孟金明，劉秋鳴，熊思敏，張霞，吳娜

(紅河學(xué)院 理學(xué)院，云南 蒙自 661100)

枇杷果肉軟而多汁，具有獨(dú)特的果香味，且含有人體所需的多種維生素以及礦物質(zhì)元素[1]。梨是我國的三大水果之一，其中含有蛋白質(zhì)、膳食纖維、有機(jī)酸、多種維生素和礦物質(zhì)以及豐富的酚類物質(zhì)[2-3]。果醋是主要以水果為原材料經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩次發(fā)酵工藝釀制而成的一種新型飲品，果醋不僅保留了水果原材料中很多營養(yǎng)成分，而且經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用產(chǎn)生了原材料中所不具有的多種功能性成分，因此果醋具有較好的保健功能[4]。隨著人們生活水平的不斷提高，傳統(tǒng)模式的食品逐漸開始淡出人們的視野，如今人們更加注重食物的營養(yǎng)性和健康性[5-7]。目前國內(nèi)利用水果及蔬菜等原料進(jìn)行果醋釀造的研究也越來越多，而對于枇杷和貢梨的研究主要集中在保鮮等方面[8-9]。本試驗(yàn)以貢梨和蒙自長虹枇杷為原料，釀制風(fēng)味獨(dú)特、果香濃郁、酸甜爽口的果醋產(chǎn)品，不僅可以解決水果資源因不易貯藏和保鮮造成的浪費(fèi)問題，而且為枇杷和貢梨的深加工產(chǎn)業(yè)提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料為蒙自長虹枇杷和市售貢梨。纖維素酶(80000 U/g)、果膠酶(80000 U/g)、焦亞硫酸鉀、檸檬酸：友誼食品添加劑公司；安琪果酒酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；食用酒精：河南河陽酒精實(shí)業(yè)有限公司；維生素C、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、碳酸氫鉀：均為分析純(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)室用水均使用蒸餾水。

GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；MQW-63G型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；CP224C型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司；LB90A手持糖度計(jì) 廣州市銘睿電子科技有限公司；JYL-Y15型九陽高速破壁調(diào)理機(jī) 九陽股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枇杷-梨復(fù)合果醋的發(fā)酵工藝流程

①枇杷：挑選枇杷→清洗→熱燙→去皮、去核→護(hù)色液浸泡→打漿。
②梨：挑選梨→清洗→去皮、切塊→護(hù)色液浸泡→打漿。
活性干酵母→活化→酵母活化液
↓
①+②按比例混合→酶解→二氧化硫處理→成分調(diào)整→接種→
酒精發(fā)酵→過濾→成分調(diào)整→接種→醋酸發(fā)酵→測定。
↑
醋酸菌活化液←活化和擴(kuò)大培養(yǎng)←醋酸菌

1.2.2 工藝流程中的操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料挑選與前處理

挑選出成熟度良好、外表無明顯機(jī)械損傷的枇杷，取適量放入沸水中熱燙20～30 s，熱燙后放入冷水中，去除果皮和果核，將果肉放入含有0.15%檸檬酸和0.05%維生素C的護(hù)色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.1%維生素C放入榨汁機(jī)中打漿。挑選中等大小的、無腐爛或變質(zhì)的貢梨，去皮，將果肉切成小塊放入護(hù)色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.05%維生素C放入榨汁機(jī)中打漿。

1.2.2.2 枇杷-梨復(fù)合果醋酒精發(fā)酵條件的確定

通過前期試驗(yàn)確定枇杷-梨復(fù)合果醋酒精發(fā)酵階段的條件：枇杷汁與貢梨汁的比例為1∶2(V/V)，初始pH為4.6，SO2添加量為61 mg/L，發(fā)酵溫度為22 ℃，初始糖度為21%，酵母添加量為0.2%，在以上條件下發(fā)酵所得枇杷-梨復(fù)合果醋具有較好的風(fēng)味、色澤和酒精度。

1.2.2.3 醋酸菌活化

種子培養(yǎng)基的配比：1.5 g葡萄糖、1 g酵母膏、2 g碳酸鈣和100 mL蒸餾水。培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至室溫，在無菌條件下向每瓶培養(yǎng)基中加入2.1 mL食用酒精和1.05 g醋酸菌，最后放入振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為31 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)72 h。種子液經(jīng)3 d培養(yǎng)至酸度值達(dá)到2.4 g/dL以上時即可使用，將調(diào)整成分后的果酒分裝入250 mL錐形瓶中，在無菌條件下接入醋酸菌種子液，用4層紗布封口后放入振蕩培養(yǎng)箱中，調(diào)整發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.3 理化成分測定

醋酸的測定：采用電位滴定法[10]。

1.2.4 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵時間的確定

調(diào)整發(fā)酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL果酒液裝入250 mL三角瓶中，然后接入7%的醋酸菌，置于31 ℃下，分別在發(fā)酵第3，5，7，9，11天測定其酸度值，分析果醋酸度值隨發(fā)酵時間變化的規(guī)律，確定醋酸發(fā)酵的最佳時間。

1.2.4.2 枇杷-梨復(fù)合果醋醋酸菌接種量的確定

調(diào)整發(fā)酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL發(fā)酵液裝入250 mL錐形瓶中，分別接入3%、5%、7%、9%、11%的醋酸菌接種量，置于31 ℃下，發(fā)酵9 d，分別測定其酸度值，分析果醋酸度值隨醋酸菌接種量變化的規(guī)律，確定最優(yōu)的醋酸菌接種量。

1.2.4.3 枇杷-梨復(fù)合果醋裝液量的確定

調(diào)整發(fā)酵液的初始酒精度為8% vol，分別將60，70，80，90，100 mL發(fā)酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，置于31 ℃下，發(fā)酵9 d，分別測定其酸度值，分析果醋酸度值隨裝液量變化的規(guī)律，確定最優(yōu)的裝液量。

1.2.4.4 枇杷-梨復(fù)合果醋初始酒精度的確定

分別調(diào)整發(fā)酵液的初始酒精度為5% vol、6% vol、7% vol、8% vol、9% vol，將70 mL發(fā)酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，置于31 ℃下，發(fā)酵9 d，分別測定其酸度值，分析初始酒精度對果醋酸度的影響，確定果醋發(fā)酵的初始酒精度。

1.2.4.5 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵溫度的確定

調(diào)整發(fā)酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL發(fā)酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，分別置于27，29，31，33，35 ℃下，發(fā)酵9 d，分別測定其酸度值，分析發(fā)酵溫度對果醋酸度的影響，確定果醋發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度。

1.2.5 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選取發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)3個因素為自變量，以酸度值(Y)作為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法對復(fù)合果醋的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平及編碼表

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同發(fā)酵時間對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響

由圖1可知，發(fā)酵3 d后果醋的總酸度就達(dá)到了35 g/L左右，因?yàn)殍凌?梨復(fù)合果醋酒精發(fā)酵階段結(jié)束后的發(fā)酵液具有一定的酸度，再加上接入的醋酸菌種子液也有一定的酸度，因此會造成發(fā)酵液的初始酸度較高。從發(fā)酵的第3天到第5天醋酸菌大量繁殖，消耗發(fā)酵液的乙醇大量合成醋酸，使得發(fā)酵液的總酸含量迅速上升；當(dāng)發(fā)酵5 d以后，隨著發(fā)酵液中乙醇、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的減少，醋酸菌的醋酸代謝減緩，進(jìn)而發(fā)酵液的總酸含量上升的速度變緩；當(dāng)發(fā)酵時間在9 d之后，發(fā)酵液的總酸基本趨于平穩(wěn)，發(fā)酵液的總酸含量達(dá)到51.27 g/L，這時發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)基本消耗殆盡而且酸度很高，醋酸菌的醋酸發(fā)酵基本結(jié)束[11]。因?yàn)榇姿岚l(fā)酵過程在9 d基本結(jié)束，總酸含量也已經(jīng)達(dá)到40 g/L以上，綜合時間成本，因此選擇枇杷-梨復(fù)合果醋的醋酸發(fā)酵時間為9 d。

圖1 發(fā)酵時間對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.2 不同醋酸菌接種量對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響

由圖2可知，當(dāng)醋酸菌的接種量處于一個較低的水平3%時，導(dǎo)致醋酸菌在發(fā)酵液中的總量偏少，不具備較好的產(chǎn)酸能力，導(dǎo)致發(fā)酵液中的酒精不能盡快地轉(zhuǎn)化為醋酸，而且會使果醋發(fā)酵的周期延長，增大發(fā)酵染菌的幾率。當(dāng)醋酸菌的接種量為3%～7%時，復(fù)合果醋的酸度隨著接種量的增加而呈現(xiàn)大幅度上升的趨勢，接種量為7%時果醋的酸度達(dá)最高值，為51.15 g/L，然而當(dāng)接種量大于7%后，醋酸菌的生長繁殖明顯增快，發(fā)酵液中醋酸菌數(shù)量的激增，一方面會消耗過多的營養(yǎng)成分，另一方面會過早地進(jìn)入衰亡期，大量菌體老化以及自溶，從而影響醋酸發(fā)酵過程，果醋的酸度呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢[12]。通過顯著性分析可以看出，接種量為7%與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，因此選取復(fù)合果醋發(fā)酵的最適醋酸菌接種量為7%。

圖2 醋酸菌接種量對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.3 不同裝液量對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響

由圖3可知，復(fù)合果醋的酸度值隨著發(fā)酵液裝液量的升高而呈現(xiàn)下降的趨勢。因?yàn)楸驹囼?yàn)使用250 mL錐形瓶進(jìn)行果醋發(fā)酵，隨著發(fā)酵液裝液量的增多，錐形瓶中的空氣柱越小，因此導(dǎo)致發(fā)酵液的含氧量降低，從而影響醋酸菌的生長繁殖，由于復(fù)合果醋的醋酸發(fā)酵過程是振蕩培養(yǎng)，因此裝液量過高還會導(dǎo)致發(fā)酵液污染封口的紗布，使得發(fā)酵液受雜菌污染的幾率增加[13]。當(dāng)裝液量為100 mL時發(fā)酵所得的果醋酸度值最低，裝液量為60 mL和70 mL時酸度值在52 g/L左右，兩者差異不顯著(P>0.05)；但由于60 mL的裝液量到發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液會有少量損失，不利于對其進(jìn)行酸度值的檢測，并且在酸度值相似的情況下，70 mL的裝液量可以提高果醋的生產(chǎn)率，因此選取70 mL為果醋發(fā)酵最適的裝液量。

圖3 裝液量對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響Fig.3 Effect of liquid loading volume on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.4 不同初始酒精度對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響

在復(fù)合果醋發(fā)酵階段，醋酸菌將會利用果酒中的乙醇和殘?zhí)堑葼I養(yǎng)物質(zhì)來進(jìn)行醋酸的代謝，所以初始發(fā)酵液中的乙醇含量直接影響發(fā)酵液中醋酸菌的產(chǎn)酸量[14]。由圖4可知，果醋的酸度值隨著初始酒精度的增大呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)初始酒精度為7% vol時，發(fā)酵液的酸度值達(dá)到最高53.24 g/L，隨著初始酒精度的繼續(xù)升高，酸度值反而呈現(xiàn)下降的趨勢，因?yàn)槌跏及l(fā)酵液中的乙醇過多會降低醋酸菌的代謝活力，不利于醋酸菌的生長，使得發(fā)酵液中醋酸菌的數(shù)量不能在短時間內(nèi)達(dá)到要求，從而導(dǎo)致整個發(fā)酵周期的延長，在發(fā)酵結(jié)束時復(fù)合果酸的酸度值偏低[15]。通過顯著性分析可以得出，初始酒精度為7% vol與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，所以選取最佳的初始酒精度為7% vol。

圖4 初始酒精度對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響Fig.4 Effect of initial alcohol degree on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.5 不同發(fā)酵溫度對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響

溫度對醋酸菌的生長有著重要的影響，溫度過高或過低都會對醋酸菌體內(nèi)酶的活性造成影響，從而影響醋酸菌的醋酸代謝，而且不同的醋酸菌最適的發(fā)酵溫度也不盡相同[16]。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，醋酸菌的生長十分緩慢，發(fā)酵液的菌體數(shù)量偏低，從而導(dǎo)致復(fù)合果醋的酸度值較低；隨著發(fā)酵溫度的升高，所得果醋的酸度值不斷升高，并在31 ℃時達(dá)到最大值52 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度高于31 ℃之后，醋酸菌的產(chǎn)酸量又呈現(xiàn)下降趨勢，因?yàn)榘l(fā)酵溫度較高時醋酸菌大量增殖，發(fā)酵會過早進(jìn)入衰亡期，菌體大量老化以及自溶，使得所得復(fù)合果醋的酸度值偏低[17]。通過顯著性分析可以得出，發(fā)酵溫度為31 ℃與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，所以選擇發(fā)酵溫度為31 ℃最佳。

圖5 發(fā)酵溫度對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.2 枇杷-梨復(fù)合果醋發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取對復(fù)合果醋發(fā)酵影響較大的因素發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)作為考察因素，以果醋酸度值作為響應(yīng)值 (Y) ，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken central composite design

2.2.2 響應(yīng)面回歸方程模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 10軟件對表2中得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，可以得到枇杷-梨復(fù)合果醋的酸度(Y)對應(yīng)醋酸發(fā)酵中發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)的回歸方程模型為：Y=53.46-1.34A+1.53B+0.83C-0.98AB-1.63AC-0.62BC-3.24A2-3.92B2-2.76C2，方程中Y為酸度，A、B、C分別表示3個影響因素各自對應(yīng)的編碼值。對枇杷-梨復(fù)合果醋的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方程模型的方差顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程模型的方差和顯著性分析Table 3 The variance and significance analysis of regression equation model

續(xù) 表

由表3可知，本試驗(yàn)中模型的P值<0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.8457，不顯著，可得出試驗(yàn)所得模型擬合性較好，該模型中各個影響因素的相關(guān)系數(shù)R2為0.9931，說明該模型能夠?qū)?shí)際試驗(yàn)中99%以上的響應(yīng)值做出解釋，因此本模型適用于分析和預(yù)測枇杷-梨復(fù)合果醋的發(fā)酵工藝條件。由表3中還可以得出自變量一次項(xiàng)A、B、C均具有極顯著差異(P<0.01)；交互項(xiàng)中，AB、AC有極顯著差異(P<0.01)，BC具有顯著差異(P<0.05)，模型交互效應(yīng)影響顯著；二次項(xiàng)系數(shù)A2、B2、C2的P值均<0.0001，模型的曲面效應(yīng)極顯著[18]。根據(jù)F值的大小可得出各發(fā)酵工藝因素對枇杷-梨復(fù)合果醋的酸度值的影響大小為：醋酸菌接種量(B)>發(fā)酵溫度(A)>初始酒精度(C)。

2.2.3 試驗(yàn)因素的交互作用分析

從Design-Expert 10響應(yīng)面分析軟件中得到的兩兩因素間的三維曲線圖和等高線圖見圖6～圖8。根據(jù)這3個因素對酸度值所形成的三維曲線圖可以較好地反映出發(fā)酵溫度、初始酒精度和接種量這3個因素之間的交互作用對枇杷-梨復(fù)合果醋酸度的影響情況，曲面的傾斜程度越大則說明此因素對果醋酸度值的影響越大。等高線圖中圖形的形狀可以反映出各因素之間交互作用的顯著程度，圖形為橢圓形則表示兩個因素的交互作用顯著[19-20]。

由圖6可知，發(fā)酵溫度和接種量交互形成的曲面坡度較大，說明其對酸度的影響較大，其等高線圖近似橢圓形，說明交互作用較顯著；由圖7可知，發(fā)酵溫度和初始酒精度交互形成的曲面坡度陡峭，說明其對酒精度的影響較大，并且等高線圖呈橢圓形，說明兩者的交互作用極顯著；由圖8可知，接種量和初始酒精度交互形成的曲面坡度較大，而且等高線圖呈橢圓形，說明這兩個因素的交互作用比較顯著。

圖6 發(fā)酵溫度和接種量交互影響酸度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and acetic acid bacteria inoculation amount interaction on the acidity value

圖7 發(fā)酵溫度和初始酒精度交互影響酸度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and initial alcohol degree interaction on the acidity value

圖8 接種量和初始酒精度交互影響酸度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour plot of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and initial alcohol degree interaction on the acidity value

2.2.4 最佳發(fā)酵條件的預(yù)測與檢驗(yàn)

通過響應(yīng)面分析試驗(yàn)可得出枇杷-梨復(fù)合果醋的最佳發(fā)酵參數(shù)：溫度為32.103 ℃，接種量為7.258%，初始酒精度為6.973% vol，此預(yù)測條件下可得到果醋酸度為51.792 g/L。根據(jù)實(shí)際可操作性，將發(fā)酵溫度調(diào)整為32 ℃，接種量調(diào)整為7.3%，初始酒精度調(diào)整為7% vol，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果再將發(fā)酵時間設(shè)定為9 d、裝液量設(shè)定為70 mL進(jìn)行響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下發(fā)酵所得復(fù)合果醋的酸度值為51.65 g/L，實(shí)際值與理論值相差較小，用此模型進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對枇杷-梨復(fù)合果醋醋酸發(fā)酵過程中主要發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出對復(fù)合果醋酸度影響最大的是醋酸菌接種量，其次是發(fā)酵溫度，而初始酒精度的影響最??；枇杷-梨復(fù)合果醋醋酸階段的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度為32 ℃，接種量為7.3%，初始酒精度為7% vol。在此最優(yōu)條件下復(fù)合果醋的酸度為51.65 g/L，所得果醋呈淡黃色，澄清透明，果香濃郁，口感醇厚。枇杷-梨復(fù)合果醋的研制不僅可以解決枇杷和貢梨在鮮果銷售過程中的腐敗浪費(fèi)，而且可以為枇杷和貢梨的深加工工藝提供理論依據(jù)，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加價值，推動果醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。