曾朝珍，康三江，慕鈺文

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070)

果酒是一種高附加值的水果產(chǎn)品，它含有重要的營(yíng)養(yǎng)成分，如礦物質(zhì)、抗氧化物以及所用水果的芳香氣味。果酒的生產(chǎn)已經(jīng)成為水果加工業(yè)的一個(gè)組成部分，如今，市場(chǎng)上有各種形狀、顏色、味道和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水果，許多水果被廣泛用于生產(chǎn)發(fā)酵飲料。世界各地用于生產(chǎn)果酒的水果除了葡萄外還包括蘋果、樹莓、櫻桃、野生杏、梨、獼猴桃等。隨著消費(fèi)水平的提高，口感佳、營(yíng)養(yǎng)高和風(fēng)味好的果酒更受消費(fèi)者青睞。通過(guò)使用蘋果、樹莓、獼猴桃、火龍果、菠蘿、棗等水果生產(chǎn)復(fù)合果酒，不僅可以克服單一果酒存在酒體單薄、營(yíng)養(yǎng)成分不豐富的缺陷，而且也改善了果酒的理化成分和感官特性。

果皮的主要成分是果膠，是一類以聚半乳糖醛酸為主、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖聚合物。在水果發(fā)酵過(guò)程中果膠酶可對(duì)果膠質(zhì)進(jìn)行分解產(chǎn)生果膠酸和甲醇。甲醇是果酒釀造中產(chǎn)生的對(duì)果酒品質(zhì)不利的代謝產(chǎn)物。因此，需要嚴(yán)格控制甲醇在果酒發(fā)酵過(guò)程中的含量。去皮發(fā)酵可以降低發(fā)酵原料中果膠的含量，從而降低甲醇的含量，但是去皮發(fā)酵對(duì)于復(fù)合果酒其他理化成分影響的研究較少?；诖?，本試驗(yàn)以蘋果和樹莓為原料，研究蘋果去皮發(fā)酵對(duì)復(fù)合果酒理化特性的影響，以期為蘋果樹莓復(fù)合果酒高值化深加工提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：富士蘋果，購(gòu)于甘肅省慶陽(yáng)市；紅樹莓，購(gòu)于甘肅省臨夏州和政縣；釀酒酵母32168，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；果膠酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

試劑及耗材：蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸（均為色譜純），美國(guó)Sigma 公司；天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸（均為色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；總酚、黃酮測(cè)定試劑盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZHJH-C11128 型超凈臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療器械廠；SpectraMax 190 型酶標(biāo)儀，Molecular Devices 公司；RIGOL L-3000 型高效液相色譜儀，蘇州普源精電科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌種活化

參照曾朝珍等的方法將釀酒酵母32168 進(jìn)行活化，活化后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蘋果酒釀造工藝

參照曾朝珍等的接種方式及發(fā)酵工藝，將樹莓和蘋果（去皮和不去皮）按原料比為30∶100 的條件制備蘋果樹莓復(fù)合果汁，于28 ℃下厭氧靜置發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 測(cè)定方法

（1）還原糖、有機(jī)酸、總酸的測(cè)定：參照GB/T 15038—2006的方法測(cè)定。

（2）可溶性固形物、pH 值測(cè)定：采用糖度計(jì)、pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

（3）總酚、黃酮的測(cè)定：采用試劑盒法，參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒說(shuō)明書的操作方法進(jìn)行測(cè)定。

（4）游離氨基酸的測(cè)定：參照饒靜等的方法并作修改。

氨基酸的提取：取樣本清液200 μL 以及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，分別置于1.5 mL EP管中；往每個(gè)離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL；分別加入三乙胺乙腈溶液200 μL（確保pH＞7），異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻后25 ℃下放置1 h。然后加入正己烷400 μL 至離心管，搖晃后放置10 min；取下層溶液，0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾。

HPLC 液相條件：Kromasil C反相色譜柱（250 mm*4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，走樣時(shí)間為45 min。流動(dòng)相A：稱取7.6 g 無(wú)水乙酸鈉，加水925 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH6.5，然后加入乙腈70 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾；流動(dòng)相B：80%乙腈水溶液。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003 進(jìn)行匯總處理，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用DPS 7.05進(jìn)行顯著性差異分析（p＜0.05），采用origin 2019軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果樹莓復(fù)合果酒基礎(chǔ)理化成分分析

表1 為樹莓和蘋果（去皮和不去皮）混合后未發(fā)酵復(fù)合果汁與發(fā)酵后復(fù)合果酒的基本理化指標(biāo)。由表1 結(jié)果可看出，在未發(fā)酵復(fù)合果汁中，除了可溶性固形物、總酸以外，樹莓與不去皮蘋果混合后的果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖、pH 值、總酚、總黃酮含量比樹莓與去皮蘋果混合后的果汁含量高且各理化成分之間存在著顯著差異性（p＜0.05）；樹莓與不去皮蘋果復(fù)合果汁發(fā)酵時(shí)間較樹莓與去皮蘋果混合發(fā)酵少1 d，且最終果糖、葡萄糖、蔗糖含量之間差異不顯著（p ＞0.05），而其他發(fā)酵后的指標(biāo)還是蘋果不去皮復(fù)合發(fā)酵高于蘋果去皮復(fù)合發(fā)酵且存在顯著差異性（p＜0.05）。同一地理來(lái)源樣品的不同部位(果皮和果肉)的理化特性存在顯著差異，果皮中的碳水化合物、脂肪、灰分、抗壞血酸、還原糖和總可溶性固形物含量較高，去皮使未發(fā)酵復(fù)合果汁中還原糖、可溶性固形物、pH 值都降低。蘋果不同部位的酚類化合物組成也不同，與果肉相比，蘋果皮中的酚類化合物含量更高，不去皮復(fù)合果汁酚類物質(zhì)含量高于去皮復(fù)合果汁。發(fā)酵后除了總酸增加以外，其他指標(biāo)與未發(fā)酵果汁相比都降低，且?guī)ぐl(fā)酵果酒中的含量高于去皮發(fā)酵果酒。

表1 樹莓蘋果(去皮和不去皮)復(fù)合果汁與果酒基本理化指標(biāo)

2.2 蘋果樹莓復(fù)合果酒游離氨基酸分析

樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合后未發(fā)酵與發(fā)酵后17 種氨基酸含量的分析結(jié)果見(jiàn)表2、圖1 所示，其不同處理之間氨基酸含量存在顯著差異性（p＜0.05）。

表2 樹莓和蘋果(去皮和不去皮)復(fù)合果汁與果酒氨基酸含量 (μg/mL)

圖1 樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁與果酒氨基酸含量聚類熱圖

表2 結(jié)果表明，在未發(fā)酵復(fù)合果汁中，除了蛋氨酸、賴氨酸以外，樹莓與不去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-B-0）中的氨基酸含量比樹莓與去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-Q-0）中的含量高且成分之間存在著顯著差異性（p＜0.05）；而經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后，除了異亮氨酸以外，樹莓和去皮蘋果發(fā)酵酒（FH-Q-10）與樹莓和不皮蘋果發(fā)酵酒（FH-Q-9）中的氨基酸含量較復(fù)合后未發(fā)酵的氨基酸含量都顯著降低且不同處理發(fā)酵酒之間氨基酸含量差異不顯著（p＞0.05），而胱氨酸在不同處理發(fā)酵酒中均未檢出，發(fā)酵前后大多數(shù)游離氨基酸含量差異顯著。根據(jù)圖1 氨基酸含量聚類分析結(jié)果可以看出，樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合發(fā)酵酒成為一類，而樹莓與去皮蘋果復(fù)合果汁和樹莓與不皮蘋果復(fù)合果汁各自成為一類，此結(jié)果說(shuō)明去皮對(duì)果汁中氨基酸含量影響較大，而發(fā)酵以后其影響不顯著（p＞0.05）。去皮對(duì)復(fù)合果汁中大部分氨基酸含量造成了顯著差異，但發(fā)酵后大多數(shù)游離氨基酸含量差異不顯著（p＞0.05），說(shuō)明復(fù)合果酒中的氨基酸組成結(jié)構(gòu)取決于發(fā)酵過(guò)程。蘋果酒中的氨基酸除了來(lái)源于果汁中的蛋白質(zhì)酶解，還來(lái)自于酵母發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物和發(fā)酵完畢后酵母細(xì)胞的自溶。KATO 等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中的氨基酸在發(fā)酵前后也變化顯著，此研究結(jié)果也只支持本研究中氨基酸含量變化的結(jié)果。

2.3 蘋果樹莓復(fù)合果酒有機(jī)酸分析

樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁和果酒中蘋果酸、乳酸、檸檬酸及琥珀酸的分析結(jié)果如表3、圖2、圖3 及圖4 所示，其不同處理之間有機(jī)酸含量存在顯著差異性（p＜0.05）。

表3 樹莓和蘋果(去皮和不去皮)復(fù)合果汁與果酒有機(jī)酸含量

圖2 樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁與果酒有機(jī)酸含量變化

圖3 樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁與果酒有機(jī)酸含量PCA圖

圖4 樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁與果酒有機(jī)酸含量聚類熱圖

由表3 與圖2 分析結(jié)果可以看出，在未發(fā)酵復(fù)合果汁中，樹莓與不去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-B-0）中的蘋果酸、檸檬酸含量比樹莓與去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-Q-0）中的含量高，乳酸則是在樹莓與去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-Q-0）中較高，并且各成分之間存在著顯著差異性（p＜0.05），琥珀酸雖然在樹莓與不去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-B-0）中較高，但是與樹莓和去皮蘋果復(fù)合果汁（FH-Q-0）中的含量無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；而經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后，樹莓和去皮蘋果發(fā)酵酒（FH-Q-10）與樹莓和不去皮蘋果發(fā)酵酒（FH-B-9）中的乳酸和琥珀酸含量較復(fù)合果汁的含量都顯著增加且不同處理發(fā)酵酒之間含量差異顯著（p＜0.05），而蘋果酸和檸檬酸經(jīng)發(fā)酵后含量較復(fù)合果汁都顯著降低且不同處理發(fā)酵酒之間含量差異顯著（p＜0.05）。根據(jù)圖4 有機(jī)酸含量主成分分析結(jié)果可以看出，樹莓與不去皮蘋果復(fù)合后的果汁（FH-B-0）中蘋果酸和檸檬酸含量最高，樹莓和不去皮蘋果發(fā)酵酒（FH-B-9）中琥珀酸含量最高，樹莓和去皮蘋果發(fā)酵酒（FH-Q-10）中乳酸含量最高；根據(jù)圖5 有機(jī)酸含量聚類分析結(jié)果可以看出，樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合果汁、發(fā)酵酒各自成為一類。除了乳酸以外，去果皮會(huì)使其他有機(jī)酸含量降低，而發(fā)酵使蘋果酸和檸檬酸的含量降低，而使乳酸和琥珀酸含量增加，此結(jié)果說(shuō)明去皮及發(fā)酵都對(duì)有機(jī)酸含量有影響。蘋果酒中的有機(jī)酸類化合物除了一部分來(lái)源于蘋果汁之外，還可以在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。去皮使果汁和復(fù)合果酒中的有機(jī)酸都降低，而發(fā)酵使蘋果酸含量降低，是因?yàn)槠浔晦D(zhuǎn)化成其他化合物所致，檸檬酸在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)與蘋果酸相似。琥珀酸和乳酸是酵母在發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物，也是蘋果酒中重要的有機(jī)酸類化合物，乳酸的酸味柔和，有利于提升蘋果酒的口感。

3 結(jié)論

本研究以樹莓和蘋果（去皮和不去皮）復(fù)合進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)復(fù)合果汁以及果酒測(cè)定相關(guān)的基本理化指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定各類物質(zhì)的含量變化并結(jié)合聚類分析及主成分的分析方法，研究了蘋果去皮發(fā)酵對(duì)復(fù)合果酒理化特性的影響。結(jié)果表明：還原糖、可溶性固形物、pH 值及酚類物質(zhì)含量在去皮未發(fā)酵復(fù)合果汁中都降低；發(fā)酵后除了總酸增加以外，其他指標(biāo)與未發(fā)酵果汁相比都降低，且?guī)ぐl(fā)酵果酒中的含量高于去皮發(fā)酵果酒。氨基酸除了蛋氨酸、賴氨酸以外，去皮復(fù)合果汁中其余氨基酸含量都低于未去皮復(fù)合果汁，而發(fā)酵以后去皮造成的氨基酸含量差異不顯著；有機(jī)酸中除了乳酸以外，去果皮會(huì)使其他有機(jī)酸含量降低，而發(fā)酵使蘋果酸和檸檬酸的含量降低，而使乳酸和琥珀酸含量增加。