董 蕾，黃利華

（廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東 廣州 510640）

全球食品安全問(wèn)題以食源性致病菌導(dǎo)致的疾病為問(wèn)題之首。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)顯示，每年全球所發(fā)生的食源性疾病可達(dá)數(shù)10億起。僅因?yàn)槭澄锼鸬母篂a性疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)每年就可達(dá)220萬(wàn)人[1]。食源性致病菌通過(guò)污染食品，引起人類疾病，常見的致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌（尤以出血性大腸桿菌O157:H7為主）、致病性弧菌、志賀氏菌等。這些致病菌污染食品后，會(huì)引起食品腐敗變質(zhì)或代謝產(chǎn)生毒素，引起人畜患病。

傳統(tǒng)食源性致病菌檢測(cè)方法包括平板分離法[2]、分子生物學(xué)方法[3-5]、免疫學(xué)方法[6]等。但傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度不高、技術(shù)要求高；分子生物學(xué)技術(shù)則要求技術(shù)條件高、檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；免疫學(xué)檢測(cè)方法的前期抗體制備周期長(zhǎng)、研發(fā)成本高，均不能很好滿足食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測(cè)需求[7]。在適配體發(fā)現(xiàn)以后，通過(guò)適配體與不同技術(shù)的結(jié)合，使食源性致病菌檢測(cè)方法步入新階段。本文主要從核酸適配體的特征以及在不同領(lǐng)域，尤其是食源性致病菌檢驗(yàn)方面的應(yīng)用作簡(jiǎn)要概述。

1 適配體的特點(diǎn)

1990年，Tuerk等發(fā)現(xiàn)一類能夠與蛋白結(jié)合，產(chǎn)生高特異性和親和度的單鏈核酸序列，將其定名為適配體（Aptamer）[8]。適配體是一段特異的單鏈DNA或RNA，通過(guò)獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)高特異性識(shí)別和高親和性的結(jié)合靶物質(zhì)。由于適配體的靶物質(zhì)可以為生物分子、化學(xué)分子及細(xì)胞，且探針具有分子量小、無(wú)免疫原性、修飾簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9][10]，故自從發(fā)現(xiàn)以來(lái)，涌現(xiàn)出大量針對(duì)不同靶物質(zhì)的適配體研究，搭載在不同的材料上制成各種生物傳感器，廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、活體成像等領(lǐng)域[11]。

適配體通常含有15-40個(gè)堿基，分子量為5-25kD。與抗體等傳統(tǒng)免疫檢測(cè)原件相比，適配體具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）測(cè)環(huán)境要求不高、易做各種修飾：適配體為一類核酸物質(zhì)，片段小，性質(zhì)穩(wěn)定，因此能夠耐高溫、耐酸堿環(huán)境，且由于其片段小，易于保存，不易降解，同時(shí)可以在序列末端進(jìn)行巰基、生物素或其他生物基團(tuán)的標(biāo)記，用以搭建各種生物傳感器。

（2）和性高、特異性強(qiáng)：由于適配體是單鏈的寡核苷酸DNA或RNA，可以形成各種空間構(gòu)象（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、口袋結(jié)構(gòu)、G-四聚體等），通過(guò)氫鍵、范德華力等作用與相應(yīng)的靶物質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物[12]，這一類復(fù)合物的穩(wěn)定契合可以使解離常數(shù)達(dá)到nmol甚至pmol水平，因此具有高結(jié)合能力。

（3）選周期短：傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)進(jìn)行抗體篩選，需要經(jīng)過(guò)一系列體外篩選及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。但適配體篩選過(guò)程不需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)由最常見的適配體篩選技術(shù)──指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX），經(jīng)過(guò)8-15輪的篩選后，即可得到與靶物質(zhì)親和度高、特異性強(qiáng)的適配體，整個(gè)周期可控制在1-2個(gè)月。

（4）用范圍廣：適配體是一段包含15-40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，用于進(jìn)行適配體篩選的文庫(kù)容量巨大，因此靶物質(zhì)的范圍極廣，包括生物小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至完整細(xì)胞[13-16]。隨著研究者們的不斷深入和廣泛研究，僅以食品檢測(cè)為例，適配體現(xiàn)已在農(nóng)獸藥殘留[17-21]、重金屬[22-24]及食源性致病菌[25][26]等檢測(cè)中取得一定成績(jī)。

2 核酸適配體的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著對(duì)適配體研究的不斷深入，適配體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物傳感、治療、微生物檢測(cè)、細(xì)胞成像分析等相關(guān)領(lǐng)域中[27]。

2.1 基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

一般的，適配體用于進(jìn)行生命進(jìn)化方面的研究。應(yīng)用SELEX技術(shù)可以方便快捷的進(jìn)行核酸方面的研究。如利用SELEX篩選核酶的特異性寡核苷酸適配體及其剪切位點(diǎn)，用于進(jìn)行生物傳感材料的集成[28]。通過(guò)適配體的生物素標(biāo)記、熒光素標(biāo)記等化學(xué)修飾，再與蛋白質(zhì)結(jié)合，也可用于蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位以及分離純化等基礎(chǔ)研究。

2.2 分析檢測(cè)領(lǐng)域

與抗體相比，適配體作為生物傳感器具有可重復(fù)利用性的優(yōu)勢(shì)，因此近年來(lái)基于適配體的生物分析模式迅猛發(fā)展。一般根據(jù)信號(hào)收集方式不同，可將適配體生物傳感器分為電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器和質(zhì)量敏感傳感器。如Li等人利用適配體修飾金電極表面，從而建立利用電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)凝血酶的方法，其檢測(cè)限可達(dá)到1pmol/L[29]；Song KM等人將適配體吸附于納米金表面，當(dāng)適配體與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合后，會(huì)從納米金表面脫離，引起納米金在鹽溶液中的聚集，溶液可由紅色變?yōu)樗{(lán)色，從而實(shí)現(xiàn)肉眼識(shí)別檢測(cè)卡那霉素，檢測(cè)限可達(dá)25nmol/L[30]。

2.3 食品安全檢測(cè)領(lǐng)域

食源性致病病菌的檢測(cè)是食品安全檢測(cè)中占比非常高的一部分，傳統(tǒng)食源性致病菌的檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)要求高、前期研發(fā)或檢測(cè)成本等弊端，適配體的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了這些常規(guī)技術(shù)的不足。一般進(jìn)行食源性致病菌的靶物質(zhì)篩選分為全細(xì)胞、表面組分以及毒素。已有較多研究對(duì)于大腸桿菌[31][32]、沙門氏菌[33-35]、金黃色葡萄球菌[36]、單增李斯特菌[37]等進(jìn)行了適配體序列的篩選。同時(shí)，也有相關(guān)報(bào)道進(jìn)行生物毒素的檢測(cè)，如Cruz-Aguado&Penner首次篩選赭曲霉毒素A（OTA）特異性適配體，并建立OTA適配體為識(shí)別模式的熒光偏振檢測(cè)技術(shù)[38]。

2.3.1 基于適配體的光學(xué)傳感器

熒光適配體生物傳感器利用熒光基團(tuán)標(biāo)記核酸適配體，當(dāng)目標(biāo)菌與適配體結(jié)合，產(chǎn)生熒光偏振或熒光強(qiáng)度的改變，進(jìn)行食源性致病菌的檢測(cè)[39][40]；或?qū)晒饣鶊F(tuán)或淬滅基團(tuán)標(biāo)記在適配體兩端，當(dāng)目標(biāo)均與適配體結(jié)合后，會(huì)引起適配體構(gòu)象發(fā)生改變，引起熒光信號(hào)差異[41]。當(dāng)探針加入納米材料氧化石墨烯后，熒光探針由于吸附在氧化石墨烯上而導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)目標(biāo)菌出現(xiàn)時(shí)，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合，使熒光信號(hào)重新激發(fā)，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測(cè)，其檢出限為102CFU/ml。利用熒光適配體生物傳感器在沙門氏菌O8[42]、單增李斯特菌[43]、金黃色葡萄球菌[44]等均已有很好應(yīng)用。

2.3.2 基于適配體的電化學(xué)傳感器

電化學(xué)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低廉[45]。將適配體與電化學(xué)活性傳感原件固定于電極上，當(dāng)加入靶物質(zhì)時(shí)，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合會(huì)導(dǎo)致電極表面修飾物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)或電流變化，即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的定性和定量檢測(cè)。目前，通過(guò)電化學(xué)傳感器檢測(cè)大腸桿菌O111[46]、大腸桿菌O55:B5[47]、葡萄球菌腸毒素B[48]等食源性致病菌或腸毒素已獲得成功。

2.3.3 基于適配體的壓電晶體傳感器

壓電晶體是一種非中心對(duì)稱晶體，在機(jī)械力夏可發(fā)生形變，帶電質(zhì)點(diǎn)發(fā)生相對(duì)位移，使晶體表面出現(xiàn)正、負(fù)束縛電荷，兩側(cè)的電勢(shì)差就可作為檢測(cè)信號(hào)。Ozalp等將能識(shí)別沙門氏菌的適配體修飾石英晶體微天平（QCM）傳感器上，當(dāng)出現(xiàn)目標(biāo)菌時(shí)，兩者結(jié)合會(huì)導(dǎo)致QCM傳感器發(fā)生形變，引起電勢(shì)差，檢出限為100CFU/ml[49]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

核酸適配體具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、親和力強(qiáng)、易于修飾等特點(diǎn)，能夠識(shí)別多種目標(biāo)物，與納米金、熒光、電化學(xué)、流式、表面增強(qiáng)拉曼等技術(shù)相結(jié)合，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，降低檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)時(shí)間，因此在食源性致病菌檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，適配體技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)相關(guān)技術(shù)依然存在適配體篩選效率低，高通量與多重同時(shí)檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)欠缺，相關(guān)儀器設(shè)備體型龐大、價(jià)格昂貴等瓶頸，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。在未來(lái)的技術(shù)發(fā)展中，對(duì)于核酸適配體的篩選可以考慮基于石墨烯技術(shù)、細(xì)胞芯片技術(shù)或高保真適配體篩選技術(shù)，從而提高適配體的篩選效率；同時(shí)在檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域，核酸適配體可與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等相結(jié)合，降低檢測(cè)食源性致病菌的檢出限。