胡 娜，解現(xiàn)慈2，張 磊2，柏 平，劉琳琳，來(lái)衛(wèi)東

(1山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，山東 臨沂 276000；2山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院)

腎透明細(xì)胞癌(Renal clear cell carcinoma，RCC)是最常見(jiàn)的一類(lèi)腎細(xì)胞癌，靶向藥物被證明可延長(zhǎng)晚期患者的生存與預(yù)后，但中位生存期仍少于3年。研究腎癌的早期診斷標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)仍具有挑戰(zhàn)性。DNA甲基化作為表觀遺傳中的重要組成內(nèi)容，是腫瘤發(fā)生的早期分子事件，基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化或低甲基化是腫瘤發(fā)生早期的一個(gè)高度靈敏的腫瘤生物標(biāo)志物[1]。泛素結(jié)合酶E2是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組成成員，在調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成及分化等方面都發(fā)揮著重要的作用[1]。本研究主要探討RCC患者外周血清泛素結(jié)合酶UBE2Q1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年7月在山東醫(yī)專(zhuān)附屬醫(yī)院確診的60例RCC患者為實(shí)驗(yàn)組，其中男36例，女24例，平均年齡(57.28±17.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次發(fā)現(xiàn)腎癌；未合并其他部位腫瘤；影像學(xué)檢查診斷為腎臟惡性腫瘤，組織病理學(xué)診斷為RCC；未接受任何形式的抗腫瘤治療。參照2018年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)腎癌TNM分期：Ⅰ期34例、Ⅱ期19例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例。參照2016版WHO/ISUP(WHO/國(guó)際泌尿病理學(xué)會(huì))分級(jí)[2]：G1 15例、G2 28例、G3 11例、G4 6例。另選取同期健康志愿者20例為對(duì)照組，其中男12例，女8例，平均年齡(56.82±16.90)歲。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有入組人員均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1DNA提取及單個(gè)核細(xì)胞分離 兩組均在空腹?fàn)顟B(tài)下取外周靜脈血5 ml，3000 r/min離心5 min，取上層清液2 mL置于EP管中，根據(jù)QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，Germany)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取血清DNA；剩余血細(xì)胞樣品通過(guò)Ficoll-Paque密度梯度離心法進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離。提取的DNA及PBMCs均-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格參照Z(yǔ)ymo Research EZ DNA Methylation-GoldTM Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，先配置Conversion Reagent溶液及M-Wash Buffer溶液，對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。

1.2.2甲基化特異性PCR 甲基化特異性PCR反應(yīng)體系：無(wú)核酶水9.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Taq Premix 12.5 μL，DNA模板2 μL，充分混勻后以4000 r/min離心5 s。擴(kuò)増條件：95℃運(yùn)行5 min預(yù)變性，95℃運(yùn)行45 s變性、58℃運(yùn)行45 s退火，72℃運(yùn)行60 s引物延伸，連續(xù)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，循環(huán)完畢后在72℃運(yùn)行10 min延伸，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行圖像處理。結(jié)果判斷：甲基化特異引物(M)擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化引物(U)未擴(kuò)出目的條帶，為甲基化；U擴(kuò)增出目的條帶，而M無(wú)條帶擴(kuò)出，為非甲基化；兩對(duì)引物均擴(kuò)增出目的條帶，這種情況為部分甲基化，記入甲基化。UBE2Q1甲基化特異性PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3UBE2Q1基因mRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)。Trizol法提取PBMCs中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RT-qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Premix 10μL，cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，無(wú)核酶水8 μL。反應(yīng)條件：95℃、30 s預(yù)變性，95℃、5 s變性，60℃、30 s退火，72℃、30 s延伸，共循環(huán)40次；72℃、7 min終延伸。GADPH為內(nèi)參基因，UBE2Q1與GADPH的PCR引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以UBE2Q1與GADPH的比值作統(tǒng)計(jì)分析。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)比較 實(shí)驗(yàn)組甲基化陽(yáng)性率為21.67%(13/60)，對(duì)照組為65%(13/20)。兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.84，P<0.01)。兩組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)代表性電泳圖結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)代表性電泳圖

2.2實(shí)驗(yàn)組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 不同腫瘤TNM分期患者的UBE2Q1基因甲基化率不同，二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.271，P=0.036)；其他均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組UBE2Q1基因甲基化與臨床指標(biāo)的關(guān)系[n(%)]

2.3實(shí)驗(yàn)組UBE2Q1基因mRNA表達(dá)水平 結(jié)果顯示，腎癌患者中UBE1Q1基因非甲基化的患者mRNA的表達(dá)量為(7.40±1.11)×10-4，甲基化患者為(3.89±0.59)×10-4。二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.94，P<0.01)。

3 討論

DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、惡性腫瘤發(fā)生等重要生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。殷鳳朝等[2]研究發(fā)現(xiàn)，SERP5基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能與RCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，高甲基化可能引起該蛋白表達(dá)降低。林英立等[3]研究表明，腎癌組織PCDH10甲基化陽(yáng)性率較高，與腎癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后不良相關(guān)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)降解了接近80%的蛋白質(zhì)，還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理活動(dòng)過(guò)程。如果泛素-蛋白酶體系統(tǒng)發(fā)生異常變化，就會(huì)導(dǎo)致生物體出現(xiàn)一系列的反應(yīng)，如炎癥、癌癥以及神經(jīng)退化等。因此，該系統(tǒng)可作為潛在的疾病診斷干預(yù)治療靶點(diǎn)。UBE2Q1屬于泛素結(jié)合酶E2家族成員，可以調(diào)控底物蛋白的降解和功能轉(zhuǎn)換[1]。研究顯示，UBE2Q1基因異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，UBE2Q1基因啟動(dòng)子在肝癌患者外周血清中呈低甲基化表達(dá)[4-5]。

許多腫瘤患者的cfDNA中均存在異常的DNA甲基化改變[6-7]。檢測(cè)外周血清cfDNA中腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，有助于腫瘤患者的早期診斷、預(yù)后判斷。本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組外周血清cfDNA中UBE2Q1基因甲基化陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，其mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。提示UBE2Q1基因的低甲基化及mRNA的高表達(dá)在腎癌的發(fā)病過(guò)程中起促進(jìn)作用。有研究顯示，基因的甲基化表達(dá)異常與患者腫瘤大小、分級(jí)等密切相關(guān)[8-9]。本研究分析了UBE2Q1甲基化與患者性別、年齡、腫瘤TNM分期、WHO/ISUP分級(jí)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RCC患者UBE2Q1甲基化率與腫瘤TNM分期具有負(fù)相關(guān)性，與其他無(wú)關(guān)。提示UBE2Q1甲基化率可用于RCC的早期診斷及預(yù)后判斷。

綜上所述，RCC患者外周血清cfDNA中UBE2Q1基因的低甲基化表達(dá)與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后不良相關(guān)。UBE2Q1甲基化指標(biāo)有可能成為RCC早期診斷與預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。