葉燕慧，劉陽春，王東霞，趙紅磊，郭 偉

(北京市水文總站，北京 100089)

水中有機(jī)污染物種類繁多，危害性不同，其中丙烯酰胺、滅草松、2,4-滴、樂果、苦味酸、聯(lián)苯胺、五氯酚、呋喃丹、甲萘威、阿特拉津、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、對硫磷和毒死蜱為水體中常見的14種有機(jī)污染物。聯(lián)苯胺具有強(qiáng)致癌性，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為第一類致癌物[1]；丙烯酰胺被IARC列為第2類致癌物；五氯酚、樂果、對硫磷是我國水中優(yōu)先控制的污染物[2]；苦味酸為高毒類物質(zhì)；以呋喃丹、甲萘威、毒死蜱、馬拉硫磷、內(nèi)吸磷為代表的殺蟲劑和以阿特拉津、滅草松、2,4-滴等為代表的除草劑是我國使用較多的農(nóng)藥。上述14種有機(jī)污染物對人體危害性較強(qiáng)，均屬于我國現(xiàn)行國標(biāo)嚴(yán)控指標(biāo)項(xiàng)目[3-5]，并配套了相應(yīng)的檢測方法，規(guī)定了最高限值。標(biāo)準(zhǔn)中指定的測試方法需對大體積水樣富集處理后方可進(jìn)行分析，前處理過程冗長，試劑用量大，易對實(shí)驗(yàn)人員的身體健康造成危害。目前，固相萃取法已廣泛用于有機(jī)物的分離富集，雖然較液-液萃取可節(jié)省大量溶劑，提高分析效率，但仍需大量水樣富集，操作繁瑣，有時(shí)甚至可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜是一種靈敏度高，選擇性好，分析速度快的定性、定量分析方法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法已逐漸應(yīng)用于水中痕量有機(jī)污染物的測定[6-8]，其中直接進(jìn)樣法也得到了一定的應(yīng)用[9-13]。如，張明等[13]建立了直接進(jìn)樣-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法快速測定地表水中聯(lián)苯胺、苦味酸、甲萘威、阿特拉津和溴氰菊酯，該方法簡便快捷、靈敏準(zhǔn)確。目前，已逐步開展水中部分理化性質(zhì)相近化合物的多組分同時(shí)檢測研究，但不同理化性質(zhì)化合物的多組分同時(shí)檢測的分析方法還較缺乏。此外，不同極性的目標(biāo)化合物在色譜柱上的吸、脫附效率不同，在同時(shí)進(jìn)樣檢測時(shí)通常存在相互干擾的現(xiàn)象。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定有機(jī)物大多采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，為保證每種化合物的檢測靈敏度，需分時(shí)段監(jiān)測。動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(DMRM)可根據(jù)色譜分析時(shí)間對各組分保留時(shí)間窗口進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配，僅當(dāng)組分流出時(shí)才被采集。該分段方式不僅可以有效減少同時(shí)掃描不同離子對的數(shù)目，提高駐留時(shí)間、分析靈敏度和選擇性，還可有效提升實(shí)驗(yàn)分析效率，適用于多種有機(jī)物的同時(shí)檢測。閆君等[14]報(bào)道了動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，但鮮有水質(zhì)檢測方面的報(bào)道。此外，LC-MS/MS在測定標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品時(shí)對不同基質(zhì)帶來的干擾較敏感，不同基質(zhì)會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差，據(jù)文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道，選擇合適的內(nèi)標(biāo)可減少不同基質(zhì)帶來的影響。

本研究擬建立直接進(jìn)樣-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測分析方法快速測定水中14種有機(jī)污染物。同時(shí)，使用上述14種同位素內(nèi)標(biāo)，通過對比分析標(biāo)準(zhǔn)樣品與目標(biāo)樣品的保留時(shí)間和碎片離子，對目標(biāo)樣品進(jìn)行分離及鑒定，使用內(nèi)標(biāo)校正法對各分析物進(jìn)行定量測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(配備四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)、Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀(配備Mass Hunter Acquisition Software B.01.08軟件)：美國Agilent公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水機(jī)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑及材料

標(biāo)準(zhǔn)溶液：苦味酸有證標(biāo)準(zhǔn)溶液、13種混合有證標(biāo)準(zhǔn)溶液(丙烯酰胺、滅草松、2,4-滴、樂果、聯(lián)苯胺、五氯酚、呋喃丹、甲萘威、阿特拉津、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、對硫磷、毒死蜱)，濃度為100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司產(chǎn)品。

內(nèi)標(biāo)溶液：14種混合內(nèi)標(biāo)溶液(丙烯酰胺-D3、滅草松-D7、2,4-滴-13C6、樂果-D6、2,4-二硝基苯酚-D3、聯(lián)苯胺-D8、五氯酚-13C6、呋喃丹-D3、甲萘威-D7、阿特拉津-D5、內(nèi)吸磷-S-甲基、馬拉硫磷-D6、對硫磷-D10、毒死蜱-D10)，濃度為100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司產(chǎn)品。

主要試劑：乙腈(色譜純)，迪馬科技公司產(chǎn)品；乙酸銨(色譜純)，德國Merck公司產(chǎn)品；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別移取100 μL 13種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μL苦味酸單標(biāo)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的14種混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：移取100 μL 14種混合內(nèi)標(biāo)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的14種混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別移取5、10、20、50、100、200、500、600、700、1 000 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和200 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用水定容，得到0.5、1、2、5、10、20、50、60、70、100 μg/L 14種有機(jī)污染物的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為20 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 水樣采集與制備

按照HJ 164—2020[17]和HJ 493—2009[18]的相關(guān)規(guī)定采集和保存樣品。用棕色玻璃瓶采集，當(dāng)水樣充滿采樣瓶加蓋密封，4 ℃避光保存。水樣經(jīng)0.22 μm尼龍66濾膜過濾后，取1 mL置于棕色樣品瓶，加入20 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，混勻后進(jìn)樣分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min(95%A)，0.5～3 min(95%～75%A)，3～15 min(75%～35%A)，15～20 min(35%～1%A)，20～22 min( 1%A)，22.01～25 min(95%A)。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI±)；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式；干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力276 kPa；毛細(xì)管電壓3 500 V；質(zhì)譜參數(shù)列于表1。14種有機(jī)污染物的MRM色譜圖示于圖1。

表1 14種有機(jī)污染物及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions of 14 organic pollutants and isotope internal standards

圖1 14種有機(jī)污染物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖(0.5 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solution of 14 organic pollutants (0.5 μg/L)

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Mass Hunter Qualitative Analysis和Quantitative Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的定性、定量處理，以樣品的保留時(shí)間和定性/定量離子的相對豐度定性，根據(jù)定量離子的峰面積采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1稀釋液優(yōu)化 通常，液相色譜在分離過程中存在“溶劑效應(yīng)”，如果稀釋液選擇不合適，將影響色譜保留，導(dǎo)致色譜峰形異常，同時(shí)還會(huì)影響待測物的電噴霧電離效果，進(jìn)而影響檢測靈敏度?；诖?，本研究分別以100%乙腈、50%乙腈-水溶液和純水為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成20 μg/L稀釋液進(jìn)樣分析，觀察色譜峰形和分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著稀釋液中乙腈含量的增加，尤其是在純乙腈體系中，滅草松、樂果、聯(lián)苯胺、苦味酸等目標(biāo)物及其內(nèi)標(biāo)物的色譜峰出現(xiàn)前沿峰；而使用純水作為稀釋液時(shí)，所得的色譜峰峰形對稱且尖銳；其原因在于乙腈體系中樣品與初始流動(dòng)相的極性相差較大，存在強(qiáng)烈的“溶劑效應(yīng)”，導(dǎo)致對目標(biāo)物的洗脫效果和峰形都較差。因此，為消除由于“溶劑效應(yīng)”引入的系統(tǒng)誤差，同時(shí)與待測實(shí)際水樣中的溶劑條件保持一致，本實(shí)驗(yàn)選擇純水作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液。

2.1.2色譜條件優(yōu)化 色譜柱的選擇對于樣品的分離非常重要，為確保各化合物在色譜柱上有較好的保留和分離效果，比較了Poroshell 120 EC-C18柱(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)、Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)和Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)對14種有機(jī)污染物的分離效果。結(jié)果表明，使用Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)時(shí)，流動(dòng)相流量較大，與電噴霧離子化方式不匹配，導(dǎo)致離子化效率降低，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度較低。相對于Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)，Poroshell 120 EC-C18柱對各化合物具有較好的分離效果及峰形，原因在于該色譜柱裝填了一種具有實(shí)心核和多孔外殼的表面多孔型填料，由于分析物在多孔外殼內(nèi)外擴(kuò)散速度更快，并具有非常均勻的填充柱床，所以這種色譜柱能夠在2.7 μm填料的柱壓下提供與亞2 μm填料相當(dāng)?shù)闹?，并且能夠降低操作壓力、改善峰形，適用于優(yōu)化UPLC性能。因此，選用Poroshell 120 EC-C18色譜柱作為本實(shí)驗(yàn)的分析柱。

由于電噴霧質(zhì)譜需在溶液狀態(tài)下電離目標(biāo)化合物，因此，流動(dòng)相的選擇要兼顧各目標(biāo)化合物的色譜分離效果及質(zhì)譜離子化效率。甲醇作為流動(dòng)相存在共流出現(xiàn)象，信號之間相互干擾；相較而言，乙腈體系能夠控制超高效液相色譜的系統(tǒng)壓力，并獲得較好的分離效果。本文分別考察乙腈-0.1%甲酸和乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)14種有機(jī)物的分離效果。結(jié)果表明：選用0.1%甲酸能增加阿特拉津和甲萘威等化合物的響應(yīng)值，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致聯(lián)苯胺等化合物的色譜峰變形；選用5 mmol/L乙酸銨能明顯改善各物質(zhì)的峰形，大部分目標(biāo)物的離子化效率高且峰形對稱。綜合考慮，最終選用乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。

在梯度洗脫條件中，起始流動(dòng)相通常采用高比例水相，有助于目標(biāo)物與環(huán)境基體物質(zhì)的分離，防止基質(zhì)效應(yīng)。本文以5 mmol/L乙酸銨水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，比較方案1(0～0.5 min(95%A)，0.5～20 min(95%～1%A)，20～22 min(1%A)，22.01～25 min(95%A))和方案2(0～0.5 min(95%A)，0.5～3 min(95%～75%A)，3～15 min(75%～35%A)，15～20 min(35%～1%A)，20～22 min(1%A)，22.01～25 min(95%A))兩種梯度條件下的分離效果。結(jié)果表明，方案1的色譜峰出峰時(shí)間集中在3～20 min，由于該區(qū)間化合物的結(jié)構(gòu)和極性類似，各化合物的化學(xué)性質(zhì)和色譜行為可能導(dǎo)致一些目標(biāo)化合物出現(xiàn)共流出峰，進(jìn)而影響峰形及其分離效果，使信號響應(yīng)降低；方案2通過增加梯度，并放緩3～20 min梯度，各化合物依次出峰，分離效果好，色譜峰峰形良好，有助于提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，故選方案2作為最佳梯度洗脫條件。

2.1.3質(zhì)譜條件優(yōu)化 根據(jù)各化合物的分子結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)電離性質(zhì)，選擇ESI源正、負(fù)離子模式分析?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中含羧基類的酸性化合物容易失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，一般采用負(fù)離子模式；化學(xué)結(jié)構(gòu)中含氮的堿性化合物容易加和質(zhì)子帶正電荷，一般采用正離子模式。本研究中，苦味酸、滅草松、2，4-滴、五氯酚采用負(fù)離子模式檢測，丙烯酰胺等10種化合物采用正離子模式檢測。

不分段采集方式中多個(gè)MRM重疊會(huì)使靈敏度降低，而分段采集方式易降低分析方法通量?；诖?，本研究采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，按目標(biāo)物保留時(shí)間設(shè)置監(jiān)測離子掃描時(shí)間窗口，在不同時(shí)間段分別進(jìn)行MRM掃描，以增加窗口期目標(biāo)離子的掃描頻率。該模式可提高質(zhì)譜信號響應(yīng)強(qiáng)度，增強(qiáng)質(zhì)譜測定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，適合多種化合物的同時(shí)檢測。

綜上，本文采用正、負(fù)離子模式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，優(yōu)化后的離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)列于表1。對14種有機(jī)污染物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)按照1.5節(jié)條件進(jìn)樣分析，14種有機(jī)污染物均有良好的響應(yīng)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 目前，水中有機(jī)物的定量分析多采用外標(biāo)法[19-21]，但存在測定儀器、樣品基質(zhì)帶來的誤差。本研究通過在水樣中加入14種同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正，可有效避免誤差，提高分析準(zhǔn)確度，此外，還可通過內(nèi)標(biāo)物的峰形、峰面積監(jiān)測樣品與儀器的運(yùn)行狀態(tài)是否正常，同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物之間的對應(yīng)關(guān)系列于表1。

按優(yōu)化后的檢測條件將14種化合物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣測定，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(待測物峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積)為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖2，各化合物的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)列于表2。結(jié)果表明，各化合物在較寬的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上。

圖2 水中14種有機(jī)污染物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of 14 organic pollutants in water

表2 水中14種有機(jī)污染物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和標(biāo)準(zhǔn)限值Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), LODs, LOQs and standard limits of the 14 organic pollutants in water

2.2.2檢出限與定量限 配制低濃度水平的14種待測物，以分子離子對的信噪比S/N≥3對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的定量限(LOQ)，列于表2。14種待測物的LOD為0.01～0.05 μg/L，LOQ為0.05～0.10 μg/L，明顯低于國家規(guī)定的濃度限值[3-5]，能夠滿足直接進(jìn)樣測定地表水、地下水和生活飲用水中14種有機(jī)污染物的檢測要求。

2.2.3加標(biāo)回收率與精密度 選用不含14種待測組分的地表水、地下水和生活飲用水樣品，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為1、50、90 μg/L的水樣，每個(gè)濃度水平平行測定6次，分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，測定加標(biāo)回收率及精密度，結(jié)果列于表3?？梢?，在不同水體中，3個(gè)加標(biāo)水平下14種有機(jī)污染物的平均回收率為77.9%～114%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%～14.1%，方法的準(zhǔn)確性和精密度較好，能夠滿足環(huán)境監(jiān)測質(zhì)量控制要求。

表3 3個(gè)加標(biāo)水平下，14種有機(jī)污染物的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 14 organic pollutants at three spiked levels (n=6)

續(xù)表3

2.3 實(shí)際樣品測定

采集北京城區(qū)地表水、地下水、生活飲用水3份水樣，經(jīng)濾膜過濾后加入內(nèi)標(biāo)，采用本方法對實(shí)際樣品進(jìn)行分析檢測，結(jié)果在地表水樣中檢出了阿特拉津，其濃度為0.689 μg/L，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的濃度限值(3 μg/L)[3]，示于圖3，其余有機(jī)污染物均未檢出。

圖3 陽性地表水樣品中阿特拉津的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of atrazine in a positive surface water sample

3 結(jié)論

本文建立了一種基于電噴霧電離源正、負(fù)離子掃描，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測、同位素內(nèi)標(biāo)定量分析的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，用于測定水中14種有機(jī)污染物。該方法無需對水樣富集，操作簡便快速、靈敏度高，方法精密度和加標(biāo)回收率能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制要求和限量檢測要求，可為大批量同時(shí)快速檢測地表水、地下水和生活飲用水中14種有機(jī)污染物提供技術(shù)參考。