權(quán)雯婧，劉 超，李 奧，薛艷紅，劉士平

（三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002）

柑橘是我國(guó)南方地區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]，每年都有大量的柑橘因指狀青霉（P.digitatum）等采后致腐真菌的影響而發(fā)生腐敗和品質(zhì)劣變[2]，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]?；瘜W(xué)殺菌劑百可得、咪鮮胺等雖對(duì)柑橘的防腐有一定的效果[4]，但處理后的果品品質(zhì)發(fā)生劣變，糖份降低，而且對(duì)人體有毒副作用，殘留時(shí)間長(zhǎng)且對(duì)環(huán)境有污染，許多國(guó)家已禁止化學(xué)殺菌劑在果蔬采后處理中使用[5-6]。因此，開(kāi)發(fā)出一種綠色健康的保鮮劑顯得極為緊迫[7-8]。

近年來(lái)抗真菌肽（Antifungal Peptide，AFP）因其抑菌能力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)多樣、無(wú)毒副作用受到了人們的廣泛關(guān)注，如表面活性素、芬薺素、伊枯草菌素、桿菌霉素和羊毛硫肽等[9]，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和飼料添加劑等領(lǐng)域中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用[10]。這類物質(zhì)因其作用的靶點(diǎn)多與傳統(tǒng)的抗生素不一樣，因此微生物不易產(chǎn)生抗藥性，如羊毛硫肽通過(guò)在質(zhì)膜上形成膜孔而達(dá)到殺菌的效果[11]?？拐婢牡淖饔脵C(jī)制比較復(fù)雜，其可能的作用靶點(diǎn)為：a.影響細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)或者聚糖代謝，阻礙細(xì)胞壁的功能[12]；b.作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜通透性增加，內(nèi)容物流出[13]；c.作用于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器或物質(zhì)（如線粒體、蛋白質(zhì)、核酸等），使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖受到抑制，從而達(dá)到抑菌的目的[14-15]。

在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室從三峽河岸地區(qū)分布的草酸青霉（Penicillium oxalicum）中分離到一種新型的線性五肽，命名為三峽肽素（Sanxiapeptin），研究發(fā)現(xiàn)它在離體條件下或柑橘體內(nèi)均對(duì)柑橘的主要采后致腐菌指狀青霉具有強(qiáng)烈的抑制作用[16]，而且其抑菌能力遠(yuǎn)優(yōu)于目前市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的化學(xué)殺菌劑百可得[17]。為了明確三峽肽素的抑菌機(jī)理，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、保護(hù)劑的抑菌效果以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，初步確定了三峽肽素可能的抑菌靶點(diǎn)。本研究不僅有助于豐富抗真菌肽的作用機(jī)理，還將有助于新型綠色健康的柑橘保鮮劑的研發(fā)，對(duì)促進(jìn)我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮土豆 市售；葡萄糖 科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、麥角固醇、山梨醇 金燕海洋生物股份有限公司；色譜級(jí)乙腈 美國(guó)天地有限公司；真菌RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；百可得上海日曹達(dá)貿(mào)易有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑Goldenstar?RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2、T3 Super PCR Mix北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

BS-224s電子天平 德國(guó)賽多利斯有限責(zé)任公司；SW-CJ-2FD型雙人實(shí)驗(yàn)操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；XPX-9052 MBE數(shù)顯培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZY-85BN全自動(dòng)控溫?fù)u床上海知楚儀器有限公司；Master-s15純水儀 上海和泰儀器有限公司；MyCyclerTM Thermal PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)BECKMAN公司；DYCP-31DN水平電泳儀 北京市六一儀器廠；YM30F不銹鋼智能型立式電熱蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡下觀察 奧林巴斯株式會(huì)社；S3000N掃描電子顯微鏡、H-7500透射電子顯微鏡 Hitachi日本。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為指狀青霉P.digitatum（CICC 41633），本實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定[18-19]。菌株保藏于4 ℃的PDA固體培養(yǎng)基斜面中，培養(yǎng)基配方：土豆 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水 1000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。菌株經(jīng)活化后，采用不加瓊脂的PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速控制在120 r/min。

1.3 三峽肽素對(duì)菌株形態(tài)的影響

將指狀青霉在上述條件下培養(yǎng)3 d后，分別添加0～50 μg/mL的三峽肽素和正對(duì)照百可得，繼續(xù)培養(yǎng)12 h[20]。在光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，將培養(yǎng)物在5000 r/min離心5 min后，收集菌絲制備玻片進(jìn)行觀察[21]。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察委托百奧生物科技有限公司（湖北，武漢）按照文獻(xiàn)所示方法完成[22]，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 麥角固醇和山梨醇的補(bǔ)償分析

為了初步判斷三峽肽素抑制指狀青霉的可能作用靶點(diǎn)，本研究分別采用絲狀真菌細(xì)胞膜的保護(hù)劑麥角固醇和細(xì)胞壁的保護(hù)劑山梨醇進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)。將0、31.25、62.5、125、250、500、1000 μg/mL 的麥角固醇或山梨醇添加在PDA固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)皿中央放置含有1 mg/mL的三峽肽素或百可得的牛津杯[23-24]，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后測(cè)定抑菌圈直徑，通過(guò)抑菌圈大小的變化判斷可能的補(bǔ)償效應(yīng)。每次試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

將指狀青霉在1.2所述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后，分別添加15 μg/mL的正對(duì)照百可得（PD-2）和三峽肽素（PD-3），繼續(xù)培養(yǎng)6 h，同時(shí)設(shè)置相同時(shí)長(zhǎng)生長(zhǎng)的指狀青霉作為正常組（PD-1）。將培養(yǎng)物在5000 r/min離心5 min后，收集菌絲提取RNA后，送至華大基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用華大基因自主研發(fā)的過(guò)濾軟件SOAPnuke（v1.4.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用 Trimmomatic進(jìn)行過(guò)濾，得到clean reads，并將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)中大于20個(gè)堿基的序列所占的比例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；使用Bowtie2（v2.2.5）軟件將clean reads進(jìn)行比對(duì)，并將能相互比對(duì)上的凈數(shù)據(jù)比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization，v1.2.8）軟件進(jìn)行定量分析，并以FPKM（Fragments Per Kilobase Per Million reads）計(jì)算基因的表達(dá)水平，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為 FDR（False Discovery Rate）≤0.001且倍數(shù)差異在1倍以上的基因。將篩選到的差異表達(dá)基因，采用 GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行注釋分類，同時(shí)使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析，同時(shí)將檢測(cè)到的基因進(jìn)行在NR（Nucleotide Sequence Database）和 NT（Non-Redundant Protein Sequence Database）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋和歸類，判斷基因可能的功能[25]。

1.6 RT-PCR驗(yàn)證

使用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Goldenstar?RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測(cè)定并調(diào)整cDNA濃度之后，采用半定量RT-PCR結(jié)合電泳條帶的亮度進(jìn)行驗(yàn)證[26]，所用的引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為模板DNA：2 μL，T3 Super PCR Mix：20 μL，上游和下游引物各 1 μL，總體系 50 μL。PCR 程序 95 ℃ 3 min，然后是 95 ℃變性20 s，依據(jù)各引物的不同將退火溫度設(shè)置為T(mén)m+5 ℃，復(fù)性 20 s，72 ℃ 延伸 20 s，經(jīng)過(guò) 30～35 循環(huán)后再在72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三峽肽素對(duì)指狀青霉菌絲的形態(tài)影響

在培養(yǎng)條件下，三峽肽素可以顯著抑制指狀青霉的生長(zhǎng)（圖1），而且在同等濃度下其抑制能力優(yōu)于市場(chǎng)上廣泛使用的農(nóng)藥百可得（雙胍三辛烷苯基磺酸鹽，一種以細(xì)胞膜為靶點(diǎn)的殺真菌劑）[27-28]。為了進(jìn)一步了解三峽肽素對(duì)指狀青霉菌絲形態(tài)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用百可得為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置了0～50 μg/mL的濃度梯度，光學(xué)顯微鏡觀察顯示，三峽肽素和百可得在濃度超過(guò)20 μg/mL時(shí)均會(huì)導(dǎo)致指狀青霉的菌絲發(fā)生消融，在15 μg/mL時(shí)，不同組別的菌絲的形態(tài)變化是最為明顯的，因此選用此濃度處理后的菌絲進(jìn)行掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察。觀察結(jié)果顯示：三峽肽素和百可得兩者都使指狀青霉的菌絲明顯變粗，但經(jīng)三峽肽素處理后，菌絲體明顯形成結(jié)節(jié)扭曲狀（圖2A～圖2C）。

圖1 三峽肽素對(duì)指狀青霉的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of Sanxiapeptin on P.digitatum

為了進(jìn)一步了解指狀青霉的顯微形態(tài)變化，在相同濃度處理后分別進(jìn)行了掃描電鏡和透射電鏡觀察。掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加百可得后，菌絲體的扭曲程度和正常生長(zhǎng)的指狀青霉沒(méi)有明顯形態(tài)差異，而三峽肽素可以明顯導(dǎo)致菌絲體發(fā)生結(jié)節(jié)和扭曲（圖2D～圖2F）。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)三峽肽素處理后的指狀青霉細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)了空腔，細(xì)胞邊緣發(fā)生破裂、不完整，而作用于細(xì)胞膜的物質(zhì)百可得處理后細(xì)胞邊緣仍然較為完整，細(xì)胞內(nèi)部也沒(méi)有出現(xiàn)空腔（圖2G～圖2L）。上述結(jié)果表明，三峽肽素與百可得的作用機(jī)理可能不一樣，可能通過(guò)破壞細(xì)胞壁，造成滲透壓紊亂，使得胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而導(dǎo)致胞內(nèi)空腔的形成。

圖2 三峽肽素對(duì)指狀青霉的形態(tài)變化影響Fig.2 Morphological responses of P.digitatum induced by Sanxiapeptin

2.2 麥角固醇和山梨醇對(duì)三峽肽素介導(dǎo)的抑菌作用的補(bǔ)償作用

麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分，該化合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，專一性強(qiáng)；山梨醇是一種滲透保護(hù)劑，可以用于穩(wěn)定真菌的原生質(zhì)體，這兩種物質(zhì)在許多研究中分別用作細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的保護(hù)劑[29]。為了明確三峽肽素抑制指狀青霉的可能靶點(diǎn)，本研究分析了麥角固醇和山梨醇在不同濃度下對(duì)其抑菌能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在低濃度下上述物質(zhì)均沒(méi)有明顯的效果，但是1 mg/mL濃度下的山梨醇對(duì)三峽肽素的抑菌能力不僅沒(méi)有補(bǔ)償效應(yīng)，反而會(huì)促進(jìn)三峽肽素的抑菌能力（圖3A）。而麥角固醇則相反，在1 mg/mL的濃度下，會(huì)顯著（P＜0.05）緩解三峽肽素對(duì)指狀青霉的抑制程度，表現(xiàn)出一種明顯的補(bǔ)償效應(yīng)（圖3B）。相比正對(duì)照百可得，在同濃度下，山梨醇和麥角固醇均未對(duì)百可得的抑菌能力造成影響（圖3C～圖3D）。以上結(jié)果表明，三峽肽素與百可得的作用機(jī)理不一致，但可能通過(guò)影響細(xì)胞膜中麥角固醇的變化來(lái)達(dá)到抑制真菌的能力；同時(shí)，細(xì)胞壁及滲透壓的變化也會(huì)影響到三峽肽素的抑菌能力。

圖3 山梨醇和麥角固醇對(duì)三峽肽素抑菌能力的補(bǔ)償效應(yīng)Fig.3 Compensatory effect of sorbitol and ergosterol on the antifungal ability of Sanxiapeptin

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

將測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw reads）中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過(guò)高的數(shù)據(jù)過(guò)濾后，平均每個(gè)菌株產(chǎn)生了4253萬(wàn)條凈序列（clean reads），平均容量達(dá)6.38兆堿基（Gb），高質(zhì)量數(shù)據(jù)約96%。將所獲得的的clean reads使用HISAT進(jìn)行參考基因組序列比對(duì)，平均比對(duì)率達(dá)到93.66%。上述結(jié)果表明（表2），此次測(cè)序的質(zhì)量有保證，結(jié)果可靠[30]。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)概況Table 2 Overview of transcriptome sequencing data

2.4 差異表達(dá)基因分析

為了進(jìn)一步分析三峽肽素抑菌作用的分子機(jī)理，按照差異的倍數(shù)|log2（FoldChange）|和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來(lái)篩選差異表達(dá)基因，分析中將同時(shí)滿足|log2（FoldChange）|≥1 且 FDR≤0.001 的轉(zhuǎn)錄本確定為差異表達(dá)基因[31]。三個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因數(shù)如表3。

表3 差異表達(dá)的基因數(shù)Table 3 Number of differentially expressed genes

上述結(jié)果表明，加入三峽肽素處理后的菌株（PD-3）和正常生長(zhǎng)的菌株（PD-1）相比，其差異表達(dá)的基因數(shù)有13.07%，該結(jié)果與百可得處理后的菌株結(jié)果非常接近，即PD-1對(duì)PD-2的差異基因?yàn)?3.27%，從數(shù)量上反應(yīng)二者作用的趨同性。但是這些差異表達(dá)的基因大多數(shù)并不相同（圖4），且由于二者作用后的顯微觀察結(jié)果及麥角固醇和山梨醇的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)存在明顯差異，說(shuō)明二者的作用途徑明顯不同，因此，我們對(duì)于差異基因的研究集中在兩者的交集（{PD-1對(duì)PD-3}∩{PD-3對(duì)PD-2}）包含的530個(gè)基因中，即聚焦在僅由三峽肽素引起的表達(dá)差異的基因上。

圖4 差異表達(dá)基因的火山圖分布Fig.4 Volcano figure of differentially expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因的功能注釋

對(duì)不同處理下差異表達(dá)的基因，分別采用GO和KEGG分類富集分析。對(duì)照百可得處理后的指狀青霉（PD-2）和正常生長(zhǎng)的菌株（PD-1）相比，糖類、脂質(zhì)的代謝、能量代謝、遺傳過(guò)程和細(xì)胞自噬等途徑發(fā)生了變化（圖5A～圖5B）。三峽肽素處理后的菌株（PD-3），其差異基因也主要集中在上述途徑（圖5C～圖5D），不管是基因的數(shù)量還是基因可能的功能，暗示三峽肽素和百可得在抑制真菌的代謝通路上可能有部分重疊。

為了深入分析三峽肽素和百可得抑菌機(jī)理的差異，根據(jù)三峽肽素所導(dǎo)致的指狀青霉的形態(tài)變化以及相關(guān)保護(hù)劑的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將僅由三峽肽素影響的530個(gè)基因進(jìn)行了代謝通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多基因與聚糖、鞘脂類物質(zhì)、固醇、疏水蛋白及GPI（糖基磷脂酰肌醇，Glycosylphosphatidylinositol）的代謝相關(guān)（圖5E～圖5F，表4），說(shuō)明了三峽肽素有可能影響了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁等細(xì)胞表面的功能。

表4 部分可能參與細(xì)胞表面功能的差異表達(dá)的基因Table 4 Some differentially expressed genes possibly involved in cell surface metabolism

圖5 差異表達(dá)基因的注釋分析Fig.5 Annotation of differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證分析

為了驗(yàn)證上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的準(zhǔn)確性，本研究選取了三峽肽素影響指狀青霉表達(dá)變化的17個(gè)候選基因（表5）進(jìn)行RT-PCR半定量表達(dá)驗(yàn)證，這些基因的功能大多與細(xì)胞表面的代謝相關(guān)。在進(jìn)行RT-PCR之前，先選擇P450基因CL1226.Contig2作為管家基因，因?yàn)樗诓煌瑫r(shí)期、不同條件下均可穩(wěn)定的表達(dá)，是一種較為理想的內(nèi)參基因[32-33]。

表5 指狀青霉中候選基因的表達(dá)量及注釋Table 5 Expression and annotation of candidate genes in P.digitatum

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，有8個(gè)參與細(xì)胞表面代謝的基因CL254.Contig3、CL279.Contig24、CL1025.Contig2、CL2611.Contig2、CL3.Contig4、CL2032.Contig3、CL2193.Contig3、CL277.Contig8基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果完全一致（表5、圖6）。功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，這些基因大部分位于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜中，可能與細(xì)胞表面的磷脂酰肌醇聚糖的合成和代謝的生物活動(dòng)相關(guān)，從而影響了細(xì)胞表面的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外溢，從而起到抑菌的作用。

圖6 候選基因的RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證Fig.6 RT-PCR expression verification of the candidate genes

3 結(jié)論

本研究分析了三峽肽素對(duì)指狀青霉的形態(tài)學(xué)影響，明確了細(xì)胞膜保護(hù)劑麥角固醇及細(xì)胞壁保護(hù)劑山梨醇對(duì)三峽肽素抑菌作用的補(bǔ)償效應(yīng)，同時(shí)基于BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)，分析比較了指狀青霉在三峽肽素處理后的無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，將可能的抑菌代謝途徑初步聚焦在530個(gè)差異基因中。重點(diǎn)對(duì)影響細(xì)胞表面的候選基因進(jìn)行了分析和驗(yàn)證，初步確定三峽肽素通過(guò)影響疏水蛋白、麥角固醇合成酶、聚糖及GPI代謝途徑相關(guān)的蛋白等細(xì)胞膜及細(xì)胞壁等細(xì)胞表面的功能蛋白來(lái)發(fā)揮作用，所有這些嘗試為明確其抑菌真菌的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)工作的主要內(nèi)容將集中在對(duì)上述候選基因在草酸青霉中進(jìn)行超表達(dá)或者基因敲除以構(gòu)建突變體，在明確基因功能的基礎(chǔ)上，通過(guò)分析突變體對(duì)三峽肽素敏感程度的變化解析其作用機(jī)理，進(jìn)一步確定三峽肽素的作用靶點(diǎn)。