徐建立，孫艷華，李 明，董 路，孟小晶

(滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061001)

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅患者的身心健康[1]。結(jié)腸癌早期沒有明顯癥狀，中晚期才逐漸出現(xiàn)腹脹、消化不良、腹痛、黏液便或黏血便等癥狀[2]。因此，結(jié)腸癌一經(jīng)診斷往往是中晚期。目前，結(jié)腸癌的臨床治療主要包括傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療以及新興的靶向治療和免疫治療等[3]。新藥物的應(yīng)用以及治療策略的更新一定程度延長了患者的生存周期，但結(jié)腸癌患者經(jīng)過一段時間治療后通常會出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗[4]。

中藥紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，別名紫丹、地血、山紫草等[5]。紫草性味甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，主要用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等[5]。紫草的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括萘醌類、苯醌類、苯酚及酚酸類等[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫草具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、清熱、止血、降血糖等廣泛的藥理作用[6]。萘醌衍生物在紫草中含量較高，其中以紫草素相關(guān)研究最為廣泛。研究顯示，紫草素在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，如大腸癌、睪丸癌、胰腺癌等[7-9]。但紫草素在結(jié)腸癌細胞耐藥中的作用尚不清楚。本研究以結(jié)腸癌HT-29細胞為研究對象，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouraci，5-FU)誘導(dǎo)耐藥細胞HT-29/DR，觀察紫草素在HT-29/DR細胞耐藥中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞系：人結(jié)腸癌HT-29細胞，購自上海生物工程研究所。

1.1.2 實驗試劑：5-FU(批號44825，美國MCE公司)；DMEM培養(yǎng)基(批號8120033、2132094P)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號SUELN，青島思科捷公司)；FAK抗體、Src抗體、Fibronectin抗體(批號C2332、C1521、A2521，美國圣克魯斯公司)；E-cadherin抗體、p-Src抗體、p-FAK抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體、羊抗小鼠IgG-HRP(批號15、3、8、28、33，美國CST公司)；GAPDH抗體(批號M29D22，南京巴傲得公司)；PBS、0.1%結(jié)晶紫染色液、總蛋白提取試劑盒、MTT試劑盒及RIPA細胞裂解液(北京索萊寶公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.1.3 實驗儀器：全波長酶標儀(型號Multiskan SkyHigh，美國Thermo Scientific公司)；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)(型號Tanon3500，上海天能公司)；倒置顯微鏡(型號CKX53，日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：采用90%的DMEM、10%胎牛血清、1%青-鏈霉素制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞。實驗用細胞培養(yǎng)時置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 HT-29/5-FU細胞構(gòu)建：將HT-29細胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿中，用起始濃度為0.01 μmol/L的5-FU處理細胞直至生長穩(wěn)定。傳代2～3次，提高5-FU濃度(每次提高0.01 μmol/L)處理HT-29細胞直至生長穩(wěn)定。繼續(xù)傳代2～3次，按上述操作提高5-FU濃度直至4.5 μmol/L，當(dāng)細胞穩(wěn)定生長后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：將生長至對數(shù)期的HT-29/5-FU、HT-29細胞接種于96孔板，每孔8000個細胞左右。按照需要加入適量紫草素處理24 h，必要時加入0～200 μmol/L 5-FU繼續(xù)處理24 h。處理結(jié)束后每孔加入100 μl的MTT于培養(yǎng)箱孵育4 h。取出細胞，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為150 μl的DMSO，于酶標儀檢測OD值。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆能力：將HT-29和HT-29/5-FU細胞以每孔300個傳代至6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，各加入含5 μmol/L5-FU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 d。棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS洗2遍，加入0.1%結(jié)晶紫染色液靜置10 min，清水洗2遍。用相機拍照記錄。

1.2.5 蛋白印跡實驗檢測p-Src、p-FAK、E-cadherin和Fibronectin蛋白表達：將處理好的細胞收集于5 ml離心管，1000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入1 ml的PBS重懸。將細胞轉(zhuǎn)移至1 ml的EP管，1000 r/min離心5 min，棄去廢液。將細胞置于冰上，加入RIPA細胞裂解液裂解10 min，12000 r/min離心20 min，上清液即為總蛋白。取2 μl總蛋白以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，而后以蛋白上樣緩沖液制備蛋白濃度為2.5 μg/μl的蛋白樣品，100 ℃變性5 min。變性好的蛋白樣品以10%的SDS-PAGE電泳進行分離，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，用p-Src(1∶1000)、Src(1∶2000)、FAK(1∶1000)、p-FAK(1∶500)、Fibronectin(1∶500)、E-cadherin(1∶2000)或GAPDH(1∶1000)抗體于4 ℃搖床孵育過夜，次日TBST洗3遍，孵育羊抗兔/鼠IgG-HRP二抗，TBST洗3遍，PVDF膜淋ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，置于凝膠成像儀下顯影，讀取相應(yīng)蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 5-FU耐藥HT-29細胞驗證 采用直接增加5-FU濃度，梯度誘導(dǎo)的方法成功構(gòu)建5-FU耐藥結(jié)腸癌細胞HT-29/5-FU，5-FU處理后HT-29和HT-29/5-FU細胞存活率，見表1。經(jīng)計算，HT-29/5-FU耐藥指數(shù)為6.5?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，5-FU處理后HT-29細胞克隆形成率為100%，HT-29/5-FU細胞為(382.6±36.1)%；與HT-29細胞比較，HT-29/5-FU細胞克隆形成率較高，兩種細胞的克隆形成率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示HT-29/5-FU構(gòu)建成功(圖1)。

表1 不同濃度5-FU對HT-29和HT-29/5-FU細胞存活率影響

圖1 5-FU對HT-29、HT-29/5-FU細胞克隆形成的影響

2.2 紫草素對HT-29/5-FU、HT-29細胞增殖的影響 MTT結(jié)果(圖2)顯示，紫草素處理后HT-29/5-FU和HT-29細胞的存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。0.05～1 μmol/L紫草素對HT-29/5-FU和HT-29細胞存活率的影響與溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；5 μmol/L紫草素組、10 μmol/L紫草素組均可降低兩種細胞的存活率，與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。為排除紫草素對細胞增殖的影響，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素進行后續(xù)研究。

注：與溶劑對照組比較，*P<0.01

2.3 紫草素對HT-29/5-FU細胞5-FU耐藥的影響 MTT結(jié)果(圖3)顯示，5-FU對溶劑對照組、0.1 μmol/L紫草素組、0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組HT-29/5-FU細胞的IC50分別為(112.8±12.3)、(91.4±10.6)、(51.2±5.5)、(26.6±3.1)μmol/L。與溶劑對照組比較，0.5 μmol/L紫草素組和1 μmol/L紫草素組的IC50水平均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示紫草素能緩解HT-29/5-FU細胞對5-FU耐藥。

注：與溶劑對照組比較，*P<0.01

2.4 各組HT-29/5-FU細胞Src和FAK磷酸化蛋白表達比較 見表2(圖4)。蛋白印跡結(jié)果顯示，與溶劑對照組比較，0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組的HT-29/5-FU細胞p-Src和p-FAK蛋白表達均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組HT-29/5-FU細胞Src和FAK磷酸化蛋白表達比較(%)

圖4 各組HT-29/5-FU細胞Src和FAK磷酸化蛋白表達電泳圖

2.5 各組HT-29/5-FU細胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達比較 見表3(圖5)。蛋白印跡結(jié)果顯示，與溶劑對照組比較，0.5 μmol/L紫草素組、1 μmol/L紫草素組HT-29/5-FU細胞E-cadherin蛋白表達均高，F(xiàn)ibronectin蛋白表達均低，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組HT-29/5-FU細胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達比較(%)

圖5 各組HT-29/5-FU細胞Fibronectin和E-cadherin蛋白表達電泳圖

3 討 論

中藥是中醫(yī)體系的重要組成部分[10]。相對于西藥，中藥的化合物組成成分多樣，難以解釋其具體作用機制[11]。從中藥中提取的單體化合物具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，較易研究單體化合物發(fā)揮藥效的潛在作用機制。因此，深入研究中藥單體化合物的作用機制，有利于豐富中藥的理論體系，為中醫(yī)治療提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。大量研究顯示，一些中藥單體化合物在抵抗腫瘤對化療藥物耐藥方面具有積極作用。中藥三七的活性成分三七總皂苷具有活血祛瘀，通脈活絡(luò)的功效。馮曉異等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷在逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對阿霉素耐藥方面發(fā)揮一定作用，其可通過抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/蛋白激酶B信號通路介導(dǎo)多藥耐藥基因1表達下調(diào),進而提高阿霉素在耐藥細胞中累積。欖香烯是從重要莪術(shù)中提取分離的倍半萜烯類化合物。研究顯示，欖香烯參與肺癌細胞順鉑耐藥，其可誘導(dǎo)順鉑耐藥的SPC-A-1細胞自噬，從而介導(dǎo)耐藥細胞對順鉑的敏感性增強[13]。槲皮素作為廣泛分布于多種中草藥中的黃酮醇類化合物，被證實在抑制膀胱癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。翁旭東等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能上調(diào)順鉑耐藥膀胱癌細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim的表達水平，Bim通過與Bax蛋白結(jié)合誘導(dǎo)細胞色素C釋放，從而觸發(fā)胱天蛋白酶介導(dǎo)的細胞凋亡，最終增強順鉑對膀胱癌細胞的殺傷作用。這些研究表明，研究中藥提取物在惡性腫瘤化療藥物耐藥中的作用，對于中西醫(yī)臨床治療具有重要理論價值和指導(dǎo)意義。

中藥紫草具有涼血、活血、解毒、清熱、透疹的作用，常應(yīng)用于濕熱斑疹、黃疸、熱結(jié)便秘、丹毒、瘡瘍、淋病等疾病。歷代古籍對紫草功用的記載各有側(cè)重，《本經(jīng)》：“主心腹邪氣，五疸，補中益氣，利九竅，通水道。”《別錄》：“療腹腫脹滿痛，以合膏，療小兒瘡及面齄。”《本草圖經(jīng)》：“治傷寒時疾，發(fā)瘡疹不出者，以此作藥，使其發(fā)出?！薄侗静菥V目》：“紫草，其功長于涼血活血，利大小腸。故痘疹欲出未出，血熱毒盛，大便閉澀者宜用之，已出而紫黑便閉者亦可用。若已出而紅活，及大陷大便利者，切宜忌之?！薄侗静萁?jīng)疏》：“紫草為涼血之要藥，故主心腹邪熱之氣。五疸者，濕熱在脾胃所成，去濕除熱利竅，其疸自愈。邪熱在內(nèi)，能損中氣，邪熱散即能補中益氣矣?？嗪曰?，故利九竅而通水道也。腹腫脹滿痛者，濕熱解而小便出，則前癥自除也。合膏藥療小兒痘瘡及面齄，皆涼血之效也?！弊喜菟厥菑闹兴幾喜葜刑崛〉妮刘苌铮哂袕V泛的藥理作用。研究顯示，紫草素可通過靶向Cdc25s蛋白誘導(dǎo)乳腺癌細胞周期阻滯，進而抑制細胞增殖[15]。另有研究顯示，紫草素通過AKT/mTOR和ROS/ERK1/2通路降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達，從而抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移[16]。最近研究報道顯示，紫草素可通過同時抑制ADAM17和IL-6/STAT3信號通路，協(xié)同抑制結(jié)腸癌細胞生長[17]。以上均提示，紫草素能通過多種信號機制發(fā)揮抗癌作用。但紫草素是否在結(jié)腸癌細胞化療耐藥中發(fā)揮作用尚不清楚。為觀察紫草素在結(jié)腸癌細胞5-FU耐藥中的作用，本研究采用直接增加5-FU藥物濃度，梯度誘導(dǎo)的方法構(gòu)建5-FU耐藥結(jié)腸癌細胞HT-29/5-FU，耐藥指數(shù)為6.5?？寺⌒纬蓪嶒烌炞C發(fā)現(xiàn)，5-FU處理后HT-29/5-FU細胞克隆形成能力明顯增強，提示HT-29/5-FU構(gòu)建成功。本研究首先觀察紫草素對HT-29和HT-29/5-FU細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05～1 μmol/L紫草素對HT-29/5-FU和HT-29細胞存活率無明顯影響，而1～10 μmol/L紫草素顯著抑制兩種細胞增殖。為排除紫草素對細胞增殖的影響，采用0.1、0.5、1 μmol/L紫草素進行后續(xù)研究。進一步研究發(fā)現(xiàn)，5-FU對0.5、1 μmol/L紫草素處理的HT-29/5-FU細胞IC50顯著降低，提示紫草素可增強HT-29/5-FU細胞對5-FU的抵抗作用。分子研究發(fā)現(xiàn)，0.5、1 μmol/L紫草素可抑制HT-29/5-FU細胞Src和FAK磷酸化蛋白表達。FAK-Src信號通路在惡性腫瘤細胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。研究顯示，Ⅳ型膠原α1鏈通過激活FAK-Src信號通路促進肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)FAK-Src信號通路可介導(dǎo)lncRNA KCNQ1OT1誘導(dǎo)的舌癌細胞增殖和順鉑耐藥。研究顯示，ASPP2蛋白通過抑制肝癌細胞Src/FAK/Snail信號軸抑制干細胞樣特征和化療藥物抗性[20]。以上提示，紫草素可能通過抑制Src-FAK信號通路抑制HT-29/5-FU細胞對5-FU耐藥。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程[21-22]。在腫瘤細胞中，EMT的發(fā)生往往導(dǎo)致細胞惡性生物學(xué)行為增強[22]。為了探討EMT是否參與紫草素抵抗結(jié)腸癌細胞5-FU耐藥，觀察了紫草素對HT-29/5-FU細胞EMT標志物的影響。E-cadherin和Fibronectin蛋白分別為公認的上皮細胞標志物和間質(zhì)細胞標志物，E-cadherin蛋白表達下調(diào)和Fibronectin蛋白表達上調(diào)通常提示細胞發(fā)生EMT[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5、1 μmol/L紫草素可誘導(dǎo)HT-29/5-FU細胞上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達上調(diào)，間質(zhì)細胞標志物Fibronectin蛋白表達下調(diào)，提示紫草素能抑制HT-29/5-FU細胞EMT狀態(tài)。研究顯示，Src-FAK信號通路參與膀胱癌細胞EMT，BSA結(jié)合對甲酚硫酸鹽通過ROS/Src/FAK信號通路觸發(fā)膀胱癌細胞遷移和EMT[24]。Src-FAK信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞EMT從而維持細胞耐藥。研究報道，Src-FAK信號通路可介導(dǎo)非小細胞肺癌EMT相關(guān)的厄洛替尼耐藥[25]。

綜上，紫草素可能通過抑制Src-FAK通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化緩解結(jié)腸癌細胞5-FU耐藥，但紫草素抑制Src-FAK信號通路的具體作用機制需進一步深入研究。值得注意的是腫瘤具有異質(zhì)性，紫草素是否在其他惡性腫瘤中能夠發(fā)揮類似作用還不清楚?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)了紫草素抵抗結(jié)腸癌細胞5-FU化療耐藥的潛在作用和機制，為臨床治療結(jié)腸癌化療耐藥提供了一定的實驗支持。