李素 臧明伍 趙冰 張順亮 王守偉 朱寧 潘曉倩 劉夢(mèng) 吳倩蓉 劉博文

摘 要：為研究羊肉氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）氧化穩(wěn)定性，以羊肉肌紅蛋白（myoglobin，Mb）制備OxyMb，并模擬OxyMb自動(dòng)氧化變性條件，研究NaCl、pH值、溫度和牛至、留蘭香、竹葉提取物對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：隨著NaCl質(zhì)量濃度的增大，OxyMb相對(duì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在1.5 g/100 mL質(zhì)量濃度時(shí)最高，為67.07%;OxyMb在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性高于酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性;在4～30 ℃范圍內(nèi)，OxyMb可以保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，OxyMb相對(duì)含量明顯下降，高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量開(kāi)始上升;留蘭香提取物和竹葉提取物有利于維持羊肉OxyMb的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：氧合肌紅蛋白;高鐵肌紅蛋白;穩(wěn)定性;牛至提取物;留蘭香提取物;竹葉提取物;抗氧化

Effects of Physical and Chemical Factors and Oregano， Magnolia， Bamboo Leaf Extracts on the Stability of

Mutton Myoglobin

LI Su， ZANG Mingwu*， ZHAO Bing， ZHANG Shunliang， WANG Shouwei*， ZHU Ning，?PAN Xiaoqian， LIU Meng， WU Qianrong， LIU Bowen

（China Meat Food Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： In order to study the oxidative stability of mutton oxymyoglobin （OxyMb）， OxyMb was prepared from mutton myoglobin （Mb）. The effects of NaCl， pH value， temperature and plant extracts on the stability of OxyMb were investigated under conditions simulating auto-oxidation of OxyMb. Results showed that the relative content of OxyMb increased at first and then decreased with increasing NaCl concentration， reaching the highest value of 67.07% at 1.5 g/100 mL. The stability of OxyMb in alkaline environment was higher than that in acidic environment. OxyMb could remain relatively stable in the temperature range of 4–30 ℃. The relative content of OxyMb decreased significantly when the temperature were higher than 35 ℃， while the relative content of metmyoglobin increased. Magnolia extract and bamboo leaf extract could improve the stability of mutton OxyMb.

Keywords： oxymyoglobin; metmyoglobin; stability; oregano extracts; magnolia extracts;? bamboo leaf extracts; antioxidant

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211109-225

中圖分類號(hào)：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2022）02-0015-06

引文格式：

李素， 臧明伍， 趙冰， 等. 理化因素和牛至、留蘭香、竹葉提取物對(duì)羊肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響[J]. 肉類研究， 2022， 36（2）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211109-225.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LI Su， ZANG Mingwu， ZHAO Bing， et al. Effects of physical and chemical factors and oregano， magnolia， bamboo leaf extracts on the stability of mutton myoglobin[J]. Meat Research， 2022， 36（2）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211109-225.? ??http：//www.rlyj.net.cn

生物化學(xué)或微生物因素引起的產(chǎn)品變質(zhì)是肉品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題，由生物化學(xué)變化引起的肉類變質(zhì)最常見(jiàn)的形式是脂質(zhì)和含血紅素蛋白質(zhì)的氧化[1]。氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肉類產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)地和顏色發(fā)生變化，而色澤是影響消費(fèi)者接受度的最直觀指標(biāo)。在充分放血的肌肉中，肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是影響肉色的重要因素，因此，維持Mb的穩(wěn)定性有助于提升肉類產(chǎn)品的色澤品質(zhì)。Mb穩(wěn)定性與溫度、pH值、氧分壓、鹽離子等有重要關(guān)

系[2-4]，脂肪氧化的中間產(chǎn)物也可以促進(jìn)Mb的氧化[5-6]。為抑制肉品發(fā)生氧化反應(yīng)，通常在加工過(guò)程中使用抗氧化劑。近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)綠色健康食品的需求日益增加，許多消費(fèi)者對(duì)化學(xué)合成食品添加劑持有一定排斥態(tài)度，認(rèn)為它們不健康或不安全[7]，這一發(fā)展趨勢(shì)促使替代或減少傳統(tǒng)化學(xué)合成食品添加劑使用的技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。植物提取物具有一定的抑菌和抗氧化能力，可抑制不良微生物的生長(zhǎng)，減少脂肪氧化，延緩肉制品品質(zhì)劣變[8-9]。

目前，植物提取物的應(yīng)用方式主要為將其加入產(chǎn)品中、涂在產(chǎn)品表面，或加入到包裝材料中[10-12]。羊肉是我國(guó)重要的畜產(chǎn)品，目前對(duì)冷鮮羊肉外觀色澤穩(wěn)定性的研究較多[13]，辛建增等[14]研究3-磷酸甘油醛對(duì)羊肉色澤穩(wěn)定性和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）還原的影響，但仍缺少對(duì)羊肉中Mb穩(wěn)定性機(jī)理研究的報(bào)道，尤其是植物提取物對(duì)Mb穩(wěn)定性的研究。

氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）可使動(dòng)物肌肉保持鮮紅的色澤，但易發(fā)生氧化反應(yīng)生成MetMb，從而影響肌肉色澤。為研究羊肉Mb變化引起的色澤劣變機(jī)理，本研究從羊肉中提取Mb，并制備OxyMb，通過(guò)氧化模型分析NaCl、pH值、溫度和牛至、留蘭香、竹葉提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響，為實(shí)際羊肉產(chǎn)品生產(chǎn)加工時(shí)色澤劣變控制機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊后腿肉購(gòu)于市場(chǎng)。

連二亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;留蘭香提取物、牛至提取物 建明工業(yè)（珠海）有限公司;竹葉提取物? ?浙江圣世生物科技有限公司;NaCl（食品級(jí)） 美添前景科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA822-CW天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;05P-22離心機(jī) 日本日立公司;M2e多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)MD公司。

1.3 方法

1.3.1 Mb提取和OxyMb制備

參考孫沖等[15]的方法提取Mb并制備OxyMb，對(duì)方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。取適量絞碎的瘦肉，加入3 倍體積預(yù)冷的緩沖液（10 mmol /L Tris-HCl，pH 8.5），于13 000 r/min下勻漿2 min，離心（4 ℃、10 000×g、15 min）后取清液，置于飽和度65%的硫酸銨溶液中鹽析1 h;上清液再次離心（4 ℃、10 000×g、15 min），取濾液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。調(diào)整Mb溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL，取5 mL Mb溶液與50 mg連二亞硫酸鈉反應(yīng)得OxyMb。用10 倍體積預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）透析20 次，除去多余的連二亞硫酸鈉。將透析后的OxyMb質(zhì)量濃度調(diào)至0.2 mg/mL，以緩沖溶液作空白，根據(jù)Krzywicki[16]的方法測(cè)定透析后的OxyMb溶液在572、565、545、525 nm波長(zhǎng)處的吸光度，總Mb含量和OxyMb、MetMb相對(duì)含量分別按式（1）～（3）計(jì)算。

總Mb含量/（mg/g）=-0.166A572 nm+0.086A565 nm+0.088A545 nm+0.099A525 nm （1）

OxyMb相對(duì)含量/%=（0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361）×100 （2）

MetMb相對(duì)含量/%=（-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098）×100 （3）

式中：R1、R2和R3分別為A572 nm/A525 nm、A565 nm/A525 nm和A545 nm/A525 nm。

1.3.2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0～6 g/100 mL的等差質(zhì)量濃度（0.5 g/100 mL）梯度NaCl溶液，于室溫靜置15 min，取樣測(cè)定其525、545、565、572 nm波長(zhǎng)處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對(duì)含量，平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.3 pH值對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

取0.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于10 mL離心管中，加入pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液7.5 mL，于4 ℃條件下孵育6 h，取樣測(cè)定其525、545、565、572 nm波長(zhǎng)處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對(duì)含量，平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.4 溫度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別于4 ℃冰箱和10～100 ℃的等差溫度（5 ℃）梯度水浴中靜置15 min，然后將樣品取出，迅速冰水浴冷卻，取樣測(cè)定525、545、565、572 nm波長(zhǎng)處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對(duì)含量，平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.5 牛至、留蘭香、竹葉提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

取1.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0.5 mL質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/100 mL的竹葉提取物、留蘭香提取物、牛至提取物作為抗氧化物，于4 ℃靜置0、2、4、6、8、10、12、14、16 d后取出測(cè)定吸光度，計(jì)算OxyMb和MetMb相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增大，OxyMb相對(duì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在1.5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大，為67.07%，說(shuō)明1.5 g/100 mL質(zhì)量濃度的NaCl溶液中OxyMb的穩(wěn)定性較好。而MetMb相對(duì)含量沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明MetMb受NaCl的影響不大。向丹[17]在不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)豬Mb穩(wěn)定性影響研究中發(fā)現(xiàn)，MetMb含量也較為穩(wěn)定，與本研究結(jié)果一致，但在3 g/100 mL的NaCl溶液中OxyMb含量最高。NaCl可以通過(guò)降低Mb對(duì)氧的親和性，促進(jìn)OxyMb自動(dòng)氧化為MetMb，研究結(jié)果的差異可能是由于Mb來(lái)源不同，對(duì)氧的親和度也不同，從而使得OxyMb在鹽溶液中的穩(wěn)定性有差異。

2.2 pH值對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，隨著pH值從酸性至堿性變化，OxyMb相對(duì)含量呈逐漸上升趨勢(shì)，MetMb相對(duì)含量呈逐漸降低趨勢(shì)。在低pH值（4.2～5.0）時(shí)OxyMb相對(duì)含量上升緩慢，pH 5.0～7.0時(shí)，OxyMb相對(duì)含量明顯上升，pH 7.0～8.5時(shí)，OxyMb相對(duì)含量變化不明顯。MetMb在pH 4.5環(huán)境中生成量最高，但隨pH值升高其相對(duì)含量大幅降低，說(shuō)明在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，當(dāng)pH值升至7.0時(shí)逐漸穩(wěn)定，pH>7.0時(shí)MetMb相對(duì)含量緩慢降低，說(shuō)明其穩(wěn)定性在堿性環(huán)境中高于酸性環(huán)境中。陳景宜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，低pH值會(huì)增加牛Mb自動(dòng)氧化的速率，該變化規(guī)律與本研究趨勢(shì)一致，即低pH值環(huán)境不利于色澤的穩(wěn)定，這可能是由于低pH值可降低Mb中血紅素與珠蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而加速氧化[19]。

2.3 溫度對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，OxyMb相對(duì)含量呈逐漸降低的趨勢(shì)。在4～30 ℃范圍內(nèi)，OxyMb相對(duì)含量變化不明顯;當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，OxyMb相對(duì)含量明顯下降，表明OxyMb的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，蛋白變性加劇;當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，OxyMb相對(duì)含量幾乎為零。而MetMb相對(duì)含量隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在4～30 ℃范圍內(nèi)，MetMb相對(duì)含量上升緩慢;當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，MetMb相對(duì)含量顯著增加（P<0.05），表明OxyMb氧化劇烈;當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，MetMb相對(duì)含量急劇下降，與OxyMb的變化一致，說(shuō)明Mb完全變性。Sen等[20]研究羊排中Mb穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高（51、65、71、79 ℃）可溶性Mb相對(duì)含量降低，而Mb變性比率相應(yīng)增加。在牛肉Mb的穩(wěn)定性研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[21]。但也有研究表明，Mb在肌肉中的熱穩(wěn)定性比在與肌肉相同pH值和離子強(qiáng)度的溶液中的熱穩(wěn)定性低得多[22]，因此，在實(shí)際生產(chǎn)加工過(guò)程中需要從多方面綜合考慮，以提升Mb的穩(wěn)定性。

2.4 牛至、留蘭香、竹葉提取物對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

2.4.1 牛至提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著牛至提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對(duì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在2 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大。但1～3 mg/100 mL組的OxyMb相對(duì)含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而4～5 mg/100mL組的OxyMb相對(duì)含量明顯低于對(duì)照組。在貯藏15 d時(shí)，各組的OxyMb相對(duì)含量為6.7%～11.6%，MetMb相對(duì)含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，說(shuō)明牛至提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的保護(hù)作用不穩(wěn)定，不適宜的添加量甚至?xí)龠M(jìn)羊肉OxyMb的氧化。有研究表明，香芹酚、對(duì)傘花烴、γ-松油烯和百里香酚是牛至提取物中發(fā)揮抗氧化作用的主要化合物，可通過(guò)向自由基提供電子，或阻斷氧化過(guò)程中的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等途徑起到延緩肉制品中脂肪氧化的作用[23-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛至提取物在單一模擬體系下對(duì)維持羊肉OxyMb穩(wěn)定性方面無(wú)明顯效果。

2.4.2 留蘭香提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

留蘭香提取物中含有一定含量的酚類和黃酮類物質(zhì)，使其具有抗菌和抗氧化作用[26-27]。由圖5可知，隨著留蘭香提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對(duì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在4 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大，且添加留蘭香提取物的樣品中OxyMb相對(duì)含量均高于對(duì)照組。在前6 d的貯藏過(guò)程中，不同組之間OxyMb和MetMb相對(duì)含量的差異不明顯，貯藏后期，4 mg/100 mL組的樣品中OxyMb相對(duì)含量明顯高于其他組，在貯藏15 d時(shí)仍保持在23.8%左右。MetMb相對(duì)含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，充分說(shuō)明留蘭香提取物對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性的保護(hù)作用較好。留蘭香提取物在肉制品中的應(yīng)用機(jī)理研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，留蘭香提取物可提升羊肉OxyMb在模擬體系中的穩(wěn)定性。

竹葉提取物是從竹葉中提取的天然食品抗氧化劑，在食品中應(yīng)用較為廣泛，大量研究表明，竹葉提取物具有較好的抗氧化和抑菌作用，其有效成分主要為黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物[28-30]。由圖6可知，隨著竹葉提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對(duì)含量呈逐漸增大的趨勢(shì)，在5 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大，且在整個(gè)貯藏過(guò)程中，1～5 mg/100 mL組的OxyMb相對(duì)含量均明顯高于對(duì)照組。在貯藏8 d時(shí)，1 mg/100 mL組OxyMb相對(duì)含量明顯降低，與對(duì)照組無(wú)明顯差異，貯藏至15 d時(shí)，2～5 mg/100 mL組的OxyMb相對(duì)含量為19.3%～22.5%，均高于1 mg/100 mL組和對(duì)照組貯藏13 d時(shí)的OxyMb相對(duì)含量。MetMb相對(duì)含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，在貯藏終點(diǎn)，對(duì)照組MetMb相對(duì)含量最高。說(shuō)明在該模擬體系中，竹葉提取物對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性具有較好的提升作用。

選用的植物提取物均含有抑菌、抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)肉類的脂肪和蛋白質(zhì)具有一定的抗氧化作用，不同活性物質(zhì)對(duì)脂肪或蛋白質(zhì)氧化抑制作用機(jī)理不同。目前，比較認(rèn)可的植物活性物質(zhì)抗氧化作用機(jī)理主要有直接清除自由基、螯合金屬離子，或本身被氧化成自由基中間體，抑制自由基對(duì)脂肪或蛋白質(zhì)的氧化等[31]。本研究OxyMb氧化模擬體系中，不同植物提取物對(duì)OxyMb抗氧化效果不同，可能是由于抗氧化活性物質(zhì)所含有的如酚羥基等極性基團(tuán)與模擬體系中的氧氣相結(jié)合，減少了OxyMb與氧氣的接觸量，從而延緩了蛋白的氧化速率，提升了OxyMb穩(wěn)定性。不同植物提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性影響差異性可能與所含有效活性物質(zhì)種類不同有關(guān)。

3 結(jié) 論

通過(guò)采用羊肉Mb制備OxyMb，并對(duì)其理化穩(wěn)定性條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：1.5 g/100 mL的NaCl溶液可以提高OxyMb穩(wěn)定性，而不同質(zhì)量濃度NaCl溶液對(duì)MetMb相對(duì)含量影響較小;pH值對(duì)OxyMb穩(wěn)定性具有明顯影響，堿性環(huán)境下OxyMb穩(wěn)定性較好，酸性環(huán)境不利于OxyMb的穩(wěn)定性;高溫可促使OxyMb發(fā)生氧化變性反應(yīng)，當(dāng)加熱溫度低于30 ℃時(shí)Mb穩(wěn)定性較好，隨加熱溫度繼續(xù)升高，OxyMb相對(duì)含量明顯降低，MetMb開(kāi)始大量形成。選用牛至提取物、留蘭香提取物和竹葉提取物，分析其對(duì)OxyMb穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，OxyMb相對(duì)含量呈逐漸降低趨勢(shì)，MetMb相對(duì)含量呈逐漸增大的趨勢(shì)，說(shuō)明Mb在貯藏過(guò)程中不斷地發(fā)生氧化反應(yīng)。所選用的3 種植物提取物對(duì)羊肉OxyMb穩(wěn)定性具有一定保護(hù)作用，其中，留蘭香提取物和竹葉提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性保護(hù)效果較好，而牛至提取物對(duì)OxyMb穩(wěn)定性無(wú)明顯提升作用，不適宜的添加量甚至?xí)龠M(jìn)OxyMb的氧化。肉及肉制品組成基質(zhì)較為復(fù)雜，由羊肉Mb引起的色澤品質(zhì)變化也受多方面因素影響，因此，在后續(xù)工作中對(duì)各理化因素和植物提取物對(duì)羊肉色澤品質(zhì)影響機(jī)理研究將引入更多模擬條件。

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收稿日期：2021-11-09

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020BBF02011-01）

第一作者簡(jiǎn)介：李素（1988—）（ORCID： 0000-0001-5377-653X），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称樊a(chǎn)品與技術(shù)開(kāi)發(fā)。

E-mail： lisu523@126.com

通信作者簡(jiǎn)介：臧明伍（1981—）（ORCID： 0000-0002-1302-316X），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與食品安全。E-mail： zangmw@126.com

王守偉（1961—）（ORCID： 0000-0002-6390-4803），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槿忸愂称房茖W(xué)與食品安全。E-mail： cmrcwsw@126.com