冷 鳳，史 玲，劉麗莉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355；2.威海市中醫(yī)院，山東 威海 264200)

腦卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)主要臨床表現(xiàn)為焦慮、乏力、睡眠障礙等，是腦卒中后常見的情感障礙綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近30%的腦卒中患者并發(fā)抑郁癥[1]。目前，PSD發(fā)病機制仍不明確，研究顯示PSD發(fā)病與免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)[2-3]。研究指出，PSD發(fā)病時，患者體內(nèi)常會出現(xiàn)炎癥因子異常表達現(xiàn)象，而p38MAPK/NF-κB能夠抑制炎癥因子釋放，調(diào)控細胞損傷并干預(yù)PSD發(fā)病，但具體機制不明[4-5]。中醫(yī)學(xué)將PSD歸屬于“中風(fēng)”“情志病”“郁癥”等范疇。中風(fēng)患者主要表現(xiàn)為氣血不和，中氣逆亂，氣機郁滯，陰陽失和，形成濕痰、血瘀等病理產(chǎn)物痹阻脈絡(luò)，上擾腦竅。針刺作為中醫(yī)學(xué)常用治療手段，在治療腦卒中后抑郁中具有適應(yīng)范圍廣、不良反應(yīng)少、方便快捷等優(yōu)點。多項研究表明，針刺能夠改善PAD大鼠的記憶學(xué)習(xí)功能，調(diào)控組織內(nèi)多種免疫因子釋放，干預(yù)細胞凋亡，但針刺是否通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB信號通路影響PSD發(fā)病則鮮有報道[6-7]。本實驗研究通過建立PSD大鼠模型，并對成功造模的大鼠予針刺干預(yù)，刺激百會、大椎、內(nèi)關(guān)、太沖穴，觀察腦組織變化，旨在探究針刺對PSD大鼠p38MAPK/NF-κB信號通路的影響，并分析其對細胞損傷的保護機制及對炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：48只SPF級雄性Wistar大鼠購自山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)證號SCXK(魯)2020-0001，3月齡，平均體重(200±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。本實驗研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑及儀器：本次實驗中涉及的主要實驗試劑、儀器有鹽酸氟西汀分散片(規(guī)格20 mg/片，批號J20200002)；水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑廠)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。纖毛機械刺激針(美國Stoelting Co公司)，HANS-200A電針儀(南京濟生生物科技公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、建模及干預(yù)：按隨機數(shù)字表法將48只大鼠分為空白組、模型組、氟西汀組及針刺組，每組12只。除空白組外，其他三組大鼠均按照文獻[8]采用KoiZumi法建立PSD大鼠模型。具體方法如下：7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，正頸部偏右側(cè)備皮，分離頸部肌肉后暴露大鼠氣管，從氣管右下側(cè)動脈處分離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，手術(shù)線結(jié)扎固定后縫合消毒。術(shù)后24 h測定神經(jīng)功能缺損評分，取評分1～3分的大鼠進行慢性不可預(yù)見性溫和刺激(CUMS)+單籠孤養(yǎng)法建立PSD大鼠模型。本次實驗36只大鼠均成功造模。氟西汀組大鼠予2.33 mg/(kg·d)氟西汀溶液灌胃；空白組和模型組大鼠予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d；針刺組將大鼠置于自制鼠袋并固定大鼠，參照《實驗針灸學(xué)》[9]，將毫針刺入百會、大椎、內(nèi)關(guān)、太沖穴后，接電針儀，刺激強度2 mA，疏密波，2 Hz/100 Hz，15 min/次，1次/d，共治療14 d。

1.2.2 ELISA法檢測免疫因子指標：大鼠心臟取血2 ml，置于離心半徑10 cm的離心機內(nèi)，2500 r/min，離心15 min，取上清液，ELISA法檢測各組大鼠血清5-羥色胺(5-Hydroxyteyptamine,5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-Hydroxyindole acetic acid, 5-HIAA)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)、白介素-1β受體(Interleukin-1 β receptor，IL-1βR)水平。

1.2.3 HE染色檢測海馬組織病理形態(tài)：取各組大鼠部分海馬組織，多聚甲醛固定，脫水，制作石蠟切片，脫蠟、染色，鹽酸酒精分化后氨水返藍再使用0.5%伊紅液染色，常規(guī)脫水，應(yīng)用二甲苯透明后樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬組織細胞損傷情況。

1.2.4 TUNEL法檢測海馬組織細胞凋亡：取各組大鼠海馬部分組織置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，乙醇脫水后切片，脫蠟再置于蘇木精中進行染色及脫水透明，TUNEL試劑盒檢測各組大鼠海馬組織細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot法檢測海馬組織NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表達：取各組大鼠部分海馬組織，加入RIPA裂解緩沖液放置冰上30 min，提取海馬組織總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒檢測各組海馬組織蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE將蛋白等量分離后移至PDVF膜上，4 ℃添加一抗與二抗，常溫下孵育后ECL試劑顯影并分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠免疫因子指標比較 見表1。與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平升高，5-HT、5-HIAA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。干預(yù)后，與模型組大鼠比較，氟西汀組、針刺組大鼠TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平較低，而5-HT、5-HIAA水平均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠免疫因子指標比較(μg/L)

2.2 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果提示，空白組大鼠海馬組織細胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊；模型組大鼠海馬組織細胞核萎縮，染色變深，細胞形態(tài)呈不規(guī)則變化，排列不整齊；氟西汀組及針刺組大鼠海馬組織細胞核趨向完整，萎縮減輕，多數(shù)細胞形態(tài)規(guī)則且整齊(圖1)。

圖1 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠海馬組織細胞凋亡情況比較 TUNEL染色中藍色熒光為正常細胞核，綠色熒光為細胞凋亡情況。激光共聚焦顯示，空白組大鼠海馬組織正常，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多。干預(yù)治療后，氟西汀組及針刺組大鼠海馬組織細胞綠色熒光減少，提示細胞凋亡情況明顯減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠海馬組織細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.4 各組大鼠海馬組織中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表達量比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠海馬組織中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表達量均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，干預(yù)后，氟西汀組和針刺組大鼠海馬組織中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表達量均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織中NF-κB p65、TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白表達量比較

3 討 論

中醫(yī)認為，PSD的辨證論治應(yīng)從腦、肝、腎等臟腑入手。《內(nèi)經(jīng)》指出：肝主情志，肝失疏泄，則情志失養(yǎng)，久之則肝氣郁結(jié)，痰瘀互結(jié)阻塞腦竅；腎藏精，主納氣，腎氣不足，無法生精化髓，腦失充養(yǎng)，則神明失用，從而導(dǎo)致卒中后抑郁發(fā)生，表現(xiàn)為情志低落，記憶下降，神情呆滯，說明卒中后抑郁的發(fā)生與正氣不足，肝腎失養(yǎng)等有關(guān)?！毒霸廊珪分杏小坝糇C”一說：“內(nèi)傷積損，頹敗而然……若憂郁病者則屬大虛，本無邪實”認為內(nèi)傷情志導(dǎo)致抑郁，辨證本病時多從腦、肝、腎等入手?！夺t(yī)林改錯》中王清任認為：“元氣虛，則不能達于血管，血管無氣，必停留而生瘀”治療該病時應(yīng)以益氣活血為主。研究指出，針刺能有效改善睡眠障礙，減少抑郁情緒，但具體機制尚不明確[10]。《靈樞·海論》曰：“夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于臟腑，外絡(luò)于肢節(jié)。”經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)和、通暢是人體氣血正常運行的基礎(chǔ)。針刺作為一種非藥物的療法，標本兼顧，氣血同治，調(diào)和陰陽，是多層次、多通道、多靶點的綜合治療，具有疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，平衡陰陽的作用。針刺穴位可供氣進入、傳出、交匯和聚積，臨床上治療神志病常選用“百會穴”“大椎穴”“內(nèi)關(guān)穴”“太沖穴”等，且這些穴位在抑郁癥的治療中應(yīng)用較多。現(xiàn)代研究指出，針刺治療可有效改變中樞神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，干預(yù)外周迷走神經(jīng)，從而有效改善組織內(nèi)免疫細胞表達，提高機體免疫力；而且針刺能夠調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞釋放組胺酶，緩解免疫細胞過度表達對細胞的損傷[11-12]。肖偉等[13]采用針刺百會穴聯(lián)合安神解郁湯治療腦卒中后抑郁，結(jié)果表明這種治療方案能夠明顯改善患者癥狀，提高日常生活能力及改善神經(jīng)功能缺損程度。韓振翔等[14]研究認為，電針刺激大鼠“百會穴”“大椎穴”能顯著改善腦卒中后抑郁模型大鼠腦神經(jīng)細胞γ-氨基丁酸、血管內(nèi)皮生長因子表達，改善腦卒中后抑郁模型大鼠抑郁癥狀。Wang等[15]研究認為，電針太沖穴等能夠明顯改善腦卒中后抑郁模型大鼠的行為學(xué)指標，影響神經(jīng)元的生存、發(fā)育及功能，且能夠調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子以及蛋白激酶類家族B蛋白的表達。

大腦皮質(zhì)與人的情緒變化密切相關(guān)，是大腦重要的情感中樞。海馬區(qū)是大腦皮質(zhì)的一個內(nèi)褶區(qū)，抑郁癥患者以海馬區(qū)為主的邊緣結(jié)構(gòu)可發(fā)生神經(jīng)減退、體積萎縮等病理現(xiàn)象[13]。PSD發(fā)病過程中免疫因子代謝異常起關(guān)鍵作用，而腦神經(jīng)元和機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與免疫因子分泌密切相關(guān)[14-15]。5-HT活性改變參與抑郁癥的發(fā)病，免疫細胞因子水平升高可引起大腦內(nèi)吲哚胺-2，3-雙加氧酶升高，導(dǎo)致海馬組織內(nèi)5-HT水平下降，從而誘發(fā)抑郁癥。免疫改變在PSD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，是修復(fù)受損海馬組織以保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要生理反應(yīng)，而p38MAPK/NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一[16]。p38MAPK是一類分化上保守的蛋白因子，參與調(diào)控基因表達，代謝活動以及細胞凋亡和分化活動[17]。NF-κB是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，其參與機體多種細胞凋亡的防御和保護過程，NF-κB二聚體通過暴露出核定位序列，進而與目的基因發(fā)生特異性結(jié)合，觸發(fā)組織氧化應(yīng)激，活化炎癥因子及炎癥反應(yīng)，參與大腦、間腦、小腦和腦干的病理生理過程，成為各種腦部疾病的致病媒介[18-19]。非磷酸化狀態(tài)的p38無活性，當被各種應(yīng)激因素或炎癥因子刺激時，p38結(jié)合到MAPK/NF-κB信號通路釋放的信號因子，激活相應(yīng)炎癥通路。NF-κB p65及p38MAPK活化過程能夠結(jié)合促凋亡蛋白以及炎癥受體蛋白等多種炎癥反應(yīng)底物，通過調(diào)控特異性細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子表達，誘導(dǎo)組織中細胞分化與凋亡，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，減緩細胞損傷進程[20-22]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，造模后PSD模型組大鼠血清TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平升高，5-HT、5-HIAA水平降低，表明造模后PSD大鼠血清炎癥因子發(fā)生改變，這與PSD發(fā)病機制吻合。與模型組大鼠比較，氟西汀組、針刺組大鼠5-HT、5-HIAA、TNF-α、TRAF6和IL-1βR水平在治療干預(yù)后均改善，這與既往研究結(jié)果一致[23-24]。本研究結(jié)果提示，針刺干預(yù)治療能夠有效調(diào)節(jié)PSD大鼠p38MAPK/NF-κB信號通路表達，干預(yù)PSD大鼠體內(nèi)細胞凋亡及炎癥因子表達。