趙凡玉，周婷，黃江，張會(huì)婷，龍莉玲*

1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院放射科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，廣西 南寧 530021；3.西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司磁共振事業(yè)部，湖北 武漢 430071；*通信作者 龍莉玲 cjr.longliling@vip.163.com

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球最常見的慢性肝病[1]，包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化等不同程度的肝臟損害，早期診斷和及時(shí)干預(yù)可以阻止甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，若不及時(shí)治療，可導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化等[2]。目前，MRI是定量評(píng)估肝脂肪變性無創(chuàng)、準(zhǔn)確的方法[3-4]。多回波Dixon及HISTO序列測得的質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)（proton density fat fraction，PDFF）較傳統(tǒng)Dixon及MRS能夠更準(zhǔn)確地定量肝臟脂肪含量（liver fat content，LFC），且不受鐵沉積影響[5-6]。既往研究顯示肝纖維化是非酒精性脂肪性肝炎的進(jìn)展階段，會(huì)降低MRI測定PDFF的準(zhǔn)確性；也有研究認(rèn)為肝纖維化對(duì)PDFF與肝脂肪變性之間的相關(guān)性并無顯著影響[7-9]。本研究擬通過建立NAFLD伴有不同程度纖維化兔模型，以組織病理學(xué)及全肝脂肪生化測定為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估MR多回波Dixon及HISTO序列定量肝臟脂肪變性的相關(guān)性，并探討肝纖維化是否對(duì)其定量脂肪產(chǎn)生影響，為進(jìn)一步臨床研究應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立 取27只健康新西蘭大白兔，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，2～3月齡，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為高脂組22只和對(duì)照組5只。高脂組兔用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方：83%普通飼料+10%豬油+5%蔗糖+2%膽固醇；對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)兔分籠飼養(yǎng)，自由飲食及飲用自來水。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2019（KY-E-065）]。

1.2 MRI檢查

1.2.1 儀器與方法 采用Siemens Prisma 3.0T超導(dǎo)型MR掃描儀，8通道相控陣兔專用線圈（蘇州眾志醫(yī)療）。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，于第3～22周，每周或每隔1周隨機(jī)選取3只高脂組兔及1只對(duì)照組兔行MRI檢查。檢查前禁食8 h（減少腸道蠕動(dòng)偽影），于耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）麻醉實(shí)驗(yàn)兔。頭先進(jìn)，肝臟置于線圈中心位置，使用自制繃帶束縛麻醉兔上腹部，以減少呼吸運(yùn)動(dòng)偽影。

1.2.2 掃描序列和參數(shù) 掃描序列包括橫斷面T1-StarVIBE、6回波Dixon和HISTO序列。6回波Dixon序列掃描參數(shù)：TE分別為1.26、2.60、3.94、5.28、6.62、7.96 ms，TR 9.25 ms，層厚3.5 mm，矩陣160×120，帶寬1 200 Hz/Pixel，視野120 mm×100 mm，掃描時(shí)間16 s。HISTO掃描參數(shù)：TE分別為12、24、36、48、72 ms，TR 3 000ms，帶寬1 200 Hz，體素3～5 cm3，掃描時(shí)間15 s。光譜體素定位在3個(gè)平面上，避開主要血管和肝臟邊緣，邊緣長度為1.4～1.7 cm。

1.2.3 圖像分析 使用圖像工作站及相應(yīng)后處理軟件進(jìn)行圖像分析。由2名主治醫(yī)師采用盲法獨(dú)立分析圖像。在多回波Dixon序列生成的脂肪分?jǐn)?shù)圖及R2*弛豫率圖（R2* map）上選取相同位置各畫5個(gè)感興趣區(qū)（ROI），測量得出肝臟ME Dixon-PDFF、ME Dixon-R2*值，計(jì)算平均值。ROI的選取應(yīng)找肝臟最大層面及上、下兩層，同時(shí)避開血管、膽管及肝臟邊緣地區(qū)，且面積、大小一致。HISTO在線自動(dòng)生成所選取體素內(nèi)的脂肪信號(hào)與總信號(hào)（水+脂肪）的比值即肝臟脂質(zhì)密度脂肪分?jǐn)?shù)（HISTO-PDFF），以及對(duì)數(shù)線性指數(shù)擬合得到的R2water值的報(bào)告。

1.3 病理學(xué)及生化檢測 MRI掃描結(jié)束后，選取高脂組兔1只處死，對(duì)照組兔分別于第4、8、12、16、20周檢查后處死。靜脈注射戊巴比妥（100 mg/kg）處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖并完整取出肝臟組織，觀察肝臟形狀、顏色、質(zhì)地，去除膽囊，應(yīng)用排水法測量肝臟體積。然后取0.5～1.0 cm3肝組織，置于10%福爾馬林溶液中固定12 h，蠟埋、切片，分別行HE染色、Masson染色及普魯士藍(lán)染色。光鏡下由2位病理醫(yī)師采用盲法閱片，分別對(duì)脂肪肝分級(jí)、纖維化分級(jí)及鐵沉積進(jìn)行分析和判定，意見不一致時(shí)討論達(dá)成共識(shí)。依據(jù)非酒精性脂肪肝炎臨床研究網(wǎng)絡(luò)標(biāo)準(zhǔn)[10]，將脂肪肝分為0、1、2、3級(jí)，肝纖維化分為F0、F1、F2、F3、F4期。將取完病理剩余的肝臟去除大的血管和膽管，用雙蒸水反復(fù)沖洗后裝入塑料袋密封，及時(shí)送廣西分析測試研究中心按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.6-2016第二法（酸水解法）檢測肝臟濕重脂肪含量[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件，連續(xù)變量以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）評(píng)估2名MRI醫(yī)師測量結(jié)果的一致性。采用Pearson或Spearman相關(guān)分析計(jì)算MRI各指標(biāo)與病理生化結(jié)果的相關(guān)性。用Bland-Altman法分析多回波Dixon及HISTO序列測得PDFF的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 造模過程中，高脂組5只實(shí)驗(yàn)兔因高脂飲食死亡，最終本實(shí)驗(yàn)對(duì)22只兔（對(duì)照組5只，高脂組17只）進(jìn)行病理及化學(xué)檢測分析，并采用實(shí)驗(yàn)兔處死前最后一次MRI掃描結(jié)果進(jìn)行測量。實(shí)驗(yàn)過程中高脂組兔2個(gè)月后易出現(xiàn)食欲缺乏、消瘦、脫毛、皮膚粗糙暗沉等癥狀，此時(shí)解剖實(shí)驗(yàn)兔發(fā)現(xiàn)肝臟明顯增大、變硬，邊緣圓鈍，呈灰白色，無光澤，部分伴有腹水。對(duì)照組兔肝柔軟，呈鮮紅色，有光澤。高脂組與對(duì)照組兔平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.092）；高脂組兔肝臟體積明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 對(duì)照組與高脂組兔一般資料及MRI檢測結(jié)果比較（±s）

表1 對(duì)照組與高脂組兔一般資料及MRI檢測結(jié)果比較（±s）

注：LFC：肝臟脂肪含量；ME Dixon：多回波Dixon；PDFF：質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)

項(xiàng)目高脂組（n=17）對(duì)照組（n=5）t值P值體重（kg） 2.69±0.39 3.02±0.25 －1.77 0.092＜0.001 LFC（100 mg/g） 11.41±4.03 3.11±0.32 8.39 ＜0.001肝臟體積（ml）135.00±37.33 72.20±8.90 6.35＜0.001 HISTO-PDFF（%） 7.35±3.27 1.30±0.55 7.29 ＜0.001 ME Dixon-PDFF（%）7.69±2.71 2.07±0.53 4.53 ME Dixon-R2*（1/s）54.23±15.18 61.94±12.09－1.17 0.272

2.2 病理及生化測定脂肪含量結(jié)果 實(shí)驗(yàn)兔肝HE染色、Masson染色結(jié)果見圖1～3，其中高脂組兔經(jīng)酸水解法測定LFC為（9.52±5.00）%（4.30%～16.70%）。高脂組兔肝組織活檢脂肪肝分級(jí)：1級(jí)2只、2級(jí)10只、3級(jí)5只。組織活檢脂肪肝分級(jí)與LFC呈顯著正相關(guān)（r=0.837，P＜0.05）。纖維化分級(jí)：F0期3只、F1期5只、F2期4只、F3期3只、F4期2只。隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長，HE染色見細(xì)胞脂肪變、炎癥細(xì)胞逐漸增多；Masson染色可見纖維成分逐漸增多，小葉結(jié)構(gòu)破壞，最終出現(xiàn)假小葉。對(duì)照組兔肝細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，未見脂肪樣變、炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化，LFC為（3.11±0.32）%（2.70%～3.52%）。高脂組與對(duì)照組普魯士藍(lán)染色未見鐵顆粒沉積或僅有極少量藍(lán)色鐵顆粒沉積。

2.3 MRI檢查結(jié)果

2.3.1 MRI 測值結(jié)果分析 2 名觀察者測量ME Dixon-PDFF值的一致性良好（ICC=0.965，95%CI0.902～0.987）。最終取2位醫(yī)師測量結(jié)果的平均值做進(jìn)一步分析。

高脂組兔肝MR測得ME Dixon-PDFF、HISTO-

2.3.2 MRI參數(shù)與病理及生化測量值的相關(guān)性 所有實(shí)驗(yàn)組兔肝臟脂肪肝分級(jí)、ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF均與LFC呈高度正相關(guān)（r=0.837、0.818、0.723，P均＜0.05），見圖6、7。在無或早期纖維化階段（F0、F1），ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF與LFC呈高度正相關(guān)（r=0.977、0.966，P均＜0.01）；在進(jìn)展期及晚期肝纖維化階段（F2～F4），ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF與LFC均無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

隨著MRI技術(shù)的發(fā)展，多回波Dixon、MRS技術(shù)成為目前無創(chuàng)、快速、有效地定量評(píng)估肝臟脂肪變的方法。多回波Dixon屬于三維梯度回波序列，通過采集更多回波，使用更先進(jìn)的采集方式和更優(yōu)化后處理算法，可以有效減少誤差。此時(shí)得到的組織中脂肪質(zhì)子密度與總質(zhì)子密度的比值，可以更準(zhǔn)確地定量組織的脂肪PDFF值均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。高脂組兔肝與對(duì)照組測得ME Dixon-R2*值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.272），見表1。所有實(shí)驗(yàn)兔測得ME Dixon-PDFF與HISTO-PDFF值呈顯著正相關(guān)（r=0.916，P＜0.001），且具有較好的一致性（ICC=0.952，95%CI0.883～0.980），見圖4、5。含量。HISTO是一種單體素高速T2校正多回波1HMRS序列，具有刺激回波采集模式（STEAM），可以通過校正水和脂肪的R2弛豫量化脂質(zhì)百分比。多回波Dixon及HISTO在伴有鐵沉積情況下仍能夠客觀、準(zhǔn)確地定量肝脂肪含量，具有較高的敏感度和特異度，不受鐵沉積影響[12-14]。然而，目前關(guān)于纖維化對(duì)磁共振PDFF測定肝脂肪變性的準(zhǔn)確性有無影響研究較少，并且存在一定的爭議，有研究認(rèn)為肝纖維化降低了病理穿刺與PDFF的相關(guān)性[7]，也有研究認(rèn)為肝纖維化對(duì)PDFF與肝脂肪變性之間的關(guān)系并無顯著影響[8]。

圖4 實(shí)驗(yàn)兔肝臟ME Dixon-PDFF與HISTO-PDFF的相關(guān)性

圖5 實(shí)驗(yàn)兔肝臟ME Dixon-PDFF與HISTO-PDFF的Bland-Altman分析

本研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)早期階段，高脂組兔肝臟無纖維化或處于早期纖維化階段時(shí)，MRI獲得的PDFF與酸水解法測得的LFC呈高度正相關(guān)；而在后期，隨著肝纖維化程度加重（F2～F4），PDFF與LFC的相關(guān)性下降。影響MRI評(píng)估肝臟脂肪變性準(zhǔn)確性的主要因素是肝纖維化和鐵含量[15]，而本研究中所有實(shí)驗(yàn)組兔無肝鐵沉積或僅有極少量鐵沉積，因此推測肝纖維化降低了PDFF與LFC的相關(guān)性。曹迪等[16]應(yīng)用MR

Idilman等[7]納入70例NAFLD研究發(fā)現(xiàn)，肝臟纖維化時(shí)肝組織活檢結(jié)果與MRI-PDFF的相關(guān)性為0.60，而沒有纖維化時(shí)的相關(guān)性為0.86。Tang等[8]報(bào)道肝纖維化不影響MRI脂肪定量與肝脂肪變性的關(guān)系。本研究推測，研究對(duì)象中患有晚期纖維化所占比例越高，報(bào)告纖維化效應(yīng)影響的可能性越大；報(bào)告未受纖維化階段影響的研究多數(shù)僅0～15%的晚期纖維化受試者[8,17]，而確實(shí)顯示受纖維化階段影響的研究多數(shù)含有15%以上的晚期纖維化受試者[7,18]。目前纖維化影響MRI定量LFC的具體原因尚未闡明，可能與纖維化會(huì)導(dǎo)致組織局部磁場磁化率不均或脂質(zhì)密度下降造成組織信噪比過低有關(guān)。因此，采用MRI進(jìn)行脂肪定量時(shí)，需考慮肝纖維化對(duì)結(jié)果的影響。

MRI是一種可以量化LFC的非侵入性技術(shù)，尤其在早期肝纖維化階段，其定量肝脂肪變性的準(zhǔn)確性優(yōu)于肝組織活檢。本研究中，在早期肝纖維化階段（F0、F1期），MR測得的ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF值與LFC均呈高度正相關(guān)。Noureddin等[19]報(bào)道與肝組織活檢相比，PDFF對(duì)脂肪變性的定量診斷有更好的準(zhǔn)確度。首先，MRI顯示脂質(zhì)和水的質(zhì)子比例，是一種定量分析；而病理分析顯示單位視野內(nèi)脂肪變性的肝細(xì)胞比例，是一種半定量分析。其次，MR-PDFF值可以計(jì)算全肝脂肪分量，而肝穿刺取材體積有限，且不可重復(fù)。肝臟脂肪分布往往具有不均勻性，因此，MRI對(duì)早期肝纖維化階段肝脂肪變性定量更準(zhǔn)確，可以更好地了解和監(jiān)測疾病的治療效果。

圖7 HISTO-PDFF與LFC的相關(guān)性。PDFF：質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)；LFC：肝臟脂肪含量

本研究結(jié)果顯示，多回波Dixon及HISTO測得的IDEAL-IQ序列定量NAFLD兔模型研究發(fā)現(xiàn)，中重度脂肪肝的PDFF與病理結(jié)果出現(xiàn)離散度變大的情況，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。PDFF呈高度正相關(guān)，兩者無顯著差異，且具有較高的一致性。但HISTO序列為單體素波譜序列，其空間選取范圍有限，無法避免采樣誤差；且多回波Dixon具有較高的圖像分辨率，并且可以同時(shí)量化全肝覆蓋范圍內(nèi)的脂肪和鐵沉積，能夠更有效地定量肝鐵含量，其診斷性能優(yōu)于HISTO序列，因此三維多回波Dixon技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。

目前建立NAFLD動(dòng)物模型的相關(guān)研究大多采用高脂高糖喂養(yǎng)方法，此模型操作方便，動(dòng)物死亡率低。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂組兔喂養(yǎng)2周后即可達(dá)到輕度脂肪肝，隨著造模時(shí)間延長，肝脂肪變性程度加重。連續(xù)喂養(yǎng)2個(gè)月后高脂組兔易伴發(fā)消瘦、毛發(fā)脫落、四肢潰爛、感染等并發(fā)癥，此時(shí)MR掃描實(shí)驗(yàn)兔肝PDFF值上升趨于平緩或下降。本研究中模型最長制備時(shí)間為22周，解剖發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔肝臟明顯硬化，邊緣粗糙，并伴有腹水，提示出現(xiàn)肝纖維化甚至肝硬化。處死后病理切片見肝組織明顯脂肪變（3級(jí)）及纖維化（F4期），證實(shí)了這一猜想。但由于實(shí)驗(yàn)兔具有個(gè)體差異，其肝臟脂肪變性及纖維化的進(jìn)展程度不一致。

本研究的局限性：未在MRI上對(duì)肝纖維化進(jìn)行定量分析，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)兔與人體在脂肪代謝方面存在較大差異，因此不能完全復(fù)制人類NAFLD的發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)納入樣本量較小，其結(jié)果可能具有一定的偏差，有待進(jìn)一步開展大樣本、多中心研究深入探討?？傊褂肕RI的PDFF可以定量測量LFC，PDFF與生化檢測LFC有很強(qiáng)的相關(guān)性。然而，纖維化的存在會(huì)使其相關(guān)性降低。