韓鵬飛 黃貴強(qiáng)

（1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553004）

蟲(chóng)草菌是廣義蟲(chóng)草屬（Cordyceps s.l.）真菌的統(tǒng)稱，其種類繁多且分布廣泛，主要寄生于昆蟲(chóng)、少數(shù)植物和真菌中［1］。世界上已報(bào)道約1 000余種蟲(chóng)草菌，國(guó)內(nèi)報(bào)道的蟲(chóng)草菌約100種，蟲(chóng)草真菌能產(chǎn)生多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、超氧化物歧化酶和氨基酸等多種生物活性物質(zhì)，其中多糖具備抗腫瘤、抗炎、降血脂和清除自由基等功能，在抗氧化方面功能尤為顯著，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、飼料、食品等領(lǐng)域［2-6］。

蟲(chóng)草多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，蟲(chóng)草多糖的抗氧化活性主要是通過(guò)清除細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激會(huì)造成細(xì)胞衰老。正常情況下，人的機(jī)體會(huì)刺激體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)胞的氧化，如肝臟中含有超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶，能夠消除體內(nèi)過(guò)多的自由基，維持細(xì)胞的平衡［7］。測(cè)定其抗氧化能力的方法包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率測(cè)定、羥基自由基清除率測(cè)定、總還原力測(cè)定、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率測(cè)定等［8］。研究較多的菌株是冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）、蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布 氏 白 僵 菌（Beauveria brongniartii）等［1］［6］。

蟲(chóng)草多糖由于其突出的活性能力，工業(yè)化生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖就變得尤為重要，而生產(chǎn)的關(guān)鍵不僅在于產(chǎn)量提高，還包括提高蟲(chóng)草多糖的提取率［9-10］。

蟲(chóng)草多糖的提取方法比較多，有熱水浸提法、超聲波提取法等，通過(guò)優(yōu)化提取工藝，可以提高蟲(chóng)草多糖提取率［11］。目前關(guān)于蟲(chóng)草多糖的生產(chǎn)主要通過(guò)液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行［12］。要將蟲(chóng)草多糖應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，還應(yīng)將提取出的蟲(chóng)草多糖進(jìn)行純化和制成藥劑等。純化蟲(chóng)草多糖的方法有蛋白脫除法、大孔吸附樹(shù)脂法、柱層析法等［13-15］；蟲(chóng)草多糖的制劑類型有菌粉狀、顆粒狀等［16-17］。

本文將基于已有的研究報(bào)道，對(duì)蟲(chóng)草多糖的發(fā)酵研究、提取工藝、抗氧化活性測(cè)定、純化和制劑類型等方面進(jìn)行梳理，為以后工業(yè)化生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖的最適發(fā)酵條件和提取工藝提供參考。

1 蟲(chóng)草多糖的發(fā)酵研究

目前野生蟲(chóng)草真菌產(chǎn)生的多糖含量較低，為了提高蟲(chóng)草真菌多糖的表達(dá)量，研究人員采用固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵方法來(lái)提高多糖產(chǎn)量。液態(tài)發(fā)酵中的液體深層雙向發(fā)酵是目前能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵手段，能夠較大產(chǎn)量地發(fā)酵生產(chǎn)多糖；蟲(chóng)草真菌的固態(tài)發(fā)酵研究相對(duì)較多，固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基以小麥、大米、玉米等為主，具備成本低廉和低能耗等特點(diǎn)［18］。研究表明，固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其發(fā)酵方式對(duì)比如表1所示。

表1 蟲(chóng)草真菌多糖的發(fā)酵方式對(duì)比

對(duì)不同的蟲(chóng)草真菌采用適合的方法能夠進(jìn)一步減少生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

1.1 蟲(chóng)草多糖的固態(tài)發(fā)酵

以固態(tài)培養(yǎng)基代替蟲(chóng)、蛹進(jìn)行蟲(chóng)草真菌培養(yǎng)，能進(jìn)一步縮短蟲(chóng)草真菌的生長(zhǎng)周期，獲得較多的蟲(chóng)草子實(shí)體，從而提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量，增大經(jīng)濟(jì)效益。關(guān)于蟲(chóng)草真菌在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)蟲(chóng)草多糖的研究相對(duì)較少，較難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但其發(fā)展前景較廣闊。根據(jù)目前蟲(chóng)草真菌在固態(tài)發(fā)酵條件下生產(chǎn)多糖的研究表明：以玉米、小麥、大米等產(chǎn)量較高的農(nóng)作物作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行蟲(chóng)草真菌發(fā)酵培養(yǎng)，蟲(chóng)草真菌產(chǎn)多糖的含量相對(duì)較高。如王明瑞等［20］利用玉米粉和麩皮為原料制作的固體培養(yǎng)基（玉米粉：麩皮=18 g：2 g）生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖，結(jié)果表明胞外浸提液中蟲(chóng)草多糖的含量為3.23 mg/mL；懷美玉等［21］以野黑麥培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草，得到子實(shí)體中多糖含量為15.41%；何雯雯等［22］在小麥培養(yǎng)基上發(fā)酵蛹蟲(chóng)草，多糖含量高達(dá)5.45%；徐玲等［23］以大米為培養(yǎng)基主要成分培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草，蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量最高為68.3 mg/g干基質(zhì)。

在蟲(chóng)草真菌生長(zhǎng)的過(guò)程中，其產(chǎn)生的多糖一部分儲(chǔ)存在蟲(chóng)草的子實(shí)體中，另外一部分則通過(guò)代謝釋放到培養(yǎng)基中，因此蟲(chóng)草多糖可分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖［24］。由于固態(tài)發(fā)酵的菌絲體與培養(yǎng)基成分無(wú)法完全進(jìn)行分離，因此目前固態(tài)發(fā)酵研究中測(cè)定的蟲(chóng)草多糖含量是胞內(nèi)多糖和胞外多糖的總含量［20］。

固態(tài)發(fā)酵方法的培養(yǎng)基質(zhì)主要是農(nóng)作物和廢渣廢料，成本相對(duì)較低，而且不易污染，下游處理簡(jiǎn)易，產(chǎn)物含量高，操作簡(jiǎn)便；固態(tài)發(fā)酵也在某種程度上保留了蟲(chóng)草真菌的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，使蟲(chóng)草多糖的產(chǎn)量有所提高，可以給予蟲(chóng)草真菌生產(chǎn)多糖提供研究參考。

1.2 蟲(chóng)草多糖的液態(tài)發(fā)酵

目前，關(guān)于蟲(chóng)草真菌的發(fā)酵主要是以液態(tài)發(fā)酵為主，液態(tài)發(fā)酵又分為淺層發(fā)酵和深層發(fā)酵，使用最廣泛的是液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)。液態(tài)發(fā)酵的目的是提高初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物［19］，同時(shí)也更容易大批量發(fā)酵而應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，液態(tài)深層發(fā)酵能夠完成一次性收集料液，具有縮短生產(chǎn)周期、提高生產(chǎn)效率等特點(diǎn)。

液態(tài)發(fā)酵能大幅度提高蟲(chóng)草真菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，是研究人員普遍使用的方法之一。樊金華等［25］以工業(yè)化生產(chǎn)為目的對(duì)布氏白僵菌發(fā)酵進(jìn)行單因素優(yōu)化，得到以氮源為黃豆粉或者玉米粉、碳源為可溶性淀粉、pH值為5.0的培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵13 d，產(chǎn)生的孢子數(shù)量最多，根據(jù)布氏白僵菌產(chǎn)生芽生孢子不耐儲(chǔ)藏的特性，得到一種最適的產(chǎn)生孢子的方法，為接下來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。Ke BJ等［26］用蟬花進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，以腺苷和多糖含量作為指標(biāo)，得出把0.2%的酵母提取物加入到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在100 r/min，24℃條件下培養(yǎng)10 d產(chǎn)生的蟬花腺苷和蟬花多糖含量均高于固態(tài)發(fā)酵，0.2%的酵母提取物能夠提高蟬花的活性物質(zhì)產(chǎn)量，為蟬花的活性物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。胡永樂(lè)等［27］以中藥厚樸作為培養(yǎng)基成分，利用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲(chóng)草液態(tài)發(fā)酵條件生產(chǎn)菌絲體和胞外多糖，在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)胞外多糖含量受接種量的影響，菌絲體生物量受溫度的影響，經(jīng)過(guò)測(cè)定胞外多糖和菌絲體含量，最終得到在厚樸添加量3.3%、接種量10.3%、25℃的條件下培養(yǎng)9 d，胞外多糖含量為3.11 mg/mL，菌絲體量為18.81 mg/mL。

蟲(chóng)草真菌的液態(tài)發(fā)酵研究伴隨其代謝產(chǎn)物功能的研究而不斷探索，為了進(jìn)一步提高蟲(chóng)草真菌代謝產(chǎn)物含量，液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)被提出，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中。對(duì)于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖的研究成果相對(duì)較多，部分成果已實(shí)現(xiàn)了量級(jí)生產(chǎn)［28］。

液態(tài)發(fā)酵更容易控制發(fā)酵條件，是目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主流研究方向，能夠?qū)⒕w和發(fā)酵基質(zhì)分離，能為發(fā)酵中的蟲(chóng)草真菌精準(zhǔn)提供所需化合物，能夠定向合成蟲(chóng)草真菌多糖，最大化地利用原料。

2 蟲(chóng)草多糖的提取工藝

蟲(chóng)草多糖在蟲(chóng)草真菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，通過(guò)蟲(chóng)草真菌體內(nèi)的關(guān)鍵酶（半乳糖激酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）的基因調(diào)控［29］，產(chǎn)生蟲(chóng)草多糖，因此需要對(duì)胞內(nèi)和胞外多糖進(jìn)行提取，才能獲得最終的蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量。液態(tài)發(fā)酵條件下的胞外多糖的提取相對(duì)簡(jiǎn)便，即通過(guò)發(fā)酵液濃縮，Sevage法除蛋白和乙醇沉降，再利用透析法除去小分子糖類（如葡萄糖），即可得到胞外多糖。胞內(nèi)多糖相對(duì)不易獲取［27］，目前關(guān)于胞內(nèi)多糖的提取方法主要有：熱水浸提法、微波輔助提取法、酶提取法、超聲提取法和亞臨界水浸提法等，具體如表2所示。

表2 蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖的提取工藝對(duì)比

2.1 熱水浸提法

熱水浸提法［30］是傳統(tǒng)的多糖提取方法，利用高溫破壞真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放到胞外，其次利用醇沉等方法得到胞內(nèi)多糖。熱水浸提法具有操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)；但也存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取不充分的缺點(diǎn)。不過(guò)，這種方法依舊是使用較廣泛的多糖提取方法之一。

師景雙等［31］用熱水浸提法對(duì)獲取蟲(chóng)草多糖進(jìn)行了研究，最終得到蛹蟲(chóng)草多糖的最適提取工藝，即在菌粉粉碎至80目、料液比為1：20、水浴提取溫度為65℃、提取時(shí)長(zhǎng)2 h、提取次數(shù)為3次的條件下，蟲(chóng)草多糖的獲得率最高，為10.42%。王小愛(ài)等［32］通過(guò)對(duì)蟲(chóng)草多糖的料液比、提取溫度、提取時(shí)間、浸提次數(shù)的研究，獲取了最佳的提取工藝參數(shù)，即在料液比為1：40、提取溫度為80℃、提取時(shí)間為1.5 h、提取2次的條件下，蟲(chóng)草多糖的獲得率最高，為74.65 mg/g，比優(yōu)化提取條件前的蟲(chóng)草多糖提取含量提高了14.96%。黃振峰等［33］通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)蟲(chóng)草多糖提取工藝的研究，得到熱水浸提法的最優(yōu)參數(shù)為：料液比為1：40、提取時(shí)間為150 min、提取溫度為75℃、提取次數(shù)為2次，多糖得率達(dá)到14.74%，同時(shí)若以冷水和熱水交替浸提多糖，多糖得率將再次提高，按照上述的參數(shù)進(jìn)行熱水浸提150 min，冷水浸提48 h，多糖得率提高了8%。

2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法［34］是指利用樣品或者溶劑中的偶極分子在微波能的作用下，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量，加速了溶劑對(duì)樣品的滲透，使目的產(chǎn)物溶解于溶劑中，便于提取目的產(chǎn)物。該方法的穿透能力較強(qiáng)，節(jié)約溶劑、工藝簡(jiǎn)單，也可聯(lián)合其他方法一起使用，被提取物的提取效率較高，后處理也相對(duì)方便。

何雯雯等［21］將蛹蟲(chóng)草接種在小麥培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖，然后利用微波提取法提取蛹蟲(chóng)草多糖，首先將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行干燥粉碎，按照料液比為1：50、微波功率為400 W、提取時(shí)間為2 h，最終多糖得率為5.45%。郭璐等［35］將忍冬桑黃和蛹蟲(chóng)草共同發(fā)酵產(chǎn)出多糖，通過(guò)微波提取法提取多糖，提取參數(shù)如下：料液比為1：40、溫度為70℃、微波功率為600 W、提取時(shí)間為1.5 h，多糖提取率為29.18±1.53 mg/g。

2.3 酶提取法

酶提取法［36］指的是利用酶水解真菌細(xì)胞壁（主要成分為幾丁質(zhì)和纖維素等），從而使細(xì)胞內(nèi)容物流出，獲取目標(biāo)物質(zhì)的方法。酶具有高效性、專一性、催化能力強(qiáng)等特性，能夠快速地消除細(xì)胞壁，使提取時(shí)間大幅縮減，但是需要選擇合適類型的酶，保證細(xì)胞壁能被最大程度地破壞，同時(shí)又不損失目標(biāo)物質(zhì)。酶提取法還需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，進(jìn)一步提高酶的催化效率。酶提取法比較省時(shí)省力，節(jié)約時(shí)間，但成本相對(duì)較高，無(wú)法用于大規(guī)模的生產(chǎn)，反應(yīng)條件不易控制。

汪振炯等［37］利用纖維素酶協(xié)同微波法研究了蛹蟲(chóng)草多糖的提取工藝，通過(guò)多因素優(yōu)化，最終得出在料液比1：30、溫度55℃、pH 5.5、纖維素酶量為1 650 U/g、處理樣品44 min的條件下進(jìn)行微波提取，提取參數(shù)為微波功率480 W、提取時(shí)間為3.5 min，蛹蟲(chóng)草多糖得率為18.45%。葛靜波等［38］通過(guò)復(fù)合酶對(duì)蛹蟲(chóng)草多糖的提取進(jìn)行了研究，得到的最優(yōu)提取參數(shù)為：料液比為1：20、堿性蛋白酶加入量為3%、淀粉酶加入量為1%、纖維素酶加入量為3%、溫度為50℃、酶處理4 h，最終蛹蟲(chóng)草多糖的提取率為18.42%。李慧等［39］采用酶提取法聯(lián)合超聲波提取法進(jìn)行了蟲(chóng)草花多糖提取工藝的研究，結(jié)論為：在料液比為1：50、纖維素酶0.18%、超聲溫度為53℃、超聲功率為175 W、超聲31 min的條件下，多糖得率最高，為6.441%。楊（Yang）等［40］通過(guò)酶輔助法研究蟲(chóng)草多糖的提取工藝，在料液比為1：20、纖維素酶添加量為2.0%、pH為4.0、酶解溫度40℃時(shí)，蟲(chóng)草多糖提取率達(dá)到5.99%。

2.4 超聲提取法

超聲提取法［41］指的是在超聲波的作用下使細(xì)胞壁能夠快速破裂，內(nèi)容物溶解于溶劑中，聲波能量轉(zhuǎn)化為熱能，能加快內(nèi)容物溶解，內(nèi)容物吸收聲波能量引起的升溫是瞬時(shí)的，不會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的提取物。超聲波提取法不需加熱、提取效率高、節(jié)約成本、不會(huì)破壞大多數(shù)物質(zhì)的生理活性，具備高效、綠色、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)協(xié)同萃取，但是會(huì)對(duì)一些熱敏性物質(zhì)造成損傷。

呂偲丞等［42］通過(guò)響應(yīng)面法來(lái)確定超聲提取法提取多糖的最優(yōu)參數(shù)，通過(guò)多糖含量測(cè)定，在超聲波功率為1800 W、溫度為65℃、超聲提取180 min的條件下，蟲(chóng)草多糖提取含量達(dá)到31.56%。王振吉等［43］通過(guò)研究蟲(chóng)草花多糖的提取工藝，發(fā)現(xiàn)在料液比為1：30、超聲波功率為300 W、溫度為45℃、超聲30 min的條件下，蟲(chóng)草多糖的平均提取含量達(dá)到3.88%。賈有青等［44］通過(guò)對(duì)超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比進(jìn)行了多糖提取工藝的研究，得出在料液比為1：40、超聲溫度為50℃的條件下處理30 min，蟲(chóng)草多糖的提取率達(dá)到4.85%。

2.5 亞臨界水浸提法

亞臨界水浸提法［45］指在一定的壓力下，使水的沸點(diǎn)升高，由于水是極性化合物，隨著溫度和壓力的升高，水會(huì)從極性逐漸變?yōu)榉菢O性，隨之將非極性的物質(zhì)溶出，使有效成分得以提取。

楊文雅等［46］利用亞臨界水浸提法對(duì)蟲(chóng)草多糖提取進(jìn)行了單因素和多因素研究，結(jié)果為：在料液比為1：21、溫度為180℃、pH為8.0、萃取13 min的條件下，蟲(chóng)草多糖的提取含量達(dá)到7.13%。

3 蟲(chóng)草多糖的抗氧化活性測(cè)定

目前測(cè)定抗氧化活性的方法主要是化學(xué)方法，如DPPH法、ABTS法和亞鐵離子還原法等。劉城移等［23］以H2O2誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞（L-O2）氧化損傷為模型，對(duì)比禪蟲(chóng)草的胞內(nèi)多糖和胞外多糖的抗氧化能力，胞外多糖相比胞內(nèi)多糖不僅能極大提高細(xì)胞存活率，同時(shí)顯著提高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力，降低細(xì)胞活性氧（ROS）水平，使細(xì)胞的抗氧化能力加強(qiáng)，氧化損傷降低。

3.1 ABTS自由基清除能力測(cè)定

ABTS法測(cè)定自由基是一種使用較廣泛的方法，主要是通過(guò)ABTS與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定存在的且呈現(xiàn)為藍(lán)綠色的ABTS自由基，在734 nm下具有較大的吸收能力，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)的加入，若ABTS自由基的吸光度值降低，則表明該物質(zhì)具備抗氧化能力，吸光度值降低得越大，抗氧化能力就越強(qiáng)［47］。

3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH是一種比較穩(wěn)定的物質(zhì)，用乙醇配置成溶液以后，溶液呈現(xiàn)為紫色，若加入抗氧化活性物質(zhì)，DPPH會(huì)捕捉一個(gè)電子與游離電子進(jìn)行配對(duì)，使得溶液由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色，在517 nm處的吸收較強(qiáng)，而DPPH轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色的量與抗氧化物質(zhì)的量呈線性關(guān)系，能夠較容易地判斷該物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)弱［48］。

3.3 羥基自由基（·OH）清除能力測(cè)定

羥基自由基清除能力測(cè)定是通過(guò)芬頓（Fenton）反應(yīng)中二價(jià)鐵離子與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成羥基自由基，羥基自由基會(huì)與水楊酸溶液反應(yīng)生成2，3-二羥基苯甲酸，在510 nm下有特殊吸收值，通過(guò)抗氧化物質(zhì)對(duì)羥基自由基的消除，能夠減少2，3-二羥基苯甲酸的生成，從而測(cè)定出該物質(zhì)的抗氧化能力［49］。此實(shí)驗(yàn)中需注意：過(guò)氧化氫或者水楊酸應(yīng)最后加入，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

3.4 超氧自由基（O2-·）清除能力測(cè)定

超氧自由基清除測(cè)定包括鄰苯三酚自氧化法和核黃素-氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法。核黃素-NBT光還原法［50］原理是黃嘌呤在有氧條件下，被黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生超氧自由基，超氧自由基會(huì)與NBT結(jié)合使溶液呈現(xiàn)為藍(lán)色，在560 nm下具有較大吸收值，抗氧化物質(zhì)的清除能力與溶液的顏色成反比。

鄰苯三酚自氧化法［51］的原理是在堿性條件下，鄰苯三酚能夠自我氧化，生成有色產(chǎn)物和超氧自由基，通過(guò)加入抗氧化物質(zhì)，鄰苯三酚自氧化速率降低，產(chǎn)生的有色產(chǎn)物減少，在325 nm下有較大吸收值，進(jìn)而測(cè)定出該物質(zhì)的抗氧化能力。該方法對(duì)溫度和pH較為敏感，而pH與溫度的相關(guān)性較大，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要嚴(yán)格控制溫度。

4 蟲(chóng)草多糖純化方法和制劑類型

4.1 蟲(chóng)草多糖純化方法

4.1.1 蛋白脫除法

蛋白脫除純化法是指除去蟲(chóng)草粗多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，達(dá)到蟲(chóng)草多糖純化的一種方法。目前蛋白脫除純化法主要利用是Sevage試劑（由氯仿和正丁醇組成）進(jìn)行蛋白脫除，Sevage試劑會(huì)使蟲(chóng)草多糖中的蛋白質(zhì)變性，形成不溶于醇和水的沉淀，但是此方法對(duì)蟲(chóng)草多糖的損耗率較大，且試劑具有一定的危險(xiǎn)性［14］。

4.1.2 大孔吸附樹(shù)脂法

大孔吸附樹(shù)脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑,具備吸附和分子篩分離等功能,具有較好的吸附分離性能,不會(huì)影響物質(zhì)活性，分離效果較好，是目前常用的分離純化的方法之一［15］。

4.1.3 柱層析法

柱層析法是根據(jù)樣品中成分與硅膠物質(zhì)的吸附力不同或者樣品中成分大小不同進(jìn)行分離純化的方法，如DEAE-52柱層析和交聯(lián)葡聚糖（Sephdex）-100葡聚糖凝膠柱層析等。此方法具備操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)使用和分離效果較好等特點(diǎn)，也是目前分離純化常用的方法［16］。

4.2 蟲(chóng)草多糖制劑類型

由于蟲(chóng)草多糖具有較廣泛的活性功能，能被應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)。但蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量較少，因此為了最大化利用蟲(chóng)草多糖，可根據(jù)不同目的將蟲(chóng)草多糖制備成不同的制劑類型，如液體狀、菌粉狀和顆粒狀等［17-18］。合理化地將蟲(chóng)草多糖制備成各種試劑類型，不僅能實(shí)現(xiàn)資源最大化利用，還能降低成本。

5 總結(jié)與展望

綜上可知，目前關(guān)于蟲(chóng)草多糖發(fā)酵生產(chǎn)的研究大多只應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室階段，而要滿足工業(yè)化生產(chǎn)條件、大批量獲取蟲(chóng)草多糖的研究報(bào)道相對(duì)較少，且以天然產(chǎn)物作為主要的發(fā)酵培養(yǎng)基成分的比例不高，進(jìn)一步提高了發(fā)酵的成本，也是無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的限制條件之一。蟲(chóng)草真菌的固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵對(duì)于不同的菌株會(huì)得到不同的發(fā)酵產(chǎn)物和產(chǎn)量。根據(jù)目前的研究報(bào)道，液態(tài)發(fā)酵的多糖含量高于固態(tài)發(fā)酵，但是固體發(fā)酵的成本要低于液態(tài)發(fā)酵。由于菌株的不同，所得到的結(jié)果也不相同，因此結(jié)合液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的手段來(lái)提高蟲(chóng)草多糖的產(chǎn)量，也將是未來(lái)研究蟲(chóng)草真菌生產(chǎn)蟲(chóng)草多糖的方式方法。

固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵都可以提高蟲(chóng)草真菌多糖的產(chǎn)量，但還須要對(duì)蟲(chóng)草多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的提取工藝。提取工藝的選擇和應(yīng)用不能破壞多糖結(jié)構(gòu)、影響多糖活性，提高多糖的抗氧化、抗腫瘤等生物活性。蟲(chóng)草多糖的純化應(yīng)該盡可能地去除雜質(zhì)，同時(shí)減少多糖損失，提高蟲(chóng)草多糖純化率，因此對(duì)于純化方法應(yīng)該不斷地去探究，可結(jié)合多種純化方法，以期達(dá)到最大化純化效率，如結(jié)合蛋白脫出法和大孔樹(shù)脂吸附法來(lái)純化蟲(chóng)草多糖。蟲(chóng)草多糖的制劑類型由使用目的決定，能提高多糖利用率，降低制劑成本。

隨著新型技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，蟲(chóng)草多糖的提取率大幅提升，加快了蟲(chóng)草真菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究，也為中藥工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。但工業(yè)化生產(chǎn)仍需考慮成本、操作難度、使用條件等問(wèn)題，因此發(fā)酵生產(chǎn)方法的融合將是未來(lái)進(jìn)一步研究蟲(chóng)草多糖生產(chǎn)的方向。