楊 柳，張欣雅，王 靜，王 怡，程汝陽(yáng)，李晨響，李 爽，趙世超，李建民

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人們飲食、運(yùn)動(dòng)等生活習(xí)慣的改變以及社會(huì)人口結(jié)構(gòu)的變化，糖尿病的發(fā)病率逐漸升高。糖尿病腎病(DN)作為糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一，已成為終末期腎臟病(ESRD)的首位病因，其發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)[1]。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(BPI3K/Akt)信號(hào)通路與糖尿病腎病患者因長(zhǎng)期高血糖引起促炎因子和氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加而引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)[2-3]。目前研究認(rèn)為黃芩素具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗血栓形成和保護(hù)肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等多種生物學(xué)作用[4]，對(duì)糖尿病腎病有一定的防治作用[5]。因此，本課題以體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象，探討黃芩素是否基于PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病發(fā)揮治療作用，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株 HK-2細(xì)胞株購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 黃芩素(成都曼思特生物，批號(hào)：DH0093，純度≥90%)；高糖：分析純葡萄糖粉溶于DMEM培養(yǎng)基；DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone，生產(chǎn)批號(hào)：NZM1301)，胎牛血清(Hyclone，生產(chǎn)批號(hào)：NYB0614)，胰酶(Hyclone，生產(chǎn)批號(hào)：021005)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：021005)，二甲基亞砜(DMSO，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20130716)，活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)分別為：S0033，20151208)，β-αctin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：16A00205)，磷酸化磷酸肌醇3-激酶(p-PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(博奧森生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為：AD06235847E，BST10C17B，GR251111-2)，二抗羊抗小鼠、二抗羊抗兔(博士德生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：BST10101A，BST10C17B)，SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)(生工生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B532956)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(HF90型，上海智城分析儀器公司)，倒置顯微鏡(IX-71-21PH型，日本Olympus)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(M×3000P型，美國(guó)Agilent Stratagene公司)，全自動(dòng)生化儀(MS-500A型，四川美生科技有限公司)，一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀(Smart chemi Ⅱ型，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技公司)，酶標(biāo)儀(MK3型，上海熱電儀器有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，將每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)[6]作為參考，選取1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黃芩素和4×10-2mol/L濃度高糖用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組：正常組只加入DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；高糖模型組在DMEM低糖培養(yǎng)基中加入4×10-2mol/L濃度高糖培養(yǎng)48 h；黃芩素低、中、高劑量組先分別加入1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黃芩素培養(yǎng)24 h后，再加入4×10-2mol/L濃度高糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1細(xì)胞存活率檢測(cè) 取一定量各組細(xì)胞，加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，再加入150 μL DMSO，放于搖床上震蕩使結(jié)晶溶解，于570 nm處測(cè)定吸光度OD值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每次2塊板，重復(fù)6次。

1.5.2細(xì)胞中ROS及MDA含量檢測(cè) 取一定量各組細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)ROS及MDA含量，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5.3細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè) 取一定量各組細(xì)胞，分別加入1 mL RNA裂解液、0.2 mL氯仿，離心，取上清液，加入0.5 mL異丙醇，離心，將沉淀加入DEPC水溶解，放入核酸濃度自動(dòng)測(cè)定儀中檢測(cè)RNA濃度。然后按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列：GAPDH上游為5’-GGTGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游為5’-CGTGGTTCACACCCATCACA-3’，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物大小200 bp；TNF-α 上游為5’-CTGCCCCGACTACGTGCTCCTCA-3’，下游為5’-AGTTGGTCCCCCTTCTCC-3’，退火溫度55 ℃，產(chǎn)物大小291 bp。PCR體系：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl 2 2.0 μL；10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL；cDNA 1.0 μL；上下游引物各0.2 μL；Taq酶0.1 μL；雙蒸水14.1 μL；總體系共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35個(gè)循環(huán)。最后，將其放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)灰度值，重復(fù)6次，結(jié)果以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)檢測(cè) 取一定量各組細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液提取蛋白(加入1%蛋白酶抑制劑)，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，提取的蛋白加入4×loading buffer，在100 ℃、10 min條件下發(fā)生變性，各取10 μL上樣，于聚丙烯酰胺凝膠上分離(100 V濃縮膠，120 V分離膠)并轉(zhuǎn)到膜上(10 V，30 min)，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶300)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次。次日加入二抗(1∶10 000)孵育2 h，TBST洗膜3次，取出膜，加入發(fā)光液于凝膠成像系統(tǒng)成像，測(cè)灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié) 果

2.1各組HK-2細(xì)胞存活率比較 正常組、高糖模型組及黃芩素低、中、高劑量組的HK-2細(xì)胞存活率OD值分別為0.538±0.053，0.304±0.026，0.399±0.042，0.451±0.041，0.493±0.073，高糖模型組明顯低于正常組(P<0.05)，黃芩素各組均明顯高于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性增高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2各組HK-2細(xì)胞中ROS和MDA含量比較 高糖模型組HK-2細(xì)胞中ROS和MDA含量均明顯高于正常組(P均<0.05)；黃芩素各組HK-2細(xì)胞中ROS和MDA含量均明顯低于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HK-2細(xì)胞中ROS和MDA含量比較

2.3各組HK-2細(xì)胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量比較 高糖模型組HK-2細(xì)胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)；黃芩素各組HK-2細(xì)胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量均明顯低于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1及表2。

圖1 各組HK-2細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)情況

表2 各組HK-2細(xì)胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為其與代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和遺傳等多個(gè)方面的因素相關(guān)[7-8]。在高糖狀態(tài)下，體內(nèi)可通過(guò)多種途徑發(fā)生氧化應(yīng)激，可產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基可使腎臟的脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量升高，可直接或間接導(dǎo)致腎臟損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組HK-2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中ROS、MDA含量明顯升高，證實(shí)高糖刺激可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ROS也可作為第二信使激活PI3K/Akt信號(hào)通路，誘發(fā)糖尿病腎病患者腎臟損傷[10]。此外，炎癥反應(yīng)一直是糖尿病腎病患者腎臟損傷的一個(gè)重要原因，而炎癥因子分泌失調(diào)與PI3K/Akt信號(hào)通路可能也存在一定的聯(lián)系[11]。Zhang等[12]和Ma等[13]研究報(bào)道，糖尿病腎病患者PI3K/Akt通路被磷酸化，伴隨促炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6) 的分泌增多，表明炎癥因子的分泌與釋放可能與PI3K/Akt存在某種潛在聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組HK-2細(xì)胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量均較正常組明顯增高，證實(shí)高糖刺激可激活PI3K/Akt通路，使炎癥因子TNF-α分泌增加。

黃芩素屬于黃酮類化合物，存在于黃芩、杜仲等中藥中。黃芩素具有多種藥理活性，可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗凋亡等多種機(jī)制對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芩素對(duì)糖尿病腎病有一定的防治作用，其可能通過(guò)清除體內(nèi)的自由基和抑制腎臟內(nèi)炎癥介質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而減輕腎臟損傷，保護(hù)腎臟[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩素各組HK-2細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞中ROS、MDA含量及TNF-α mRNA和p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達(dá)量均較模型組明顯降低，提示黃芩素不僅可抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化來(lái)減少炎癥因子產(chǎn)生，從而有效保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，為黃芩素用于糖尿病腎病的治療提供了一定理論支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。