曾 梅，孫 晶，范 蓓，劉 聰,3，李 燦，劉湘丹,4,5，王鳳忠*,周日寶,4,5*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；5.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

中藥材虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根及根莖，屬多年生草本[1]，我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于江蘇、江西、四川、湖南等地[2]。虎杖性寒、味苦，歸肝、肺、膽經(jīng)，主要含有蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)等化合物[3-5]，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。臨床用于治療風(fēng)濕痹痛、痰多咳嗽、跌打損傷等癥[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，虎杖藥材質(zhì)量的相關(guān)研究大多數(shù)僅以不同產(chǎn)地作為研究點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行不同采收時(shí)間、生長(zhǎng)年限、土壤類(lèi)型、產(chǎn)地環(huán)境虎杖藥材質(zhì)量的研究未見(jiàn)報(bào)道。筆者廣泛收集了不同采收時(shí)間、不同生長(zhǎng)年限、不同土壤類(lèi)型、不同產(chǎn)地環(huán)境等多種類(lèi)型的虎杖藥材樣品，利用高效液相色譜法建立虎杖指紋圖譜，以期為中藥材虎杖的質(zhì)量控制及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用虎杖資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[7]。

1 材料

1.1 儀器

SK8200 型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限 公 司）；Agilent Technologies 1260 Inginity 型 高 效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BCD-452 WDPF 型冰箱（青島海爾服務(wù)有限公司）；Eco-S15型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；ME204E/02 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）公司］；YF-500 型高速中草藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試劑與藥材

甲醇（分析純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；磷酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；虎杖苷?duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：B20533），白藜蘆醇對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：B20044），蒽苷B 對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：B20241），大黃素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：B20241），大黃素甲醚對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)：B20242）均購(gòu)于上海源葉有限公司。

課題組于2018 年和2019 年分別從不同產(chǎn)地收集了18 批虎杖藥材樣品，樣品由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室周日寶教授鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和根莖，具體信息見(jiàn)表1。

表1 虎杖樣品信息表Tab.1 Sample information table of Polygonum cuspidatum

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%磷酸水溶液（B），按照以下色譜條件洗脫：0 ～ 10 min，80%→73%；10 ～ 18 min，73%→65%；18 ～ 24 min，65%→55%；24 ～ 34 min，55%→5%；34 ～ 40 min，5%→80%；流速：1.0 mL/min；色譜柱溫度：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：287 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取虎杖苷0.026 0 g、白藜蘆醇0.003 8 g、大黃素0.005 0 g、大黃素甲醚0.022 0 g、蒽苷B 0.003 2 g、置于10 mL 容量瓶中，再精密加入80%甲醇溶解，定容，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，密封保存于4 ℃避光處，備用。

2.3 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取虎杖樣品細(xì)粉（過(guò)6 號(hào)篩）0.500 0 g，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，進(jìn)行稱(chēng)重，超聲（20 KHz、25℃）30 min后取出再稱(chēng)重，如重量減失，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)過(guò)濾后取適量續(xù)濾液，再用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S18 號(hào)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，以虎杖苷作為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.64 %，相對(duì)峰面積RSD 均小于1.20%，說(shuō)明儀器有較好的精密度。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S18 號(hào)樣品6 份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以虎杖苷為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.38%，相對(duì)峰面積RSD 均小于1.80%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S18 號(hào)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別于0、2、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，以虎杖苷為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.38%，相對(duì)峰面積RSD 均小于2.00%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 不同來(lái)源虎杖圖譜 按照“2.3”項(xiàng)下方法，取表1 中的各批虎杖樣品制備成供試品溶液，并且按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣。接著采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”對(duì)各樣品的HPLC 色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，并計(jì)算相似度。軟件計(jì)算得出，18 批不同來(lái)源虎杖樣品，共檢測(cè)到55 個(gè)色譜峰，確定了其中10 個(gè)峰為共有峰，占總峰面積的85.41%，18批虎杖指紋圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 不同來(lái)源虎杖HPLC 指紋譜圖Fig.1 HPLC fingerprint spectra of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.2 參照峰選擇 與對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)后，指認(rèn)了五種成分，分別為2 號(hào)峰（虎杖苷）、5 號(hào)峰（白藜蘆醇）、6 號(hào)峰（蒽苷B）、8 號(hào)峰（大黃素）、10 號(hào)峰（大黃素甲醚）。其中，虎杖苷為二苯乙烯類(lèi)化合物，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張血管、溶血栓、抑制血小板凝集和改善血液循環(huán)、抗菌、抗休克等作用[8-11]，且在各批虎杖樣品中分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大且為所有樣品共有，故確定虎杖苷為參照峰（S），虎杖對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖2。

2.5.3 相似度評(píng)價(jià) 將18 批虎杖藥材指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件，按照“2.5.1”項(xiàng)下方法分析，計(jì)算樣品與對(duì)照?qǐng)D譜R 的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，18 批虎杖樣品相似度為0.941 ～ 0.999，表明18 批虎杖樣品化學(xué)成分相似性較高。計(jì)算各批虎杖樣品的共有峰峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD，結(jié)果見(jiàn)表3，由結(jié)果可以得出各批樣品質(zhì)量具有較大差異。

表2 不同來(lái)源虎杖相似度計(jì)算結(jié)果Tab.2 Similarity calculation results of Polygonum cuspidatum from different sources

表3 不同來(lái)源虎杖共有峰平均相對(duì)保留時(shí)間及峰面積Tab.3 Average relative retention time and peak area of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.4 聚類(lèi)分析 以各共有峰的峰面積為變量，以歐氏距離為測(cè)度，采用IBM SPSS Statistics 軟件以組間聯(lián)接法對(duì)不同來(lái)源虎杖進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，從閾值5 處，18 批不同虎杖樣品可聚為6 類(lèi)：S18 為一類(lèi)；S15、S12、S14、S16 為一類(lèi)；S13 為一類(lèi)；S4、S11、S9 為一類(lèi)；S1、S2、S3 為一類(lèi)；S5、S8、S6、S7、S17、S10 為一類(lèi)。

圖3 不同來(lái)源虎杖聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.3 Cluster analysis tree of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.5 主成分分析 主成分分析（PCA）是指為了達(dá)到簡(jiǎn)化分析的目的，在盡量保持原有信息的條件下，將個(gè)數(shù)比較多且存在相關(guān)性的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成個(gè)數(shù)較少且彼此獨(dú)立或不相關(guān)的綜合性指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)將18 批不同來(lái)源虎杖樣品的10 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 軟件，對(duì)共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析，特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果見(jiàn)表4，旋轉(zhuǎn)變化后的成分矩陣見(jiàn)表5，應(yīng)用IBM SPSS 軟件進(jìn)行主成分分析后數(shù)據(jù)窗口最后列出3 個(gè)主成分的因子得分值再計(jì)算綜合得分，根據(jù)綜合得分情況對(duì)18 批虎杖藥材進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表6，排名越靠前說(shuō)明虎杖質(zhì)量越好。

表4 虎杖PCA 的特征值與貢獻(xiàn)率結(jié)果Tab.4 Characteristic values and contribution rate of PCA of Polygonum cuspidatum

表5 虎杖PCA 成分矩陣Tab.5 PCA component matrix of Polygonum cuspidatum

表6 18 批虎杖主成分得分及排名Tab.6 Principal component scores and ranking of 18 batches of Polygonum cuspidatum

由表4 可知前面三個(gè)主成分的特征值均大于1，且累計(jì)貢獻(xiàn)率為78.971%，表明前三個(gè)主成分可以代表所有成分進(jìn)行分析，從表5 可以看出，第一主成分主要來(lái)自1、2、3、4、6、8、10 號(hào)峰，第二主成分主要來(lái)自于5、9 號(hào)峰，第三主成分主要來(lái)自于7 號(hào)峰。經(jīng)查閱數(shù)據(jù)及與對(duì)照品對(duì)照，第一主成分為虎杖苷、蒽苷B、大黃素、大黃素甲醚，第二主成分為白藜蘆醇。表明虎杖苷、白藜蘆醇在特征變量的重要性評(píng)估中具有優(yōu)勢(shì)，主成分分析綜合排序結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果相類(lèi)似，進(jìn)一步證實(shí)該分析方法可用于藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

3 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同比例（50%、80%、100%）甲醇、不同提取時(shí)間（15、30、45、60 min）、不同提取方法（超聲、回流、浸漬）的供試品制備對(duì)比研究，研究發(fā)現(xiàn)，80%甲醇超聲提取30 min，供試品色譜峰面積較大、分離度較好，且實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較低，故本研究采用80%甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min進(jìn)行供試品提取。

采用了UV 檢測(cè)器對(duì)虎杖供試品溶液進(jìn)行200 ～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)虎杖苷和白藜蘆醇在310 nm左右有最大吸收，大黃素、大黃素甲醚、蒽苷B 在287 nm 處有最大吸收，且指紋圖譜色譜峰較多，峰形及分離度較好，綜合考慮確定最佳掃描波長(zhǎng)為287 nm。

在HPLC指紋圖譜中，不同來(lái)源虎杖相似度0.941 ～0.999，表明不同來(lái)源的虎杖化學(xué)成分無(wú)顯著差異；結(jié)合各共有峰峰面積RSD 結(jié)果及聚類(lèi)分析、主成分分析結(jié)果得出不同來(lái)源虎杖質(zhì)量有明顯差異；結(jié)合聚類(lèi)分析結(jié)果，主成分綜合得分情況排名前三的樣品被聚為一類(lèi)，包括在8 月至9 月之間采收的三批耕地種植的三年生虎杖，進(jìn)一步說(shuō)明了這三批藥材的質(zhì)量最佳。提示在虎杖栽培中，為提高產(chǎn)量可選擇耕地栽種三年，虎杖采挖時(shí)間應(yīng)選擇8 月至9 月這一時(shí)間段。

4 結(jié)論

本研究建立了不同來(lái)源虎杖藥材HPLC 指紋圖譜分析方法，結(jié)合相似度計(jì)算、聚類(lèi)分析、主成分分析三種分析方法進(jìn)行不同來(lái)源虎杖中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)分析，所建HPLC 指紋圖譜可用于綜合評(píng)價(jià)不同來(lái)源虎杖質(zhì)量，可為虎杖藥材的質(zhì)量控制提供參考。