMV+TEV+PVY復(fù)合侵染比例最高，而駐馬店則是CMV+TMV+TEV復(fù)合侵染居最多，其他地區(qū)CMV+TMV復(fù)合侵染比例最高。此外，TMV+PVY僅在洛陽(yáng)地區(qū)檢測(cè)到，而TMV+TEV+PVY也只在許昌地區(qū)檢測(cè)到。復(fù)合侵染類型最多的地區(qū)是許昌，多達(dá)8種，濟(jì)源復(fù)合侵染類型最少，僅2種，其他產(chǎn)區(qū)復(fù)合侵染類型4～6種，由此可知，復(fù)合侵染現(xiàn)象在田間表現(xiàn)較復(fù)雜。

3 ?討 ?論

本研究通過(guò)RT-PCR方法對(duì)河南煙區(qū)4種主要病毒TMV、CMV、PVY和TEV進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河南煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒是CMV。這與之前報(bào)道的CMV是河南煙區(qū)優(yōu)勢(shì)病毒[13-14]結(jié)果一致，不同于2018年TMV是河南煙區(qū)病毒病優(yōu)勢(shì)種的研究結(jié)果[3]，顯然同一煙區(qū)不同年度間病毒病的優(yōu)勢(shì)種可能發(fā)生變化[16]，該結(jié)論同樣在云南[2]、湖南[10]、陜西[17]等煙區(qū)得到證實(shí)。由于TMV經(jīng)機(jī)械傳播，煙草種植期間的農(nóng)事操作和日常管理會(huì)影響TMV的發(fā)生，而CMV、TEV、PVY經(jīng)蚜蟲(chóng)非持久性傳播，蚜蟲(chóng)發(fā)生時(shí)間、種群數(shù)量、環(huán)境因素等均可影響此類病毒的變化。優(yōu)勢(shì)病毒可能受到全球氣候變化、耕作制度變革、種植品種更替、日常農(nóng)事操作及傳播介體的發(fā)生量等諸多因素的影響。

本研究結(jié)果表明河南煙區(qū)復(fù)合病毒侵染廣泛發(fā)生，復(fù)合病毒侵染率達(dá)74.94%。之前的研究表明，湖南[10]、云南[9]、陜西[17]、重慶[18]及全國(guó)部分煙區(qū)[1]復(fù)合病毒侵染率均達(dá)到60%以上，可知復(fù)合病毒侵染成為主要的危害方式，推測(cè)原因一是長(zhǎng)期連作導(dǎo)致煙株養(yǎng)分吸收量持續(xù)降低，病蟲(chóng)害發(fā)生加重[19];二是生產(chǎn)上種植品種單一，且缺少抗病品種，從而加重病害的復(fù)合侵染[20]，三是很多病毒可通過(guò)農(nóng)事操作傳播，尤其是TMV極易接觸傳播，導(dǎo)致復(fù)合侵染加重。本研究表明河南煙區(qū)復(fù)合病毒侵染類型以CMV+TMV為主，該結(jié)果與之前酶聯(lián)免疫吸附法[3]檢測(cè)結(jié)果一致，同樣結(jié)果出現(xiàn)在重慶[18]及湖南[10]煙區(qū)。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合侵染病毒種類的增多，復(fù)合侵染比例逐漸降低，時(shí)洪偉等[18]、李金嶺等[17]、佟愛(ài)仔等[2]的研究中也可得出同樣結(jié)論，但青玲等[1]的研究中5種病毒復(fù)合侵染率大于其他2種以上病毒復(fù)合侵染率，具體原因還有待分析。

本研究還發(fā)現(xiàn)河南不同煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒種類及主要侵染類型均存在差異，可能原因一是檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到取樣時(shí)間及取樣地點(diǎn)的影響，二是不同地區(qū)間的種植品種、土壤類型、氣象因素、田間管理等因素的不同均可導(dǎo)致不同病毒病的發(fā)生[21-22]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)蚜傳病毒病CMV、TEV、PVY的發(fā)生總量明顯大于TMV病毒。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中防治病毒病時(shí)，除因地制宜防治優(yōu)勢(shì)病毒及主要侵染類型外，還應(yīng)兼顧其他病毒種類和復(fù)合侵染情況，更重要的是要突出治蟲(chóng)防病，切斷病毒病傳播途徑。本研究尚有7份疑似這4種病毒侵染的樣本未檢測(cè)到病毒，表明這些樣品中可能含有其他未檢測(cè)的病毒種類，因此還需對(duì)該部分樣品進(jìn)一步檢測(cè)。

4 ?結(jié) ?論

結(jié)果表明，2020年河南煙區(qū)407份煙草病毒病樣本的病毒檢出率為98.28%，其中，CMV是優(yōu)勢(shì)病毒。侵染類型中單一病毒侵染率為23.34%，多種病毒復(fù)合侵染率為74.94%，復(fù)合病毒侵染率遠(yuǎn)大于單一病毒侵染率，且隨著復(fù)合侵染病毒種類的增多，復(fù)合侵染比例逐漸降低。復(fù)合侵染類型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY侵染比例分別為36.86%、7.62%、7.62%。本研究同時(shí)明確了河南不同煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)病毒種類及侵染類型，為當(dāng)?shù)夭《静〉木珳?zhǔn)防治提供了理論依據(jù)。此外，本研究只檢測(cè)了TMV、CMV、PVY及TEV 4種病毒，尚有7份疑似表現(xiàn)病毒病癥狀的未檢出該4種病毒，應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證是否受到其他病毒侵染。

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