王文婷，張 妍，李海明，袁 翔，肖慧敏

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

0 引言

秋葵屬錦葵科，雙子葉植物，是一種一年生(熱帶多年生)的草本植物，是菜藥兩用植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，并且具有一定的保健功能．研究表明，黃秋葵花中黃酮類化合物的含量是大豆葉子的300倍[1]．黃酮類化合物可以被人體很快吸收，吸收以后通過(guò)人體的腦血屏障進(jìn)入脂肪組織，可以防止人類血管動(dòng)脈粥樣硬化從而保護(hù)血管，也可以疏通體內(nèi)血液循環(huán)、提高視力、活躍大腦細(xì)胞以及人體內(nèi)其他臟器細(xì)胞等，同時(shí)還具有抵抗人體衰老、抵抗疲勞、降低血脂血壓、防止脂肪氧化以及治療燒傷燙傷等功能[2-4]．其中，抗衰老的作用機(jī)制主要和黃酮類化合物的抗氧化活性有關(guān)．因?yàn)榇蠖鄶?shù)黃酮類化合物中的羥基和羰基可以阻止體內(nèi)自由基的產(chǎn)生或清除體內(nèi)自由基，從而避免體內(nèi)的氧化損傷，具有極強(qiáng)的抗氧化活性[5]．

目前，對(duì)黃秋葵花中總黃酮的提取方法和它的抗氧化活性的研究報(bào)道較少．黃酮類化合物的提取方法主要有堿性水或堿性稀醇提取法、水提法、有機(jī)溶劑提取法等，但這些方法往往存在試劑消耗量大、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題[6-7]．因此，本試驗(yàn)采用超聲波提取法探究黃秋葵花總黃酮的提取工藝，為提高黃秋葵花的綜合開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

黃秋葵花(亳州市匯東生物科技有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；NaNO2、NaOH(南京化學(xué)試劑股份有限公司)；CH3CH2OH(安徽安特食品股份有限公司)．

1.2 主要儀器和設(shè)備

電子分析天平(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司，PRACTUM124-1CN)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海丙林電子科技有限公司，DHG-3S)；臺(tái)式多用途高速離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司，JIDI-16D)；高速搖擺式粉碎機(jī)(浙江超群機(jī)械設(shè)備有限公司，CQF-4D)；數(shù)控超聲波儀(廣州昊昕科技有限公司，KQ5200DB)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(聚創(chuàng)華業(yè)儀器有限公司，UV-759)．

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考董丹等[6]的方法，測(cè)定并制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=6.6619x-0.0161，R2=0.9991．

1.3.2 黃秋葵花總黃酮的提取

干燥的黃秋葵花粉碎后過(guò)80目篩，稱取適量黃秋葵花粉末于帶塞的錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，混合搖勻后置于超聲波儀中，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，提取后轉(zhuǎn)移至離心管，以5 000 r/min離心10 min，最后取上清液，備用[8-10]．

1.3.3 黃秋葵花總黃酮的測(cè)定

采用硝酸化鋁法，在1.3.2提取出的上清液中加5%的NaNO2溶液，混勻，5 min后加入10%的Al(NO3)3溶液，同樣混勻，6 min后加4%的NaOH溶液，最后用40%的乙醇溶液定容，放置15 min后測(cè)定其吸光度值．再由1.3.1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃秋葵花樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，由式(1)計(jì)算出黃秋葵花總黃酮的提取率[10-11]．

(1)

式中：c為黃秋葵花樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為黃秋葵花總黃酮提取液的定容體積，mL；d為黃秋葵花樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為黃秋葵花樣品質(zhì)量，g．

1.3.4 黃秋葵花總黃酮提取單因素試驗(yàn)

(1)乙醇濃度對(duì)提取黃秋葵花總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，分別加20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液160 mL，然后在超聲波50 ℃溫度下提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同乙醇濃度下黃秋葵花總黃酮的提取率，研究提取過(guò)程中不同的乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響．

(2)超聲溫度對(duì)提取黃秋葵花總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，加入160 mL 50%的乙醇溶液，用30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃超聲波分別提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同溫度下黃秋葵花總黃酮的提取率，分析提取過(guò)程中不同的超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響．

(3)超聲時(shí)間對(duì)提取黃秋葵花總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，加入50%的乙醇溶液160 mL，在60 ℃下分別用超聲波提取10 min、20 min、30 min、40 mim、50 min、60 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法,在不同時(shí)間下提取黃秋葵花總黃酮，繪制超聲時(shí)間-提取率曲線，探究提取過(guò)程中不同的超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響．

(4)料液比對(duì)提取黃秋葵花總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g黃秋葵花粉末，在提取時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃的條件下，加入一定量的50%乙醇溶液，將料液比(g/mL)設(shè)定為1∶120、1∶140、1∶160、1∶180、1∶200、1∶220，提取黃秋葵花中的總黃酮．按照1.3.2和1.3.3中的方法，得到不同料液比下黃秋葵花總黃酮的提取率，考察提取過(guò)程中不同的料液比對(duì)總黃酮提取率的影響．

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)超聲波提取黃秋葵花總黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平表如表1，進(jìn)行黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn).

表1 四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同乙醇濃度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖1所示.隨著超聲波提取黃秋葵花總黃酮時(shí)的乙醇濃度的增加，提取率先增加后減少，最高為8.54%．這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)乙醇濃度的增加，溶質(zhì)溶出量趨向緩慢飽和，乙醇濃度越大，其極性相對(duì)降低，對(duì)提取物的作用也越小，且會(huì)有其他物質(zhì)溶出[12]．因此，黃秋葵花總黃酮提取時(shí)應(yīng)選取的最佳乙醇濃度為50%．

圖1 乙醇濃度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

2.1.2 不同超聲溫度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同超聲溫度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖2所示.隨著超聲溫度的升高，黃秋葵花總黃酮的提取率先增加后略微下降，在60 ℃達(dá)到最高值，為7.13%．可能是因?yàn)殚_(kāi)始時(shí)溫度升高能夠加快黃酮類物質(zhì)的溶出，但溫度太高，會(huì)破壞黃酮的穩(wěn)定性[13]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時(shí)應(yīng)選取的最佳超聲溫度為60 ℃．

2.1.3 不同超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖3所示.隨著超聲時(shí)間的增加，黃秋葵花總黃酮的提取率先上升后下降，30 min時(shí)達(dá)到最高提取率，為7.28%．

圖2 超聲溫度對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的增加，熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)也在逐漸加強(qiáng)，從而破壞提取出的黃秋葵花總黃酮的結(jié)構(gòu)，隨之其提取率有所下降[9]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時(shí)應(yīng)選取的最佳超聲時(shí)間為30 min．

2.1.4 不同料液比對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

不同料液比對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響如圖4所示.隨著提取劑的增加，黃秋葵花總黃酮的提取率呈先增加后減少的趨勢(shì)，料液比(g/mL)為1∶180時(shí)達(dá)到最高值8.72%．提取劑量過(guò)大造成提取率有所下降，一方面由于提取劑與原料的比例越大，濃度差就越大，導(dǎo)致物質(zhì)的運(yùn)輸過(guò)程越快；另一方面，比例的升高也會(huì)增加一些脂溶性物質(zhì)和醇溶性雜質(zhì)的溶出，從而影響總黃酮的浸出，提取率下降[14]．所以，黃秋葵花總黃酮提取時(shí)應(yīng)選取的最佳料液比(g/mL)為1∶180．

圖4 料液比對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵花總黃酮提取工藝的 試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及其顯著性分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2.根據(jù)表2的結(jié)果，由響應(yīng)面軟件(Design Expert10)分析得到方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3．其中，二次多項(xiàng)式回歸方程為：

總黃酮提取率=10.76-0.15A-0.12B+ 0.13C+0.17D+0.24AB+0.22AC+ 0.059AD-0.081BC-0.015BD-0.10CD- 0.51A2-0.16B2-0.56C2-0.42D2．

由表3可知，模型的P值小于0.000 1，說(shuō)明模型有顯著性差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且失擬項(xiàng)P=0.093 0，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差小[10,12]．

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

另外，從表3中看出，A(乙醇濃度)、B(超聲溫度)、C(超聲時(shí)間)、D(料液比)對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率影響都極顯著．AB(乙醇濃度與超聲溫度)、AC(乙醇濃度與超聲時(shí)間)的交互作用影響極顯著，CD(超聲時(shí)間與料液比)的交互作用明顯，其他各兩因素間的交互作用不明顯．

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

利用響應(yīng)面軟件得出各因素交互作用對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率影響的曲面圖如圖5．其中，曲面圖越陡，圖形越接近橢圓，說(shuō)明交互作用越明顯，最小橢圓的中心點(diǎn)為曲面圖的最高點(diǎn)[8-9]．由圖5可見(jiàn)，不同因素交互作用對(duì)黃秋葵花總黃酮提取率的影響程度不同，其中，乙醇濃度與超聲溫度、乙醇濃度與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與料液比的交互作用均比較明顯，這與方差分析結(jié)果一致．

表3 方差分析結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測(cè)分析，確定了黃秋葵花總黃酮的最佳提取工藝：A(乙醇濃度)為47.561%、B(超聲溫度)為53.921℃、C(超聲時(shí)間)為30.417 min、D(料液比)為1∶183.834，黃秋葵花總黃酮提取率為10.839%．

根據(jù)實(shí)際，為了便于操作，修正最佳工藝，即A(乙醇濃度)為48%、B(超聲溫度)為54℃、C(超聲時(shí)間)為30 min、D(料液比)為1∶184，進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)后，最終提取率為10.953%，和預(yù)測(cè)基本一致，所以該響應(yīng)面的優(yōu)化結(jié)果具有可行性．

圖5 不同因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了黃秋葵花總黃酮的提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度48%、超聲溫度54℃、超聲時(shí)間30 min、料液比(g/mL)1∶184，最佳工藝下黃秋葵花總黃酮提取率可達(dá)10.953%．黃秋葵花的花期長(zhǎng)、產(chǎn)量大，但它的枯萎速度也很快，經(jīng)常被當(dāng)作垃圾焚燒處理，這樣不但造成浪費(fèi)資源，且污染環(huán)境．如果可以利用黃秋葵花提取其中的黃酮物質(zhì)，不僅能夠廢物利用，還可為天然黃酮的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考．