杜金杰，吳新惠，代雨晴，劉曉純，廖楷濱，覃玉娜，鐘麗華，張靈枝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

六堡茶作為廣西歷史名茶，國家地理標(biāo)志性農(nóng)產(chǎn)品，素有“紅、濃、陳、醇”之稱[1]。其品質(zhì)形成與渥堆過程微生物作用密切相關(guān)[2]。目前，與普洱茶、茯磚茶等其他黑茶相比，六堡茶的研究還相對(duì)薄弱。前人對(duì)于六堡茶渥堆過程的化學(xué)成分分析的研究已經(jīng)有報(bào)道[3]，但針對(duì)渥堆過程六堡茶感官品質(zhì)與化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)的研究分析報(bào)道仍較少。

近年來，隨著六堡茶產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，六堡茶對(duì)人體健康功效的研究報(bào)道不斷，加深了人們對(duì)六堡茶保健功效的進(jìn)一步認(rèn)知。如降脂減肥[4]、祛濕[5]、改善腸道菌群[6]，提高免疫力[7]等。茶褐素是黑茶中含量最高的一種色素類物質(zhì)，其具有降血糖、降血脂[8-9]、促進(jìn)膽固醇降解[10]、抑菌[11]、改善腸道菌群[12]、抗氧化[13]、抗癌[14]等一系列特殊功效。采用黃意歡的系統(tǒng)分析法測定數(shù)據(jù)時(shí)，六堡茶茶褐素含量為19.31%～38.61%[15-16]，普洱茶為 7.32%～12.76%[17]，雅安藏茶為3.20%～14.86%[18]。與其他黑茶相比，六堡茶茶褐素相對(duì)含量最高。目前國內(nèi)外對(duì)茶褐素的研究主要聚集在三個(gè)方面：一是發(fā)酵過程茶褐素的形成機(jī)理研究；二是茶褐素的提取分離與純化工藝研究；三是茶褐素的生理活性功能研究[19]。成品六堡茶茶褐素提取工藝和抗氧化活性已有研究報(bào)道[13]，但針對(duì)不同渥堆時(shí)間六堡茶茶褐素的化學(xué)組分分析和清除DPPH自由基能力的研究仍未有報(bào)道。

本試驗(yàn)以廣西梧州市蒼梧縣群體種毛茶為原料，利用現(xiàn)代化冷水渥堆工藝制作的、不同發(fā)酵階段的茶樣為研究對(duì)象，進(jìn)行感官品質(zhì)和化學(xué)成分分析。對(duì)不同發(fā)酵階段六堡茶茶褐素提取物進(jìn)行理化成分分析和抗氧化活性比較，旨在探究渥堆過程六堡茶品質(zhì)特征與化學(xué)成分變化規(guī)律，以及茶褐素的形成規(guī)律和功能活性變化規(guī)律，為改進(jìn)六堡茶加工工藝提供一定參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

茶樣 為廣西梧州中茶茶廠2020年冷水渥堆現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝生產(chǎn)，選取了四個(gè)發(fā)酵階段進(jìn)行取樣，分別為：第一階段（0 d毛茶）、第二階段（20 d茶樣）、第三階段（40 d 茶樣）、第四階段（60 d 茶樣）；蒽酮、苯駢戊三酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國旭日公司；氯化亞錫 天津化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃硫酸、無水葡萄糖、鹽酸、結(jié)晶氯化鋁、十二水合磷酸氫二鈉 均為國產(chǎn)分析純，廣州化學(xué)試劑廠；L-谷氨酸、咖啡堿、牛血清蛋白、沒食子酸（＞99%） 上海綠源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（＞97%） 日本TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司；福林酚食品純；甲醇 色譜純。

WFJ7200型可見分光光度儀 尤尼柯上海儀器有限公司；FC-14C型差速離心機(jī) 廣州方統(tǒng)生物科技有限公司；ALANCEE295高效液相色譜儀 美國WATERS；WD850B型微波爐 格蘭仕中央空調(diào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 每個(gè)階段取樣均采用五點(diǎn)取樣法，從茶堆的表面和中層分別取等量茶樣，充分混勻。固樣方式參考曾貞等[20]微波固樣方式并稍作修改。微波爐額定輸出功率850 W，額定微波頻率2450 MHz。先100%火力固樣3 min，攤晾降溫至室溫再20%火力微波固樣8 min。取出放置烘箱100 ℃烘干2 h至全干，然后用植物粉碎機(jī)粉碎成茶粉，過40目篩后用于檢測理化指標(biāo)和提取茶褐素。

1.2.2 感官審評(píng) 按照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的黑茶（散茶）的審評(píng)方法，由2男3女，具有中（4人）、高級(jí)（1人）評(píng)茶員職業(yè)資格證書的審評(píng)老師進(jìn)行審評(píng)，用專業(yè)的茶葉審評(píng)術(shù)語得出審評(píng)結(jié)果。

1.2.3 茶葉理化成分測定 水浸出物測定參照GB/T 8305-2013；游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314-2013；茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2018；黃酮類化合物含量測定采用三氯化鋁比色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮-硫酸比色法；茶色素含量測定采用系統(tǒng)分析法[21]；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013，色譜柱：250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相A：30% 甲醇水溶液；流動(dòng)相 B：超純水；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 茶褐素提取 茶褐素提取參照周婷等[22]的實(shí)驗(yàn)方法。按照茶水比1:37，稱量20 g干茶粉，加入740 mL 蒸餾水，室溫，100 KHz，超聲 30 min 后 96 ℃水浴浸提86 min，趁熱抽濾后將濾液降壓濃縮至1/5～1/10。依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2次，最后收集水層，按照1:4比例加入無水乙醇，低溫靜置12 h后，9000 r/min離心10 min收集沉淀，再利用真空冷凍干燥機(jī)干燥成粉末即為茶褐素，4 ℃下保存。

1.2.5 茶褐素理化成分測定 茶褐素理化成分測定參考田燕華實(shí)驗(yàn)方法[23]；茶褐素總糖含量測定采用蒽酮-硫酸法；總蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法；總酚含量測定采用福林酚法；茶褐素溶液pH測定采用pH計(jì)直接測定。

1.2.6 茶褐素清除DPPH自由基能力 實(shí)驗(yàn)方法參考田燕華[23]實(shí)驗(yàn)方法。陽性對(duì)照組：配制濃度為0.1 mg/mL的VC母液。將母液稀釋成濃度分別為5、7.5、10、12.5、15、20 μg/mL 的稀釋液。試管中加入不同濃度VC稀釋液和1 mmol/L DPPH溶液各2 mL，空白對(duì)照組加入等量超純水，搖勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm波長下測量吸光值。茶褐素組：配制濃度為0.2 mg/mL的茶褐素母液，將母液稀釋成濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的稀釋液。試管中加入不同濃度茶褐素稀釋液和1 mmol/L DPPH溶液各2 mL，空白對(duì)照組加入等量超純水，搖勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm波長下測量吸光值。

DPPH自由基清除率（%）=[（對(duì)照組吸光值-樣品組吸光值）/對(duì)照組吸光值]×100

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制清除曲線。以清除曲線計(jì)算清除率為50%時(shí)的樣品濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)（即自由基半數(shù)抑制濃度IC50）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 24進(jìn)行方差分析和顯著性分析，采用GraphPadPrism8進(jìn)行作圖。采用Photoshop進(jìn)行圖片拼接。

2 結(jié)果與分析

2.1 渥堆過程六堡茶感官品質(zhì)特征

實(shí)驗(yàn)對(duì)渥堆過程六堡茶的外形、香氣、滋味、湯色、葉底進(jìn)行審評(píng)。其干茶外形，湯色底的外觀圖如圖1所示，品質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果如表1所示。在外觀方面：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，干茶的色澤、茶湯湯色、葉底的色澤都由淺至深發(fā)生顯著的變化。發(fā)酵60 d的茶湯湯色，已經(jīng)初步具備了六堡茶“紅、濃”的要點(diǎn)。在品質(zhì)評(píng)價(jià)方面：0 d的毛茶，其香氣高揚(yáng)，持久，具有日曬氣，滋味醇厚，有刺激性，回甘。而發(fā)酵了20 d的六堡茶，湯色滋味變化仍不顯著。發(fā)酵了40 d的六堡茶，其湯色由深黃轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S，葉底明顯更柔軟，推測微生物一些胞外酶，如纖維素酶，果膠酶將茶葉細(xì)胞分解，導(dǎo)致葉底變得柔軟[24]。其次，發(fā)酵40 d的六堡茶，其滋味發(fā)酸，而且香氣粗雜，帶有酸餿味。推測應(yīng)該是發(fā)酵過程香氣物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，形成了一些不好聞的過渡型香氣物質(zhì)[25]，至于為何會(huì)呈現(xiàn)酸餿味，以及40～60 d的發(fā)酵過程中，40 d時(shí)的酸餿味是如何轉(zhuǎn)化成為60 d時(shí)濃郁的花果香，仍待進(jìn)一步分析。發(fā)酵60 d的六堡茶，已經(jīng)具備一個(gè)商品茶“紅、濃、陳、醇”的品質(zhì)特征。其湯色紅棕，滋味由苦澀，有刺激性轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜己瘛㈨樆?，且湯中帶有一絲糯香。香氣純正，果香濃郁。

圖1 渥堆過程六堡茶品質(zhì)外觀圖Fig.1 Quality appearance of Liupao tea during fermentation process

表1 渥堆過程六堡茶感官品質(zhì)審評(píng)結(jié)果Table 1 Sensory quality evaluation of Liupao tea during fermentation process

綜上分析，在使用優(yōu)質(zhì)六堡茶原料的前提基礎(chǔ)上，冷水渥堆現(xiàn)代工藝發(fā)酵初期物質(zhì)轉(zhuǎn)換速度不明顯，但到發(fā)酵第四階段（60 d），其茶樣湯色、香氣、滋味均基本達(dá)到六堡茶“紅、濃、陳、醇”的品質(zhì)特征。

2.2 渥堆過程六堡茶主要成分變化

渥堆過程六堡茶主要內(nèi)含成分變化見表2。由表2可知，隨著渥堆時(shí)間的延長，茶葉中的水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸，黃酮類物質(zhì)含量都呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05），其結(jié)論與張芬等[26]的研究結(jié)果一致。與0 d（毛茶）相比，發(fā)酵60 d的六堡茶的水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸、黃酮含量分別減少了 34.11%（P＜0.05）、65.22%（P＜0.05）、77.56%（P＜0.05）、87.67%（P＜0.05）、16.49%（P＜0.05）。茶黃素和可溶性糖含量沒有明顯變化規(guī)律，前者含量在0.16%～0.28%之間波動(dòng)，后者含量在1.11%～1.16%之間波動(dòng)變化。茶褐素含量明顯增加，與0 d（毛茶）相比，發(fā)酵60 d的六堡茶茶褐素含量增加了2.28倍?？Х葔A含量總體呈現(xiàn)增加趨勢，但不顯著（P＞0.05），其含量從0 d的3.28%增加到了60 d時(shí)的3.98%。檢測結(jié)果中，六堡毛茶的游離氨基酸含量非常高，達(dá)到了6.96%，目前已知的高氨基酸茶樹品種有凌云11號(hào)、凌云6號(hào)、短節(jié)白毫等，其游離氨基酸含量為8%左右[27]，游離氨基酸是使茶葉呈現(xiàn)鮮爽感官品質(zhì)的主要內(nèi)含物。單從茶葉深加工的方向考慮，此種質(zhì)資源有專項(xiàng)開發(fā)的潛質(zhì)。

表2 渥堆過程六堡茶理化成分變化Table 2 Variation of main physical and chemical components of Liupao tea during fermentation process

2.3 不同渥堆時(shí)期六堡茶茶褐素理化成分分析

不同渥堆階段六堡茶茶褐素溶液pH結(jié)果如表3所示。由表3可知，茶褐素溶液濃度為0.2 μg/mL時(shí)，其pH為6.60～6.74之間，說明茶褐素為一種弱酸性的物質(zhì)。不同渥堆階段的茶褐素溶液pH之間沒有顯著性差異（P＞0.05）,其結(jié)論與吳恩凱等[16]、田燕華[21]的研究結(jié)果一致。不同渥堆階段六堡茶茶褐素提取物的主要化學(xué)組分結(jié)果如表4所示。由表4可知，不同渥堆階段六堡茶茶褐素蛋白質(zhì)含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢。20與40 d的茶褐素相比,茶褐素的蛋白質(zhì)含量有所增加，但不顯著（P＞0.05）。40與60 d的茶褐素相比，茶褐素的蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），由40 d時(shí)的11.39%增加至60 d時(shí)的14.97%；不同渥堆階段六堡茶茶褐素的總酚含量呈現(xiàn)顯著增加趨勢（P＜0.05），由20 d時(shí)候的9.01%增加至60 d的17.07%，增加了1.89倍?？偺呛恳矎?0 d的11.78%顯著增加（P＜0.05）至60 d的17.25%。茶褐素含量的增加，在于渥堆過程中微生物通過分泌胞外酶，促進(jìn)多酚類物質(zhì)氧化、聚縮合，形成大分子物質(zhì)[28]。同時(shí)，這些生物活性酶通過分解茶葉細(xì)胞和組織，從而增加了與茶褐素絡(luò)合的蛋白質(zhì)、游離多糖、黃酮等酚類物質(zhì)[29]。推測是導(dǎo)致茶褐素提取物的總糖、總蛋白、總酚含量顯著增加的主要原因。

表3 渥堆過程不同六堡茶茶褐素溶液的pHTable 3 pH of different theabrownins solution that extracted from Liupao tea during fermentation process

表4 渥堆過程不同六堡茶茶褐素主要化學(xué)成分Table 4 Main components of different theabrownins that extracted from Liupao tea during fermentation process

2.4 不同渥堆階段六堡茶茶褐素清除DPPH自由基能力比較

DPPH是目前體外模型測定樣品清除自由基能力最常用的方法之一[30]。為評(píng)價(jià)不同抗氧劑之間清除自由基的能力，以自由基半數(shù)抑制濃度IC50作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，IC50值越小，代表其抗氧化能力越強(qiáng)。

由圖2可知，茶褐素濃度在 10～60 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著濃度增加，清除率增加，但是低于陽藥組（VC）。由表5可知，40和60 d的茶褐素溶液清除DPPH自由基能力要強(qiáng)于20 d的茶褐素溶液，但40與60 d的茶褐素溶液之間的IC50差異不明顯，兩者清除自由基能力相當(dāng)?？偟膩碚f，各茶褐素提取物濃度為IC50時(shí)，其抗氧化能力為：VC＞40 d＞60 d＞20 d。眾所周知，多酚類物質(zhì)具有顯著的抗氧化功能[31-32]，不同六堡茶茶褐素的化學(xué)組分分析結(jié)果也表明，隨著渥堆天數(shù)的增加，總酚的含量顯著增加（P＜0.05），這與其對(duì)應(yīng)的抗氧化能力有一定相關(guān)性。40與60 d的茶褐素相比，其總酚含量顯著增加（P＜0.05），但是清除自由基能力卻差異不大，推測茶褐素分子結(jié)構(gòu)中的結(jié)合酚清除自由基的原理與游離酚有所不同[32]。同時(shí)，茶褐素清除DPPH自由基的能力與該茶褐素的空間構(gòu)象，電子轉(zhuǎn)移能力也有一定關(guān)系[33]。在本實(shí)驗(yàn)中，濃度為0.2 μg/mL時(shí)，40 d的茶褐素溶液的pH比60 d同樣濃度的茶褐素溶液濃度略低，推測40 d的茶褐素溶液的電子轉(zhuǎn)移能力比60 d的茶褐素溶液相對(duì)更強(qiáng)，所以其IC50值相對(duì)更小，抗氧化能力更強(qiáng)。

圖2 渥堆過程六堡茶茶褐素清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activity of theabrownins of Liupao tea during fermentation process

表5 渥堆過程六堡茶茶褐素IC50值比較Table 5 Comparison of IC50 values of theabrownins of Liupao tea during fermentation process

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵60 d的茶樣從干茶、湯色、滋味、葉底來看，已經(jīng)基本具備商品茶“紅、濃、陳、醇”的品質(zhì)特征。渥堆過程水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸、黃酮類物質(zhì)等含量都顯著下降（P＜0.05），茶褐素含量顯著增加（P＜0.05）。茶湯滋味由濃強(qiáng)、刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榇己?、順滑。后發(fā)酵黑茶化學(xué)成分的變化受多因素影響，微生物生化作用和濕熱作用是主要影響原因。隨著人們對(duì)多元化的追求，風(fēng)味化、功能化的定向發(fā)酵是六堡茶乃至整個(gè)黑茶產(chǎn)業(yè)未來發(fā)展的重要方向，因此進(jìn)一步深入研究微生物生化作用和濕熱作用對(duì)六堡茶渥堆過程化學(xué)成分的影響機(jī)理，具有重要意義。

茶褐素的理化結(jié)果分析和清除自由基能力表明，隨著渥堆天數(shù)增加，茶褐素中的總糖、總蛋白、總酚含量都是增加的趨勢。在各茶褐素提取物自由基半數(shù)抑制濃度（IC50）時(shí),其清除DPPH自由基的能力為：VC組＞40 d＞60 d＞20 d。發(fā)酵 40與 60 d的茶褐素清除DPPH自由基的能力差異不明顯，但相對(duì)20 d的茶褐素均明顯增強(qiáng)，證明渥堆發(fā)酵能夠提升六堡茶茶褐素提取物清除DPPH自由基的能力，是六堡茶加工工藝的重要工藝。

目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于茶褐素的定義有兩種，一部分學(xué)者認(rèn)為，那些與茶褐素本身絡(luò)合在一起的游離多糖、蛋白質(zhì)、核酸等小分子物質(zhì)并不是“茶褐素”本身，因此茶褐素的功能仍不能直接斷定為是其茶褐素自身的功能基團(tuán)起的作用。因此他們一直致力于運(yùn)用各種分離純化的方法去進(jìn)一步純化茶褐素，目的就是為了得到高純度的茶褐素組分，但是目前為止，仍未有文章報(bào)道分離純化到茶褐素單體。另外一部分學(xué)者則認(rèn)為，既然各種方法都不能完全分離干凈茶褐素中的蛋白質(zhì)、多糖、游離氨基酸等小分子物質(zhì)，因此未來可以考慮，在驗(yàn)證其生物活性時(shí)，可以把茶褐素與各小分子物質(zhì)看成一個(gè)整體。在各組分含量達(dá)到一定區(qū)間范圍時(shí)，歸類為同一類茶褐素。此外，茶褐素作為六堡茶的特征性成分，其各種保健功效雖已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但其作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步探究。