丁慧敏，陳芳芳，何朵英，李 娟，文海濤*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 汝城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 汝城 424100

汝城白毛茶（Camellia sinensis var. assamica cv. Rucheng）屬湖南省珍稀野生茶樹品種資源之一，是國內(nèi)罕見珍貴的大葉多毛野生茶[1]，其葉片大，多茸毛，獨特的生長環(huán)境成就了汝城白毛茶獨特的品質(zhì)[2-3]。目前，對汝城白毛茶的研究大多集中在其功效、品質(zhì)化學(xué)特性、加工工藝和種質(zhì)資源調(diào)查等方面[4-6]，關(guān)于汝城白毛茶葉片特征的系統(tǒng)研究相對較少。國內(nèi)外關(guān)于該品種葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)與生態(tài)適應(yīng)性、種質(zhì)資源開發(fā)利用等相互關(guān)系的研究尚未見報道。

茶樹葉片是茶樹收獲的主要物質(zhì)原料，是茶樹進(jìn)行一切生理活動的基礎(chǔ)，是茶樹生長最重要的器官。茶樹葉片特征不僅可以作為識別植物并進(jìn)行分類的依據(jù)之一，也可以作為初步判斷品種部分生理功能的依據(jù)。利用茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)預(yù)測或判斷茶樹的生態(tài)適應(yīng)性，是較為直觀簡便地判斷茶樹抗性品質(zhì)的方法[7]。此外，茶樹葉片的解剖結(jié)構(gòu)還與茶樹的抗病蟲性密切相關(guān)[8-12]?？梢?，對汝城白毛茶葉片特征研究可為優(yōu)良單株選育及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為2021年3月27日取自湖南汝城縣三江口瑤族鎮(zhèn)蘭洞村的汝城白毛茶，選生長狀況良好植株，采15組單株于敞口裝有水的密封袋中并編號。石蠟切片所需樣品選一單株取其芽頭、一芽一葉、一芽二葉和成熟葉片，儲存于FAA固定液中。

主要試劑：38%甲醛、冰醋酸、甘油、1%番紅水溶液（水配制）、1%固綠酒精溶液、二甲苯、石蠟、2.5%的戊二醛、0.1%的多聚賴氨酸。

1.2 方法

1.2.1 外部特征觀測

選取生長狀況良好的單株，每一單株隨機選取6片成熟葉，用卷尺測量所選取單株的成熟葉片的葉長和葉寬，測定15個單株，記錄數(shù)據(jù)，通過計算結(jié)果判斷其葉形和葉型。

通過直接觀測，判斷葉片的葉色、葉質(zhì)、葉面、葉尖等性狀。

葉型是根據(jù)葉片的長寬比確定的，葉面積=葉長×葉寬×0.7，按葉面積大小分為特大型葉（面積＞ 50 cm2）、大型葉（面積 28 ～ 50 cm2）、中型葉（面積14 ～ 28 cm2）和小型葉（面積＜14 cm2）。根據(jù)葉形指數(shù)確定葉形，葉形指數(shù)=葉長/葉寬，一般可分為圓形（葉形指數(shù)≤2.0）、橢圓形（葉形指數(shù)2.1 ～ 2.5）、長橢圓形（葉形指數(shù)2.6 ～ 2.9）和披針形（葉形指數(shù)≥3.0）。

1.2.2 葉片外表皮觀察

采用掃描電子顯微鏡觀測。截取0.5 cm×0.5 cm的茶葉葉片組織塊放在預(yù)先切好的同樣大小的涂抹了0.1%多聚賴氨酸的載玻片上，然后用2.5%的戊二醛固定4 h。將固定好的樣品用緩沖液沖洗3次后用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理，濃度設(shè)置為30%、50%、70%、90%和100%，各10 min。用100%的乙醇脫水后，用100%叔丁醇與乙醇進(jìn)行置換2次，每次10 min[10]。對樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，拿出后用導(dǎo)電膠將干燥后的樣品固定于樣品臺上，用20 mA的電流濺射鍍金30 s，最后送入掃描電鏡樣品室觀察[13-14]。

1.2.3 解剖結(jié)構(gòu)觀測

茶樹葉片尤其是成熟的茶樹葉片葉質(zhì)地較硬，角質(zhì)層和葉片都較厚，纖維化程度高，徒手切片具有較大的難度[15]。因此，茶樹葉片切片不同于一般植物葉片的切片，茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)鑒定方法均為石蠟切片法。方法如下：

取材：將汝城白毛茶不同成熟度以葉脈為中軸裁剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形，芽頭截取長為0.5 cm的中間部位，立即置于FAA固定液（甲醛-冰醋酸-甘油）中。因成熟葉片較厚且硬，放置在軟化液中的時間較其他葉片要長。

脫水：用不同濃度的乙醇脫水，每級濃度溶液停留 2 h。

透明：在通風(fēng)櫥中用二甲苯試劑進(jìn)行組織透明。

浸蠟：對透明后的組織材料浸蠟4次，每次 6 ～ 8 h。

包埋：最后將材料包埋在石蠟中（熔點在50℃ ～ 60℃）。

切片：將樣品放入切片機進(jìn)行切片，然后展片、脫蠟。

染色：先用1%的番紅水溶液染色1 ～ 2 h后，用蒸餾水洗滌3 ～ 5次；再用1%的固綠染色30 ～ 60 s后，將裝片浸泡在75%的乙醇溶液中1 min后取出晾干。

透明封片：加入干凈透明的二甲苯透明5 min，再加樹膠于材料表面蓋上蓋玻片-樹膠封片，封片后把切片放在37℃的恒溫箱中干燥[15]，制成永久性切片。

鏡檢：置于顯微鏡下鏡檢，對切片進(jìn)行圖像采集。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件應(yīng)用Excel 2019，對測定的每一組數(shù)據(jù)取平均值，組間再取平均值，根據(jù)平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片外部特征

汝城白毛茶葉片的葉面積平均值為30.1 cm2（＞30 cm2），屬于大型葉。葉型指數(shù)平均值為2.8，屬于長橢圓形，部分為橢圓形（表1）。

汝城白毛茶是近年用湖南省汝城縣野生大葉白毛茶馴化栽培后的茶樹群體品種，野生大葉白毛茶葉片大，葉片最長可達(dá)27.8 cm，最寬可達(dá)11.8 cm。從表1可以看，野生大葉白毛茶經(jīng)過馴化栽培后，葉長和葉寬都有所減小，但從葉型和葉面積來看，其仍屬于大葉型，葉形為長橢圓形，部分為披針形和橢圓形。

表1 成熟葉片數(shù)據(jù)Table 1 data of mature leaves

結(jié)合圖1、圖2和表2結(jié)果：汝城白毛茶葉片較大，葉尖較長，多數(shù)為急尖，部分為漸尖，只有12號為鈍尖；葉色多深綠，也有少數(shù)黃綠色和綠色；葉緣稍外卷，平展和波浪各有兩組，葉質(zhì)厚且硬脆，芽葉葉背生有許多茸毛，成熟葉葉背幾乎看不到茸毛。多數(shù)葉面微隆起或隆起，只有12號為平滑。芽葉分為兩種：色澤分別為黃綠和紫綠（圖2A和圖2B），芽葉背面多茸毛，相較于成熟葉，芽葉的葉緣外卷更明顯（圖2C）。芽頭肥壯，茸毛特別多，百芽重121.3 g（圖 2D）。

圖1 汝城白毛茶成熟葉Figure 1 mature leaf of RuCheng white hair tea

圖2 汝城白毛茶芽葉Figure 2 bud and bud leaves of RuCheng white hair tea

2.2 葉片外表皮特征

通過電鏡掃描圖片可看出，汝城白毛茶芽頭的茸毛茂盛，茸毛布滿整個芽頭（圖3A1、圖3A2）；氣孔被遮擋，看不到其他的部分。芽葉葉片背面氣孔較成熟葉片少，蠟質(zhì)層很?。▓D3B1、圖3C1）；葉背茸毛多，遮擋了部分氣孔（圖3B2、圖3C2）。綠色芽葉和紫色芽葉在氣孔、蠟質(zhì)層和茸毛方面沒有明顯差異，外表皮特征基本一致。一芽二葉的茸毛明顯要多于一芽一葉，因茸毛較多，只能透過茸毛看到部分氣孔（圖3D1、圖3D2）。成熟葉片下表皮的氣孔密集，氣孔由兩個腎形保衛(wèi)細(xì)胞組成，呈橢圓形；氣孔周圍有蠟質(zhì)層包圍，蠟質(zhì)層較厚，呈褶皺狀（圖3E1）；葉片背面茸毛很少（圖3E2）。

圖3 葉片背面電鏡掃描圖Figure 3 Electron microscope scanning of back of leaves

綜合來看，茸毛的疏密程度為芽頭最密，成熟葉茸毛最稀疏。芽葉背面的茸毛均指向葉尖，并與葉面具有一定的傾斜角度。氣孔的數(shù)量隨著成熟度增大而增加，成熟葉片面積最大，氣孔數(shù)量多，相應(yīng)地蒸騰作用也就越強。

2.3 不同成熟度葉片解剖結(jié)構(gòu)特征

為更好地觀察分析汝城白毛茶葉片的解剖結(jié)構(gòu)，選取了桃源大葉和黃金茶的成熟葉及芽頭作為對照。經(jīng)番紅-固綠染色后，木質(zhì)化細(xì)胞壁呈紅色，纖維素細(xì)胞壁呈綠色。

2.3.1 芽頭解剖結(jié)構(gòu)

從圖4可看出，芽頭上下表皮細(xì)胞外被角質(zhì)層，上表皮細(xì)胞大于下表皮細(xì)胞，上表皮細(xì)胞呈矩形，下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，呈圓形、卵圓形或長橢圓形，上下表皮細(xì)胞均排列緊密，彼此鑲嵌；三個品種的厚角組織都較發(fā)達(dá)，中脈有一個大的維管束，維管束不發(fā)達(dá)，呈新月狀（圖4A1、圖4B1、圖4C1）。汝城白毛茶和黃金茶芽頭的柵欄薄壁組織和海綿組織二者細(xì)胞形態(tài)相似，分化程度低，柵欄組織細(xì)胞呈長柱形，海綿組織細(xì)胞呈長橢圓形，部分也呈長柱形（圖4A2、圖4C2）。桃源大葉芽頭的柵欄組織和海綿組織尚未分化，組織細(xì)胞均呈圓形或卵圓形，尚未見到長柱形的柵欄組織細(xì)胞（圖4B2）。

圖4 芽頭解剖圖Figure 4 Anatomical structure of bud

2.3.2 一芽一葉和一芽二葉解剖結(jié)構(gòu)

一芽一葉解剖結(jié)果如圖5所示，上下表皮細(xì)胞外被角質(zhì)層，上下表皮均為單層細(xì)胞，上表皮細(xì)胞稍大于下表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，大多呈卵圓形，排列緊密；中脈厚角細(xì)胞數(shù)量多，厚角組織發(fā)達(dá)；中脈有一個大的維管束，呈新月狀，維管束和成熟葉相比欠發(fā)達(dá)（圖5A1、圖5B1、圖5C1）。柵欄組織和海綿組織分化不是特別明顯，柵欄組織細(xì)胞呈長柱形，柵欄薄壁組織為兩層（圖5A3）。木質(zhì)化細(xì)胞很少，幾乎不著紅色（圖5A1）。

圖5 一芽一葉解剖結(jié)構(gòu)Figure 5 Anatomical structure of a bud and leaf

一芽二葉解剖結(jié)果如圖6所示，上下表皮細(xì)胞外被角質(zhì)層，上表皮細(xì)胞稍大于下表皮細(xì)胞，上下表皮細(xì)胞排列緊密，呈不規(guī)則性；柵欄薄壁組織排列緊密，有兩層，大多呈長柱形，部分為不規(guī)則性。海綿組織細(xì)胞排列緊密，形狀不規(guī)則，呈矩圓形或卵圓形，柵欄薄壁組織與海綿組織的分化不明顯（圖6A3）；中脈有一個大型維管束，呈近半圓形，維管束發(fā)達(dá)程度較一芽一葉高。中脈附近有大型泡狀細(xì)胞分布（圖6A2），經(jīng)過番紅-固綠染色后，部分木質(zhì)化的細(xì)胞呈紅色(圖6A1)。

圖6 一芽二葉解剖結(jié)構(gòu)Figure 6 Anatomical structure of one bud and two leaves

2.3.3 對夾葉解剖結(jié)構(gòu)

結(jié)果如圖7所示。葉片上下表皮細(xì)胞外被角質(zhì)層，上下表皮細(xì)胞均為單層，上層細(xì)胞較大，呈不規(guī)則形，細(xì)胞間彼此凹凸鑲嵌，排列緊密。下表皮細(xì)胞較小，多為圓形和卵圓形。葉肉組織發(fā)達(dá)，柵欄組織由兩層排列整齊的長柱形細(xì)胞組成；海綿組織細(xì)胞形狀呈不規(guī)則形，排列稍疏松。中脈有一個大型維管束，維管組織是輪狀的，組成輪狀維管組織的每個維管束間有1～ 3列細(xì)胞的細(xì)胞壁已經(jīng)木質(zhì)化，且包圍在維管束外的纖維也連成環(huán)狀；木質(zhì)部發(fā)達(dá)，有發(fā)達(dá)的木纖維。

圖7 對夾葉解剖圖Figure 7 Anatomical structure of leaf to the clamp

2.3.4 成熟葉片解剖結(jié)構(gòu)

成熟葉片的解剖結(jié)構(gòu)如圖8所示。通過觀察三個品種的成熟葉片解剖圖可看出，這三個品種茶樹葉片上下表皮細(xì)胞外被角質(zhì)層，且較厚。葉片表皮都由單層細(xì)胞構(gòu)成，上表皮細(xì)胞較下表皮厚，表皮細(xì)胞呈卵圓形或圓形，柵欄組織為一層或兩層。葉片中脈處維管組織是輪狀的，導(dǎo)管呈鏈狀排列。汝城白毛茶葉片的中脈組織細(xì)胞有一部分細(xì)胞的細(xì)胞壁已經(jīng)木質(zhì)化，有發(fā)達(dá)的木纖維，中脈厚角細(xì)胞數(shù)量較桃源大葉和黃金茶數(shù)量多，厚角組織發(fā)達(dá)（圖8A1）。中脈和葉片組織的維管束發(fā)達(dá)，柵欄組織與海綿組織分化明顯，柵欄薄壁組織為兩層，呈長柱形且排列緊密；海綿組織排列疏松且細(xì)胞形狀多樣，細(xì)胞間間隙較大（圖8A2）。

圖8 成熟葉片解剖結(jié)構(gòu)Figure 8 Anatomical structure of mature leaf blade

3 結(jié)論與討論

葉片的宏觀特征可以作為識別植物并進(jìn)行分類的依據(jù)之一，也可作為初步判斷品種部分生理功能的依據(jù)。一般來說，葉片下表皮的氣孔密度較上表皮的氣孔密度大，并且在高強光照射下生長的植物通常比低強光下的植物具有較高的氣孔密度。通過觀察，汝城白毛茶的氣孔密度適中，初步判斷其不屬于高強光照射下生長的植物。除此之外，茶樹芽葉茸毛的有無與疏密程度是茶樹品種的主要經(jīng)濟性狀之一，鮮葉制作成產(chǎn)品后，茸毛可作為評定茶葉外形和品質(zhì)的重要因素[16]。汝城白毛茶以其芽葉肥壯、芽頭茸毛滿披而得名，十分具有代表性，這也是作為初步鑒別這一品種和其他品種的依據(jù)之一。有研究證明，根據(jù)葉片性狀表現(xiàn)，單株葉片小、葉質(zhì)厚，葉面隆起基本可以表明茶樹抗寒性較強[17]；茶樹芽葉的茸毛對一些病蟲害如茶尺蠖、茶橙癭螨、假眼小綠葉蟬等具有一定的抗性[18]。觀察結(jié)果表明，該品種葉片大、葉質(zhì)厚，葉面微隆起，茸毛密集，因而初步判斷其抗寒性稍好，抗茶樹病蟲害能力較強。

葉片的解剖結(jié)構(gòu)是茶樹進(jìn)行一切生理活動的基礎(chǔ)，它與茶樹的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性和光能利用率等密切相關(guān)。外表皮角質(zhì)層厚，葉片上表皮較下表皮厚，可以避免因陽光直射而灼傷葉肉細(xì)胞；下表皮較薄，有利于植株與外界進(jìn)行氣體交換和葉片的蒸騰。葉片進(jìn)行光合作用的主要部位是葉肉，在葉肉組織中，柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織間的厚度差異直接影響植株的光合作用效率。柵欄組織厚度也是抗高溫干旱的重要鑒定指標(biāo)之一，柵欄組織厚度越大，抗性越強[19]。有研究表明，海綿組織與品種的適制性密切相關(guān)[20]。葉肉的柵欄組織發(fā)達(dá)、海綿組織相對減少可以提高光合效率和水分利用率。通過觀察該品種不同成熟度葉片以及對比觀察汝城白毛茶、黃金茶和桃源大葉的成熟葉及芽頭的解剖結(jié)構(gòu)，可以得出：這三個品種均為典型的異面葉，葉片兩面的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，通常是上葉面主要受光，其葉肉細(xì)胞呈緊密垂直狀排列，形成光合作用效率很高的柵欄組織，顏色深綠。而下葉面主要背光，其葉肉細(xì)胞分布松散，形成光合作用效率較低的海綿組織，顏色淺綠。汝城白毛茶幼嫩芽葉的柵欄組織和海綿組織的分化程度不高，維管束發(fā)達(dá)程度稍低，中脈的大型維管束呈新月形或半圓形，木質(zhì)化程度較低。成熟葉片和對夾葉維管束較發(fā)達(dá)，木質(zhì)部導(dǎo)管徑向呈放射狀排列，呈長圓形，木質(zhì)部靠近下表皮的方向較發(fā)達(dá)，靠近上表皮的方向欠發(fā)達(dá)，并具有發(fā)達(dá)的木纖維，能夠起到支持葉片的作用[21]。外表皮被有角質(zhì)層，上表皮較下表皮厚，說明其保水和吸水能力較強；除了成熟葉的柵欄組織為兩層外，其余成熟度葉片的柵欄組織為一層，一芽一葉、芽頭的柵欄組織和海綿組織的分化程度不高，柵欄組織和發(fā)達(dá)程度不及海綿組織的發(fā)達(dá)程度高，初步判斷其抗旱能力一般。

綜上，本研究利用石蠟切片技術(shù)和掃描電子顯微鏡技術(shù)對汝城白毛茶葉片的外部特征和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測，初步探究葉片特性與生理活動和環(huán)境適應(yīng)性的相互關(guān)系，研究結(jié)果可為汝城白毛茶的優(yōu)良單株選育提供參考，為該品種資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。根據(jù)試驗結(jié)果，并通過查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料，初步得出結(jié)論：汝城白毛茶成熟葉葉面積平均值為30.1 cm2，屬于大葉種；葉形指數(shù)平均值為2.8，為長橢圓形。其葉片顏色多為深綠，葉片較大，葉尖較長且多數(shù)為急尖，部分為漸尖，葉面微隆起。汝城白毛茶茶樹芽葉茸毛茂密、光澤性好、隆起性稍強，說明品質(zhì)較好。芽頭肥壯，茸毛滿披，初步判斷抗病蟲害能力較強。通過觀察解剖結(jié)構(gòu)，初步判斷其抗旱性一般，抗寒性較強。