石舒婷 王妍

摘 要：為驗證細(xì)胞穿透肽能否增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌作用，選用具代表性的3種氨基糖苷類抗生素（妥布霉素、卡那霉素及鏈霉素）處理平臺期大腸桿菌。在特定抗生素處理濃度和處理時間下，進(jìn)行平臺期大腸桿菌殺傷效果組間比較，用ANOVA算法分析試驗結(jié)果差異性;并使用NPN染色法探究細(xì)胞穿透肽增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌作用機(jī)制。結(jié)果表明：細(xì)胞穿透肽預(yù)處理可以極顯著增強(qiáng)妥布霉素、卡那霉素及鏈霉素殺滅平臺期大腸桿菌，且細(xì)胞穿透肽對大腸桿菌細(xì)胞外膜造成輕微破壞。

關(guān)鍵詞：氨基糖苷類抗生素;多肽;耐藥

中圖分類號：S 858.28?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2022）01-0012-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.01.003

Method of Enhancing the Bactericidal Action of Aminoglycoside Antibiotics by Cell Penetrating Peptides

SHI Shu-ting， WANG Yan*

（Fujian Provincial University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic

Regulation/College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to verify whether the cell penetrating peptides could enhance the bactericidal action of aminoglycoside antibiotics， three representative aminoglycoside antibiotics （tobramycin， kanamycin and streptomycin） were selected to treat Escherichia coli at plateau phase. Under the specific antibiotic treatment concentration and treatment time， the killing effect of Escherichia coli at plateau phase was compared between groups， and the differences of experimental results was analyzed by using the ANOVA algorithm. Then， the NPN staining method was used to explore the mechanism of cell penetrating peptides enhancing the bactericidal action of aminoglycoside antibiotics. The results showed that the pretreatment with cell penetrating peptides could extremely significantly enhance tobramycin， kanamycin and streptomycin to kill Escherichia coli at plateau phase， and the cell penetrating peptides could slightly damage the cell outer membrane of Escherichia coli.

Key words： Aminoglycoside antibiotics; Polypeptide; Drug resistance

自Fleming[1]發(fā)現(xiàn)第一種抗生素（青霉素），其在人類社會健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位[2]，在農(nóng)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中亦擁有不可磨滅的功績。近年來，隨著臨床和養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問題在全球范圍內(nèi)引起高度關(guān)注[3]，找到解決細(xì)菌耐藥問題的方案至關(guān)重要[4]。

目前，全球?qū)?xì)菌耐藥采用的防治對策大致可歸結(jié)為三類：一是建立健全監(jiān)管機(jī)制，控制抗生素濫用：世界衛(wèi)生組織[4]及其成員國已制定相應(yīng)計劃及政策[5];二是加快新型抗生素研發(fā)：包括針對抗MDR革蘭氏陰性菌的新型四環(huán)素、多粘菌素[6]、darobactin[7]等[8]。新型抗生素雖已取得臨床前良好試驗效果，然至今尚未獲得批準(zhǔn)上市，且新型抗生素研發(fā)速度總體呈現(xiàn)下降趨勢[9];三是改善抗生素治療措施：包括抗生素聯(lián)合給藥[10]、“老藥新用”[11]以及改變抗生素處理條件[12]。傳統(tǒng)抗生素使用已有大量研究數(shù)據(jù)支持，其重新使用可能是應(yīng)對細(xì)菌耐藥問題的有效方法。部分氨基糖苷類抗生素（妥布霉素、卡那霉素及鏈霉素）擁有豐富臨床研究數(shù)據(jù)，其殺菌機(jī)制主要是通過與細(xì)菌核糖體30 s亞基結(jié)合[13]，使其發(fā)生讀碼錯誤。

近來，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些具有穿透細(xì)胞膜或核膜能力的氨基酸序列，其序列長度一般不超過30個氨基酸，統(tǒng)稱為細(xì)胞穿透肽[14]。經(jīng)改造和修飾，細(xì)胞穿透肽甚至可以攜帶多種物質(zhì)運送至細(xì)胞內(nèi)特定位置。故利用細(xì)胞穿透肽破膜改變細(xì)菌藥物主動外排機(jī)制，可以降低細(xì)菌耐藥性，增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌。本研究選用1種只含13個氨基酸的細(xì)胞穿透肽，命名為CMP[15]。CMP能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞外膜，提高胞內(nèi)抗生素濃度水平。通過使用CMP預(yù)處理平臺期大腸桿菌，可以增強(qiáng)傳統(tǒng)氨基糖苷類抗生素（妥布霉素、卡那霉素及鏈霉素）殺菌效果，即使用更低濃度氨基糖苷類抗生素和更短處理時間達(dá)到與以往相同甚至更好的殺菌效果。此方法極大減少氨基糖苷類抗生素使用濃度和作用時間，符合當(dāng)前應(yīng)對細(xì)菌耐藥防治策略趨勢。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用大腸桿菌K12 BW25113菌株，細(xì)胞穿透肽（CMP）序列：KFFKFFKFFKGSG（杭州丹港生物科技有限公司，多肽經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量檢測，含質(zhì)譜分析報告和HPLC分析報告，多肽純度在80%以上。）

1.2 主要試劑及試驗溶液

LB液體培養(yǎng)基（每1 L水包含10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母粉）、LB固體培養(yǎng)基（每1 L水包含10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母粉、10 g瓊脂）、0.01 mol·L-1 PBS溶液（每1 L水包含8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鈉）、超純水，以上溶液均經(jīng)過高壓滅菌鍋121℃，30 min濕熱高壓滅菌。其中LB固體培養(yǎng)基滅菌完成后，倒入無菌培養(yǎng)皿中待其凝固即可使用。

妥布霉素（25 mg·mL-1）、卡那霉素（50 mg·mL-1）、鏈霉素（100 mg·mL-1），以上氨基糖苷類抗生素儲液均用超純水配置，并使用0.22 μm濾膜過濾除菌。

NPN熒光染料儲液（1 mmol·L-1），超純水配置，避光保存。

1.3 抗生素對平臺期大腸桿菌殺菌效果檢測

從-80℃冰箱挑取保藏的BW25113大腸桿菌，37℃，220 r·min-1，搖床過夜活化，之后1∶1000接種至含有20 mLLB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床37℃，220 r·min-1，培養(yǎng)至平臺期（16～24 h）。取500 μL細(xì)菌置于EP管中，13000 r·min-1離心3 min，吸取上清（舊LB）置于無菌器皿內(nèi)，用500 μL0.01 mol·L-1 PBS溶液重懸菌體，靜置5 min，再次離心去上清。

用500 μL超純水重懸菌體，各個處理樣品中加入CMP（終濃度10 μmol·L-1）混勻，室溫下靜置處理5 min，離心去上清。加入舊LB培養(yǎng)基，移至玻璃搖菌管中并加入抗生素，搖床37℃，220 r·min-1振蕩處理，每1、3、5 h取樣50 μL，離心去上清，加入500 μLPBS重懸清洗5 min，再次離心去上清，用50 μLPBS重懸，進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋。將稀釋好的菌液滴于正常LB平板上測試細(xì)菌存活情況。

1.4 細(xì)胞穿透肽（CMP）對大腸桿菌外膜破壞檢測

從-80℃冰箱活化菌株BW25113，1∶1 000轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，搖床（37℃，220 r·min-1）培養(yǎng)至平臺期。取100 μL菌液置于EP管中，13000 r·min-1，3 min離心去上清，將沉淀重懸于相同體積的PBS中，靜置5 min，再次離心去上清，后用同體積超純水重懸沉淀，將CMP（終濃度為10 μmol·L-1）加入處理，同時向細(xì)菌溶液中加入等量PBS作為空白對照組處理5 min。離心去上清，將沉淀重懸于同體積PBS中。而后用PBS將菌液稀釋至約為1×108 CFU·mL-1。移至黑色EP管，將5 μL NPN熒光染料（終濃度10 μmol·L-1）添加到黑色EP管中，避光孵育，使用紫外熒光分光光度計在激發(fā)波350 nm和發(fā)射波長420 nm條件下，0、5、10 min監(jiān)測NPN熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞穿透肽（CMP）增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素對平臺期大腸桿菌的殺菌效果

2.1.1 妥布霉素、卡那霉素以及鏈霉素對平臺期大腸桿菌殺菌濃度和處理時間測定 首先，本研究將平臺期大腸桿菌用妥布霉素（Tob）、卡那霉素（Kana）以及鏈霉素（Strep）進(jìn)行單獨殺菌處理，處理終濃度為1000 μg·mL-1和500 μg·mL-1，由圖1可知：除卡那霉素終濃度為500 μg·mL-1時處理平臺期大腸桿菌1、3和5 h均沒有殺菌效果外，其余2種抗生素在處理平臺期大腸桿菌3 h和5 h后都對細(xì)菌造成2～4個數(shù)量級殺傷效果。

2.1.2 細(xì)胞穿透肽（CMP）能夠加強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌效果 根據(jù)上述結(jié)果，將卡那霉素處理終濃度定為500 μg·mL-1，妥布霉素和鏈霉素處理終濃度下調(diào)至250 μg·mL-1。根據(jù)以往試驗結(jié)果，細(xì)胞穿透肽（CMP）預(yù)處理終濃度為10 μmol·L-1。由圖2可知，單獨使用終濃度10 μmol·L-1CMP處理平臺期大腸桿菌，在1、3和5 h內(nèi)均無殺傷效果，故排除CMP自身殺菌情況。CMP預(yù)處理后，細(xì)菌在1 h便被終濃度為250 μg·mL-1妥布霉素殺傷4～5個數(shù)量級，相同濃度下單獨妥布霉素處理組沒有表現(xiàn)出對細(xì)菌殺傷。在3、5 h時，單獨妥布霉素處理組對細(xì)菌表現(xiàn)2個數(shù)量級殺傷，但CMP預(yù)處理組在3、5 h時對細(xì)菌表現(xiàn)出4個數(shù)量級殺傷?？敲顾睾玩溍顾貧⒕闆r亦是如此。

2.1.3 特定濃度細(xì)胞穿透肽（CMP）處理后氨基糖苷類抗生素殺菌效果的定量分析 綜上，優(yōu)化試驗條件，進(jìn)行3次獨立試驗完成定量分析。3次獨立試驗所使用CMP預(yù)處理終濃度為10 μmol·L-1，妥布霉素終濃度為125 μg·mL-1，卡那霉素終濃度為500 μg·mL-1，鏈霉素終濃度為125 μg·mL-1，取樣時間為1、3 h。圖3A為其中1次試驗表型結(jié)果展示，圖3B是3次獨立試驗所得數(shù)值定量統(tǒng)計分析。由圖3B可知，與試驗對照組相比，CMP預(yù)處理組的3種抗生素均表現(xiàn)出對平臺期大腸桿菌更強(qiáng)的殺菌作用。在1 h內(nèi)，CMP預(yù)處理情況下，妥布霉素殺4個數(shù)量級、鏈霉素殺2個數(shù)量級、卡那霉素殺1個數(shù)量級;在3 h內(nèi)，CMP預(yù)處理情況下，妥布霉素和鏈霉素表現(xiàn)出對平臺期細(xì)菌4個數(shù)量級殺傷，卡那霉素亦達(dá)到對細(xì)菌3個數(shù)量級殺傷。根據(jù)試驗結(jié)果得出結(jié)論，CMP預(yù)處理可以促進(jìn)氨基糖苷類抗生素殺菌作用，并且效果極其顯著。

2.2 CMP通過破壞細(xì)胞膜增加傳統(tǒng)氨基糖苷類抗生素殺菌效果

利用NPN熒光染料對CMP處理過的細(xì)菌進(jìn)行染色，以驗證CMP是否破壞細(xì)胞膜。由圖4可知，起始時（0 min）CMP預(yù)處理組熒光強(qiáng)度高于對照組，在隨后5、10 min檢測中，NPN熒光強(qiáng)度一直呈上升趨勢，且數(shù)值增加幅度大;反觀對照組，熒光強(qiáng)度初始處于較低狀態(tài)，隨2次監(jiān)測強(qiáng)度略微上升，不排除部分細(xì)菌自然發(fā)生一個外膜損傷造成上升現(xiàn)象。由此可得，CMP預(yù)處理造成細(xì)菌外膜破壞，且該破壞是輕微不致死的，不破壞細(xì)胞膜生物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

抗生素發(fā)展應(yīng)用與細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，是一種密不可分的關(guān)系，細(xì)菌耐藥性隨抗生素廣泛應(yīng)用而愈演愈烈[16]，新藥研發(fā)難以跟上細(xì)菌自身耐藥性發(fā)展的腳步[17]。本研究從促進(jìn)傳統(tǒng)抗生素殺菌效果的理念出發(fā)，利用細(xì)胞穿透肽CMP對細(xì)菌進(jìn)行短時間預(yù)處理，增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌效果。以妥布霉素為例，單獨抗生素處理的平臺期大腸桿菌，在妥布霉素終濃度為1000 μg·mL-1處理1 h的條件下被殺滅2個數(shù)量級，而經(jīng)CMP預(yù)處理的細(xì)菌，終濃度為125 μg·mL-1妥布霉素處理相同時間，被殺滅3～4個數(shù)量級。在相同處理時間內(nèi)，抗生素濃度下降8倍之多，且殺菌效果不減反增。其余2種抗生素亦展現(xiàn)此種增效現(xiàn)象。本試驗結(jié)果表明，通過細(xì)胞穿透肽預(yù)處理是一種有效增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌的方法。通過熒光染料NPN發(fā)現(xiàn)CMP輕微破壞細(xì)胞外膜，故推測其增強(qiáng)抗生素殺菌效果的機(jī)制是通過破壞細(xì)菌藥物主動外排機(jī)制，提高胞內(nèi)抗生素水平，從而展現(xiàn)更強(qiáng)的殺菌效果。

從生態(tài)學(xué)看來，現(xiàn)代抗生素臨床及農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)等方面的廣泛應(yīng)用[18]為細(xì)菌創(chuàng)造一個與自然進(jìn)化相似且更為苛刻嚴(yán)峻的生存環(huán)境[19]，此種情況頻繁發(fā)生勢必增加細(xì)菌耐藥性基因的進(jìn)化速度、傳播速度以及富集速度[20]。因此，在達(dá)到相同殺菌效果的同時，迂回降低抗生素處理濃度，減緩細(xì)菌耐藥情況發(fā)生，特別是對于早期開發(fā)的一些經(jīng)典抗生素，通過對其殺菌方法“回爐重造”，讓經(jīng)典抗生素再一次為人類所用，于當(dāng)今細(xì)菌耐藥性問題而言不失為一種頗有前景的解決方法。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-12-05

作者簡介：石舒婷，女，1996年生，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥研究。

通信作者：王妍，女，1987年生，博士，副教授，主要從事細(xì)菌外膜蛋白生成研究（E-mail：wangyan@fjnu.edu.cn）。

基金項目：福建省科技廳基金青年創(chuàng)新項目（2018J05056）。

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