周 健，曲冬穎，楊 清

隨著社會進(jìn)步及計(jì)劃生育政策的推行，順利分娩和保障母嬰安全對實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)尤為重要。研究顯示，難產(chǎn)、過期妊娠、高危妊娠等仍是給母嬰安全帶來嚴(yán)重威脅的關(guān)鍵因素，針對這種情況需要采取主動促分娩措施如引產(chǎn)、催產(chǎn)等。目前臨床主要采用藥物治療、機(jī)械性治療、剖宮產(chǎn)等方法促分娩，但均存在著或多或少的副作用。因此，尋求一種安全有效的引產(chǎn)、催產(chǎn)方法，促進(jìn)分娩的發(fā)動及進(jìn)行是產(chǎn)科面臨的一個重要課題。黃芩是臨床常用的一種清熱燥濕傳統(tǒng)中藥，既往研究顯示，黃芩可顯著增加家兔離體子宮收縮頻率。目前，有關(guān)黃芩對妊娠晚期大鼠子宮運(yùn)動節(jié)律的影響研究尚未見報道。本研究探討黃芩對妊娠晚期大鼠子宮運(yùn)動節(jié)律的影響，以期尋求安全有效的引產(chǎn)、催產(chǎn)方法。

1 資料與方法

1.1 動物來源及分組 150只健康成年無特定病原體動物(specified pathogen free，SPF)級大鼠(8周齡)，體質(zhì)量180～240 g，平均體質(zhì)量(210±24)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證為[SCXK(京)2016-0008]。

1.2 主要試劑與儀器 黃芩提取物(購自西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)；BCA試劑盒、蛋白提取試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；前列腺素E(Prostaglandin E，PGE)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)引物序列由大連寶生生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；PGE、COX-2、β-actin抗體、山羊抗兔HRP二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。OptimaXPN超速離心機(jī)，購自貝克曼庫爾特生物科技有限公司；CW-3型恒溫平滑肌槽(上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理 100只健康成年SPF級雌性大鼠、50只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照2∶1雌雄合籠交配，次日用無菌棉簽給雌鼠作陰道涂片并進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量精子視為妊娠成功，為妊娠第1天，選取符合要求的40只妊娠大鼠隨機(jī)分為4組，即對照組及黃芩提取物低、中、高劑量組(后期命名為黃芩低、中、高劑量組)，每組10只。

黃芩低、中、高劑量組大鼠分別于大鼠妊娠第19天時給予成人臨床等效劑量(6 g/60 kg)的4倍、8倍、16倍(400、800、1600 mg/kg)單次灌胃處理；對照組于同時間給予等量生理鹽水灌胃處理，同日觀察大鼠胎鼠娩出情況。

1.3.2 子宮肌條標(biāo)本采集將妊娠第20天的各組大鼠麻醉后剖宮取胎并立即統(tǒng)計(jì)仔鼠總數(shù)及活胎數(shù)，后充分暴露Y形子宮，沿子宮頸部縱向剖開一側(cè)，剝離宮內(nèi)胎鼠及周邊脂肪組織后，將子宮鋪平，均等切取該側(cè)子宮肌條，兩側(cè)子宮切取肌條方法相同，每只大鼠子宮取9個肌條，分為三部分，一部分做子宮肌條張力測定，做好標(biāo)記后立即置于37 ℃臺式液中；另兩部置于液氮中保存，分別用于PGE、COX2 mRNA及其蛋白檢測。

1.3.3 肌張力測定 取1.3.2中各組大鼠部分子宮肌條，每個肌條兩端均用0-0手術(shù)線縫合打結(jié)，設(shè)置恒溫平滑肌槽溫度調(diào)整為37 ℃，槽內(nèi)加入足量臺式液，將打結(jié)好的子宮肌條分別放入槽內(nèi)，頂端、底端打結(jié)處與張力傳感器兩端連接，調(diào)節(jié)張力傳感器至2 g左右重量，依次對所有肌條分別進(jìn)行肌張力測定，并做好記錄，其中子宮活動力=宮縮強(qiáng)度×宮縮頻率。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR法檢測各組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2 mRNA水平 提取1.3.2各組大鼠部分子宮肌條組織中總RNA并測濃度，以RNA為模板行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA行qRT-PCR反應(yīng)。體系20 μl：2×ULtraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddHO 4.0 μl；條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。PGE、COX2以GAPDH作為內(nèi)參，采用2方法計(jì)算PGE、COX2 mRNA水平相對表達(dá)量(引物序列見表1)。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3.5 免疫印跡法檢測各組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2蛋白表達(dá)變化 取1.3.2各組大鼠部分子宮肌條組織，剪碎制備勻漿，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，離心10 min(10 000 r/min，8 cm)取上清，測定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗，之后加入PGE、COX2及內(nèi)參β-actin作為一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，37 ℃ 1.5 h，顯影、定影并成像，計(jì)算各蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠終止妊娠結(jié)果比較 四組大鼠胎鼠總數(shù)、活胎鼠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)；與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠于妊娠第19天用藥后娩出鼠數(shù)呈劑量依賴性增加(<0.05，表2)。

表2 各組妊娠晚期大鼠(n=10)終止妊娠結(jié)果比較 (n；%)

2.2 各組大鼠子宮肌條張力結(jié)果比較 與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠宮縮頻率、宮縮強(qiáng)度及子宮活動力水平均升高(<0.05)，呈劑量依賴性(表3)。

表3 各組妊娠晚期大鼠子宮肌張力結(jié)果比較

2.3 各組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2 mRNA水平比較 與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2 mRNA水平均升高(<0.05)，呈劑量依賴性(表4)。

表4 各組妊娠晚期大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2 mRNA水平比較

2.4 各組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2蛋白水平比較 與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2蛋白水平均升高(<0.05)，呈劑量依賴性(圖1、表5)。

注：PGE.前列腺素E; COX2. 環(huán)氧合酶2;A.對照組；B.黃芩低劑量組；C.黃芩中劑量組；D.黃芩高劑量組

表5 各組妊娠晚期大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2蛋白水平比較

3 討 論

目前，難產(chǎn)、過期妊娠、高危妊娠等因素仍是嚴(yán)重威脅母嬰安全的主要因素，針對這種情況需要采取主動促分娩措施，否則會導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫、高膽紅素血癥、圍生兒病死率增高、難產(chǎn)、產(chǎn)傷、母體產(chǎn)后大出血及刮宮率高等不良事件發(fā)生。引產(chǎn)是臨床主要的促分娩措施，目前藥物治療、機(jī)械性治療、剖宮產(chǎn)等是臨床常用促分娩方法，但均有一定弊端，因此探尋新的安全可靠的促分娩方法是產(chǎn)科醫(yī)師的研究熱點(diǎn)。

黃芩是唇形科唇形科黃芩屬植物黃芩的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表散寒之功效，毒副作用小，價格低廉且來源豐富?！夺t(yī)學(xué)心悟·夫人門》有道“新孕婦人，胎氣頑固，腹皮緊窄，氣血裹其胞胎，最難轉(zhuǎn)動”，意為元?dú)馔鷦t胎運(yùn)轉(zhuǎn)有力，能夠有助于孕晚期孕婦臨產(chǎn)時的血?dú)饬鲃?，進(jìn)而有助于分娩發(fā)動。產(chǎn)力包括子宮收縮力、腹壁肌和膈肌收縮力以及肛提肌收縮力，其中以子宮收縮力為主，研究顯示，子宮收縮乏力是導(dǎo)致產(chǎn)程延長及產(chǎn)后大出血的主要原因之一，因此積極防治子宮收縮乏力，促進(jìn)子宮收縮可促進(jìn)分娩及避免子宮收縮乏力導(dǎo)致的產(chǎn)后大出血。

孔祥峰等發(fā)現(xiàn)，黃芩對家兔離體子宮收縮具有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，四組大鼠胎鼠總數(shù)、活胎鼠率無顯著差異，且與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠于妊娠第19天用藥后娩出鼠數(shù)呈劑量依賴性增加。說明黃芩可促使妊娠后期大鼠終止妊娠并促進(jìn)胎鼠娩出，具有一定安全性。與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠宮縮強(qiáng)度、宮縮頻率及子宮活動力水平均升高，呈劑量依賴性。與既往相關(guān)研究結(jié)果相似，說明黃芩可能促進(jìn)妊娠晚期大鼠子宮收縮，促進(jìn)大鼠分娩。

COX是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)相連的糖蛋白復(fù)合物，主要有兩種同工酶形式，分別為COX-1、COX-2，與胚胎移植及妊娠分娩過程有關(guān)。COX主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)PG的合成及分泌，PG是脂質(zhì)代謝物，在胚胎著床及維持妊娠等方面發(fā)揮著重要作用，能夠調(diào)節(jié)子宮肌層收縮、子宮與胎盤間的血流循環(huán)及子宮頸成熟等。研究發(fā)現(xiàn)，PGE2能夠收縮子宮平滑肌，促進(jìn)分娩過程中子宮肌收縮效應(yīng)，特別是在分娩時能增強(qiáng)催產(chǎn)素引起的收縮反應(yīng)，促進(jìn)分娩。賈瑞喆等發(fā)現(xiàn)，子宮平滑肌與蛻膜組織中PGE2濃度與縮宮素引產(chǎn)成功率有關(guān)，縮宮素可促進(jìn)PGE2合成，PGE2又可促進(jìn)縮宮素分泌，促進(jìn)分娩。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，黃芩低、中、高劑量組大鼠子宮肌條組織中PGE、COX2 mRNA及PGE、COX2蛋白水平均升高，且均呈劑量依賴性。說明黃芩能夠促進(jìn)妊娠晚期大鼠子宮收縮，促進(jìn)大鼠分娩，可能是通過促進(jìn)COX2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGE2合成及分泌實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，黃芩可能通過促進(jìn)妊娠晚期大鼠子宮肌組織COX2及PGE2合成及分泌，促進(jìn)妊娠晚期大鼠子宮收縮進(jìn)而促進(jìn)大鼠分娩，可為臨床尋找安全可靠的促分娩方法提供一定參考。