趙東曉，董亞茹，耿兵，王照紅，婁齊年

（山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002）

油用亞麻（Linum usitatissimumL.）又稱(chēng)胡麻，為一年生草本植物，抗逆性強(qiáng)，主要分布于我國(guó)西北、華北等地，是栽培區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)作物［1］。油用亞麻是我國(guó)第五大油料作物，也是世界十大油料作物之一，其籽粒含油量高達(dá)40%左右［2］，且胡麻油含有大量不飽和脂肪酸，如α－亞麻酸和亞油酸等，可降低血壓和膽固醇，預(yù)防心腦血管疾病，被譽(yù)為植物界的“腦黃金”［3］。胡麻籽中富含的亞麻膠，是食品、醫(yī)療、紡織業(yè)的重要原料［4］；種皮中的果膠質(zhì)是一種粘合劑，可作為食品添加劑、化妝品原粉、醫(yī)藥原料等［5］。在可食用植物中，胡麻的木脂素含量最高，是其他植物的75～80倍，木脂素結(jié)構(gòu)與人體雌激素相似，可預(yù)防女性乳腺癌和男性前列腺癌［6］；籽中還含有可溶性纖維，可用于防治結(jié)腸癌和直腸癌［7］。胡麻籽發(fā)芽后總黃酮和總多酚含量升高，抗氧化活性增強(qiáng)，使得胡麻籽副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)深受關(guān)注［8］。胡麻的高附加值使其近年來(lái)種植面積不斷擴(kuò)大，但逆境脅迫嚴(yán)重限制胡麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。土壤鹽堿化是目前世界公認(rèn)的主要非生物脅迫之一，限制植物生長(zhǎng)，對(duì)全球生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅［9］，也嚴(yán)重制約了胡麻的可持續(xù)發(fā)展。因此，如何增強(qiáng)胡麻的耐鹽性及其保健品、藥品的開(kāi)發(fā)利用成為近年的研究熱點(diǎn)。

離子輻射誘變育種是一種經(jīng)濟(jì)、快速有效的育種方式，與傳統(tǒng)育種方法相比，具有快速、突變率高、突變譜寬、后代性狀穩(wěn)定且抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前在植物育種中被廣泛應(yīng)用。其中，60Coγ射線(xiàn)是穿透力強(qiáng)且能量最強(qiáng)的離子輻射，是輻射誘變創(chuàng)制新品種和新種質(zhì)最常用的方法之一［10］，在亞麻育種中的應(yīng)用已有不少報(bào)道，如應(yīng)用60Co－γ輻射育成了含油率高、產(chǎn)量穩(wěn)定、適宜加工的品種內(nèi)亞六號(hào)［11］以及產(chǎn)量高、抗倒伏、抗病能力強(qiáng)的雙亞16號(hào)［12］和高產(chǎn)的寧亞10號(hào)［13］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)60Co－γ輻射在增強(qiáng)植物抗逆性方面也有一定的功效。高睿等［14］利用不同劑量60Co－γ輻射烏拉爾甘草種子，發(fā)現(xiàn)100 Gy的60Co－γ輻射可以顯著促進(jìn)Na2SO4脅迫下烏拉爾甘草幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，提高植株滲透調(diào)節(jié)和抗氧化的能力。李波等［15］研究表明，600 Gy60Co－γ輻射能夠促進(jìn)苜蓿葉片和根中可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減少膜損傷，提高抗氧化酶活性和活性氧清除能力，維持活性氧代謝平衡，從而提高苜蓿的抗鹽性。Qi等［16］研究發(fā)現(xiàn)，50 Gy60Co－γ輻射可以減輕擬南芥（Arabidopsis thaliana）鹽害程度，提高幼苗耐鹽性。

然而60Co－γ輻射在胡麻抗逆性方面的研究卻很少，60Co－γ輻射及鹽脅迫對(duì)胡麻芽苗生物活性物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。胡麻種子較大，種皮較厚，含油量高，對(duì)60Co－γ射線(xiàn)有一定的抗性，因此利用60Co－γ輻射胡麻種子往往需要比其他植物更高的劑量。本研究探索了不同劑量的60Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻種子萌發(fā)特性和幼苗生長(zhǎng)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、丙二醛含量、抗氧化酶活性、生物活性物質(zhì)含量和體外抗氧化活性的影響，以探尋在鹽脅迫下能顯著促進(jìn)胡麻種子萌發(fā)、提升幼苗抗鹽性和提高生物活性物質(zhì)含量的60Co－γ輻射劑量，為胡麻的輻射誘變育種、品種改良及耐鹽性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試胡麻品種為隴亞8號(hào)，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所提供。

試驗(yàn)所用抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。蘆?。?8%）、沒(méi)食子酸（98%）、抗壞血酸（98%）、福林酚試劑、1，1－二苯基－2－硝基苦肼（DPPH，95%）、2，4，6－三吡啶基三嗪（TPTZ，99%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RTOP－1000D智能人工氣候箱（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司），UV－2550紫外分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司），雷磁DDS－307電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器有限公司），凱達(dá)TGL18M高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Varian公司），RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子輻照處理 選取籽粒飽滿(mǎn)、大小均一的胡麻種子送往山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心，進(jìn)行60Co－γ輻射處理，輻射劑量率為10 Gy／min，輻射劑量分別為0、200、600、1000、1500、3000、6000、9000、12000、15000 Gy，共10組，每個(gè)劑量輻射60 g種子，重復(fù)3次。

1.3.2 室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)不同劑量輻射處理的種子用75%乙醇消毒20 min，無(wú)菌蒸餾水沖洗5次，然后均勻地?cái)[放于已滅菌的種子萌發(fā)袋（180 mm×125 mm）內(nèi)，每個(gè)萌發(fā)袋40粒種子。每個(gè)劑量輻射處理的種子分為兩組，一組為鹽脅迫處理組（NaCl），加入100 mmol／L NaCl溶液（1／2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制）30 mL；一組為對(duì)照組（CK），加入1／2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液30 mL。將種子萌發(fā)袋置于萌發(fā)架上垂直培養(yǎng)，萌發(fā)架置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為25℃、光照12 h／d、光照強(qiáng)度為450 lx。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。共進(jìn)行3次萌發(fā)試驗(yàn)。

1.3.3 發(fā)芽和生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 從種子置床之日開(kāi)始，每隔24 h觀(guān)察種子萌發(fā)情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)（以胚根突出種皮1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)），連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d。在置床后第8天，從每個(gè)萌發(fā)袋中隨機(jī)選取10株幼苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗的株高和根長(zhǎng)。用去離子水沖洗所選幼苗，用吸水紙吸干表面水分；將清洗完畢的幼苗從莖基部剪開(kāi)，用萬(wàn)分之一分析天平分別稱(chēng)量地上部分（莖基部以上）和根部的鮮質(zhì)量，然后將其放入55℃烘箱中烘至恒重，稱(chēng)量干質(zhì)量。按照以下公式計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。每項(xiàng)指標(biāo)設(shè)3次平行。

式中，Gt為累計(jì)萌發(fā)種子粒數(shù)，Dt為相對(duì)應(yīng)的萌發(fā)日數(shù)；S為平均株高。

1.3.4 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定采用試劑盒進(jìn)行，其中，過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用過(guò)氧化氫分解反應(yīng)法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，可溶性蛋白（WSP）含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，可溶性糖含量采用蒽酮法測(cè)定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定。具體測(cè)定方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.5 生物活性物質(zhì)含量的測(cè)定 樣品液制備：將各處理下萌發(fā)8 d的胡麻幼苗用去離子水沖洗3遍后冷凍干燥，粉碎；每個(gè)樣品取0.2 g，在室溫下用80%甲醇振搖提取3次，每次2 h，合并3次的提取液并減壓干燥。將收集的濃縮液用80%甲醇定容至10 mL，0.22μm濾膜過(guò)濾后分裝，－20℃保存待測(cè)。

總黃酮含量檢測(cè)：按照文獻(xiàn)［17］的方法測(cè)定胡麻幼苗的總黃酮含量。以蘆丁為對(duì)照品，用80%甲醇溶液分別配制成0.010、0.020、0.040、0.060、0.080、0.100 g／L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時(shí)，用80%甲醇溶液將待測(cè)樣品配制成干重濃度為25 g／L的溶液。將1 mL對(duì)照品或樣品溶液加入到5 mL離心管中，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO260μL，渦旋混勻后靜置6 min，加入10%Al（NO3）360μL，渦旋混勻后靜置6 min，再加入4%的NaOH溶液800μL，用80%甲醇稀釋至2 mL，搖勻后靜置10 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，平行測(cè)定3次，取平均值。以不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品總黃酮含量以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)，結(jié)果表示為mg／g。

總多酚含量檢測(cè)：胡麻幼苗的總多酚含量測(cè)定參考文獻(xiàn)［8］的方法，并稍加改進(jìn)。以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，用去離子水分別配制成0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 g／L溶液，同時(shí)用去離子水將待測(cè)樣品配制成干重濃度為100 g／L的溶液。于5 mL離心管中分別加入50μL對(duì)照品或樣品溶液，加入950μL去離子水稀釋至1 mL，各管分別加入1 mL福林酚試劑，混勻后靜置10 min，然后加入10%Na2CO3溶液2 mL，混勻后25℃遮光反應(yīng)1 h顯色。測(cè)定各管765 nm吸光值，每個(gè)對(duì)照品或樣品平行測(cè)定3次，取平均值。以不同濃度沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品總多酚含量以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)，結(jié)果表示為mg／g。

1.3.6 體外抗氧化活性的測(cè)定 DPPH自由基清除能力法：采用參考文獻(xiàn)［18］中的方法并加以改進(jìn)。將1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）用甲醇配制成濃度為0.065 mmol／L的工作液，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。吸取20μL甲醇，加入100 μL DPPH工作液混勻，計(jì)為A0；吸取20μL待測(cè)樣品溶液加入100μL DPPH工作液混勻，計(jì)為Ai；吸取20μL待測(cè)樣品溶液加入100μL甲醇混勻，計(jì)為Aj。將以上3種溶液避光放置30 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定其在515 nm波長(zhǎng)下的吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。計(jì)算公式：DPPH清除率（%）＝［A0－（Ai－Aj）］／A0×100。

鐵離子還原／抗氧化能力法（FRAP）：采用參考文獻(xiàn)［19］中的方法并加以改進(jìn)。將100 mmol／L醋酸緩沖液（pH 3.6）、20 mmol／L FeCl3溶液和10 mmol／L 2，4，6－三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液（40 mmol／L HCl溶液配置）按照體積比10∶1∶1混勻，即為FRAP工作液，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配，用前置于37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min。以抗壞血酸（VC）為對(duì)照品，分別配制成50、100、250、500、750、1000μmol／L的溶液；取10μL樣品或?qū)φ掌啡芤杭尤?6孔板中，迅速加入300μL FRAP工作液，37℃下測(cè)定各孔593 nm波長(zhǎng)下的吸光值，每個(gè)對(duì)照品或樣品平行測(cè)定3次，取平均值。以不同濃度抗壞血酸對(duì)照品及對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的總抗氧化能力以每克樣品干質(zhì)量含微摩爾抗壞血酸計(jì)，結(jié)果表示為μmol／g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Word和Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與作圖，采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)胡麻幼苗不同處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻種子萌發(fā)特性的影響

由表1可見(jiàn)，無(wú)鹽脅迫時(shí)輻射劑量小于等于6000 Gy對(duì)胡麻種子發(fā)芽率沒(méi)有影響，超過(guò)該劑量后，發(fā)芽率顯著降低。鹽脅迫下，與0 Gy相比，200～1500 Gy60Co－γ輻射可顯著提高胡麻種子發(fā)芽率，提高14.29%～61.90%，1000 Gy時(shí)發(fā)芽率最高；3000 Gy時(shí)發(fā)芽率比0 Gy時(shí)略有降低，但差異不顯著；6000、9000、12000 Gy輻射的發(fā)芽率顯著下降，降幅可達(dá)71.43%～85.71%，15000 Gy下種子不萌發(fā)。

表1 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻種子萌發(fā)特性的影響

無(wú)鹽脅迫時(shí)，60Co－γ輻射劑量對(duì)胡麻種子發(fā)芽勢(shì)的影響與發(fā)芽率一致，只有當(dāng)輻射劑量超過(guò)6000 Gy才顯著降低胡麻種子發(fā)芽勢(shì)。鹽脅迫下，與0 Gy相比，200～3000 Gy60Co－γ輻射均可提高胡麻種子發(fā)芽勢(shì)，增幅18.18%～81.82%，其中600～1500 Gy顯著提高，1000 Gy發(fā)芽勢(shì)最高；當(dāng)輻射劑量達(dá)到6000 Gy后，發(fā)芽勢(shì)顯著降低，劑量越大下降幅度越大，12000、15000 Gy下種子發(fā)芽勢(shì)為零。

無(wú)鹽脅迫時(shí)，0～6000 Gy60Co－γ輻射胡麻種子發(fā)芽指數(shù)沒(méi)有顯著差異，輻射劑量達(dá)到9000 Gy后，發(fā)芽指數(shù)顯著下降。鹽脅迫下，200～3000 Gy60Co－γ輻射時(shí)胡麻種子的發(fā)芽指數(shù)顯著高于0 Gy組，提高了27.81%～99.50%，1000 Gy的發(fā)芽指數(shù)最高；輻射劑量6000、9000、12000 Gy的發(fā)芽指數(shù)與0 Gy相比分別顯著下降了67.83%、79.73%和91.50%，15000 Gy下種子發(fā)芽指數(shù)為0。

無(wú)鹽脅迫時(shí)，0～1500 Gy60Co－γ輻射的胡麻種子活力指數(shù)沒(méi)有顯著差異，輻射劑量達(dá)到3000 Gy后，活力指數(shù)隨劑量增加顯著下降，輻射劑量大于等于12000 Gy時(shí)，由于種子胚根只能突破種皮，不能繼續(xù)生長(zhǎng)，胚芽不能長(zhǎng)出，發(fā)芽指數(shù)不能統(tǒng)計(jì)。鹽脅迫下，200～1500 Gy60Co－γ輻射可提高胡麻種子的活力指數(shù)32.24%～193.13%，600～1500 Gy輻射下可達(dá)顯著水平；3000 Gy的活力指數(shù)比0 Gy低16.64%，輻射劑量繼續(xù)增大時(shí)，因胡麻種子胚芽不能突破種皮，無(wú)法統(tǒng)計(jì)發(fā)芽指數(shù)。

2.2 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表2可見(jiàn)，無(wú)鹽脅迫時(shí)，1500 Gy以下輻射劑量對(duì)胡麻幼苗的株高沒(méi)有顯著影響，超過(guò)該劑量后，株高顯著降低。鹽脅迫下，200～1500 Gy60Co－γ輻射使胡麻幼苗株高增加，與0 Gy相比，提高了5.64%～51.23%，1000 Gy時(shí)株高顯著增加；3000 Gy時(shí)，幼苗株高顯著下降，與0 Gy相比降低30.88%；輻射劑量超過(guò)3000 Gy幼苗地上部生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，沒(méi)有胚芽抽出。

表2 60Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗生長(zhǎng)的影響

無(wú)鹽脅迫時(shí)，1000 Gy以下輻射劑量對(duì)胡麻幼苗的主根長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，超過(guò)1000 Gy后，主根長(zhǎng)隨著劑量的增大顯著減小。鹽脅迫下，200～1500 Gy60Co－γ輻射使胡麻幼苗主根增長(zhǎng)，與0 Gy相比增加了17.56%～114.12%，1000 Gy下增加最多；3000 Gy時(shí)，幼苗主根長(zhǎng)顯著減小，與0 Gy相比降低37.30%；輻射劑量繼續(xù)增大，幼苗根部受鹽脅迫和輻射的嚴(yán)重抑制而無(wú)法生長(zhǎng)。

無(wú)鹽脅迫時(shí)，胡麻幼苗地上部鮮重在3000 Gy以下輻照時(shí)沒(méi)有顯著變化，大于3000 Gy后顯著降低。鹽脅迫下，胡麻幼苗地上部鮮重在200～1000 Gy輻射下比0 Gy增加了14.04%～34.56%，1000 Gy輻射下增加顯著；輻射劑量大于1500 Gy，幼苗地上部鮮重顯著降低，輻射劑量達(dá)到6000 Gy后幼苗無(wú)法生長(zhǎng)。

隨著輻射劑量的增加，胡麻幼苗根系鮮重呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。在無(wú)鹽脅迫時(shí)，根系鮮重在輻射劑量低于3000 Gy時(shí)沒(méi)有顯著變化，但達(dá)到3000 Gy即顯著降低。在鹽脅迫下，胡麻幼苗根系鮮重在200～1000 Gy輻射下比0 Gy增加了13.38%～41.87%，600 Gy和1000 Gy增加顯著；輻射劑量大于1500 Gy后，幼苗根系鮮重顯著低于0 Gy；達(dá)到6000 Gy及以上幼苗根系無(wú)法生長(zhǎng)。

2.3 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗抗氧化酶活性的影響

2.3.1 對(duì)SOD活性的影響 如圖1A所示，正常培養(yǎng)條件下，1500 Gy及以下60Co－γ輻射對(duì)胡麻幼苗葉片SOD活性沒(méi)有顯著影響，3000 Gy及以上顯著降低葉片SOD活性，且輻射劑量越高活性越低。鹽脅迫下，輻射劑量低于1000 Gy使葉片SOD活性升高，200、600、1000 Gy輻射分別比0 Gy增加0.59%、7.18%和14.36%，1000 Gy時(shí)增加顯著；輻射劑量1500、3000 Gy時(shí)SOD活性分別降低2.74%和33.93%，3000 Gy時(shí)下降顯著。

2.3.2 對(duì)POD活性的影響 如圖1B所示，胡麻幼苗葉片POD活性隨著60Co－γ輻射劑量增大表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，均在1000 Gy時(shí)達(dá)到最大值。無(wú)鹽脅迫時(shí)，3000 Gy以下60Co－γ輻射對(duì)POD活性沒(méi)有顯著影響，但超過(guò)3000 Gy則顯著降低葉片POD活性。在鹽脅迫下，與未輻射組相比，葉片POD活性在1000 Gy以下分別升高11.91%、26.01%和52.89%，600和1000 Gy組達(dá)到顯著差異；1500 Gy以上輻射組POD活性顯著性低于未輻射組，1500和3000 Gy輻射組分別降低21.98%和62.99%。

2.3.3 對(duì)CAT活性的影響 如圖1C所示，胡麻幼苗葉片CAT活性隨著60Co－γ輻射劑量增大呈現(xiàn)出上升－下降趨勢(shì)，均在1000 Gy輻射時(shí)達(dá)到最高。在無(wú)鹽脅迫時(shí)，CAT活性在3000 Gy及以下較未輻射組沒(méi)有顯著性變化，6000和9000 Gy60Co－γ輻射時(shí)CAT活性下降顯著。在鹽脅迫下，與0 Gy輻射相比，200～1000 Gy輻射提高胡麻幼苗葉片CAT活性3.88%～27.54%，1000 Gy時(shí)差異達(dá)顯著水平；輻射劑量1500、3000 Gy時(shí)，CAT活性分別下降0.99%和75.92%，3000 Gy時(shí)下降顯著。

圖1 60Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗葉片 抗氧化酶活性的影響

2.4 60Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗MDA含量的影響

由圖2可知，隨著60Co－γ輻射劑量的增大，胡麻葉片MDA含量先下降后上升，1000 Gy時(shí)含量最低，之后隨輻射劑量增加逐漸升高。正常培養(yǎng)條件下，1000 Gy時(shí)的MDA含量與0 Gy時(shí)相比降低顯著，6000、9000 Gy時(shí)升高顯著，其他劑量間沒(méi)有顯著差異。鹽脅迫下，1000 Gy及以下劑量間MDA含量差異不顯著，比0 Gy時(shí)降低15.66%～35.65%；1500、3000 Gy時(shí)MDA含量顯著升高，分別比0 Gy時(shí)高0.94倍和1.84倍。

圖2 60Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗葉片 MDA含量的影響

2.5 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.5.1 對(duì)脯氨酸含量的影響 由圖3A可知，胡麻幼苗葉片脯氨酸含量隨輻射劑量增大先增加后下降，在1000 Gy時(shí)達(dá)到峰值。無(wú)鹽脅迫時(shí)，1000 Gy及以下輻射劑量間差異不顯著，超過(guò)1000 Gy后脯氨酸含量顯著下降，劑量越大下降越多。在鹽脅迫下，與0 Gy相比，僅1000 Gy時(shí)脯氨酸含量顯著升高，增幅22.87%；超過(guò)1000 Gy后，脯氨酸含量下降，3000 Gy時(shí)顯著下降，降幅為27.62%。

2.5.2 對(duì)可溶性蛋白含量的影響 由圖3B可知，胡麻幼苗葉片可溶性蛋白含量在0～1000 Gy不斷增加，之后逐漸減少。無(wú)鹽脅迫時(shí)，0～1500 Gy各劑量間沒(méi)有顯著差異，6000～9000 Gy顯著降低。鹽脅迫下，與0 Gy相比，200～1000 Gy輻射胡麻幼苗葉片可溶性蛋白含量增加2.67%～23.29%，600、1000 Gy時(shí)增加顯著；劑量繼續(xù)增加，可溶性蛋白含量顯著下降，1500、3000 Gy分別下降15.81%和53.66%。

2.5.3 對(duì)可溶性糖含量的影響 由圖3C可知，胡麻幼苗葉片可溶性糖含量隨輻射劑量增加的變化趨勢(shì)與脯氨酸和可溶性蛋白一樣，也在1000 Gy時(shí)最高，與0 Gy相比，無(wú)鹽脅迫時(shí)提高10.91%，但未達(dá)顯著差異，在NaCl脅迫下提高21.22%，差異顯著。輻照劑量達(dá)到3000 Gy后，可溶性糖含量顯著下降。

圖3 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗葉片 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.6 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗生物活性物質(zhì)含量的影響

2.6.1 對(duì)總黃酮含量的影響 由圖4A可見(jiàn)，胡麻幼苗總黃酮含量隨輻射劑量的增大先升高后降低，均在600 Gy劑量下達(dá)到最高值。與CK相比，未輻射組胡麻幼苗總黃酮含量在NaCl脅迫下升高了18.06%，說(shuō)明鹽脅迫可促進(jìn)胡麻幼苗總黃酮的積累。在NaCl脅迫下，200、600 Gy輻射使胡麻幼苗總黃酮含量提高了9.59%和23.71%，600 Gy時(shí)顯著提高。輻射劑量在1000、1500、3000 Gy時(shí)，總黃酮含量分別下降5.72%、23.48%和48.83%，1500、3000 Gy時(shí)下降顯著。

2.6.2 對(duì)總多酚含量的影響 由圖4B可見(jiàn)，胡麻幼苗總多酚含量隨輻射劑量的變化呈現(xiàn)出與總黃酮一樣的變化趨勢(shì)，也均在600 Gy達(dá)到最高值，在鹽脅迫下與0 Gy時(shí)差異顯著。輻射劑量超過(guò)600 Gy后，總多酚含量逐漸下降，無(wú)鹽脅迫時(shí)6000～9000 Gy輻射劑量下顯著降低，鹽脅迫時(shí)1500 Gy及以上時(shí)下降顯著。未輻射條件下，鹽脅迫幼苗的總多酚含量比無(wú)鹽脅迫的升高了26.23%，表明鹽脅迫可提高胡麻幼苗總多酚含量。鹽脅迫下，輻射劑量1000～3000 Gy時(shí)總多酚含量下降了1.77%～42.13%，1500、3000 Gy時(shí)差異顯著。

圖4 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗 生物活性物質(zhì)含量的影響

2.7 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗體外抗氧化活性的影響

2.7.1 對(duì)DPPH清除率的影響 如圖5A所示，胡麻幼苗DPPH清除率隨輻射劑量增大先升高后下降，600 Gy時(shí)DPPH清除率最高。無(wú)鹽脅迫時(shí)，0～600 Gy輻射對(duì)DPPH清除率沒(méi)有顯著影響，當(dāng)輻射劑量超過(guò)1500 Gy后顯著下降。鹽脅迫條件下，0 Gy處理的DPPH清除率比無(wú)鹽脅迫的增加20.35%；200、600 Gy劑量下DPPH清除率比0 Gy分別增加17.35%和27.47%，均達(dá)到顯著差異；1000 Gy及以上時(shí)，DPPH清除率下降6.03%～37.56%，1500 Gy和3000 Gy時(shí)達(dá)到顯著差異。

2.7.2 對(duì)FRAP的影響 如圖5B所示，隨著60Co－γ輻射劑量的增大，胡麻幼苗FRAP值也呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，600 Gy時(shí)達(dá)到峰值。無(wú)鹽脅迫時(shí)，1500～9000 Gy輻射時(shí)FRAP值下降顯著，其他劑量處理間差異不顯著。鹽脅迫條件下，未輻射組的FRAP值比無(wú)鹽脅迫時(shí)提高14.21%；與0 Gy相比，600 Gy時(shí)FRAP值顯著增加了24.59%，而1500、3000 Gy時(shí)FRAP值顯著下降，降幅為22.88%和89.18%。

圖5 60 Co－γ輻射對(duì)鹽脅迫下胡麻幼苗 體外抗氧化活性的影響

3 討論

3.1 適當(dāng)劑量60 Co－γ輻射促進(jìn)鹽脅迫下胡麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)

植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期是對(duì)逆境脅迫最敏感的時(shí)期。種子能夠在逆境條件下發(fā)芽是植物在脅迫條件下生長(zhǎng)發(fā)育的前提，因此，逆境脅迫條件下種子發(fā)芽指標(biāo)也是評(píng)價(jià)植物抗逆性的重要指標(biāo)［20］。研究表明，鹽脅迫下一定劑量的60Co－γ輻射可促進(jìn)海濱錦葵種子萌發(fā)，而高劑量輻射往往會(huì)因破壞種胚而抑制種子萌發(fā)［21］。本研究結(jié)果也表明，1000 Gy及以下劑量60Co－γ輻射可促進(jìn)100 mmol／L NaCl脅迫下胡麻種子萌發(fā)，提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，1000 Gy時(shí)促進(jìn)作用最顯著，說(shuō)明該劑量是促進(jìn)NaCl脅迫下胡麻種子萌發(fā)的最佳劑量。類(lèi)似結(jié)果也已經(jīng)在藜麥［22］、胡楊［23］等植物中得到證實(shí)。分析其原因，一方面可能是適宜劑量的輻射處理刺激了種子內(nèi)部生物自由基或激發(fā)了相關(guān)酶的活性，提高了種子的新陳代謝水平，從而促進(jìn)種子萌發(fā)［24］；另一方面，一定劑量的γ射線(xiàn)輻照可能會(huì)使萌發(fā)中的種子加大對(duì)氧氣的吸收量，刺激種子內(nèi)部產(chǎn)生有機(jī)或無(wú)機(jī)過(guò)氧自由基，可打破種子休眠，激發(fā)相關(guān)RNA或蛋白質(zhì)合成，從而使種子萌發(fā)率得以提高，而高劑量的輻射則造成種子損傷而抑制萌發(fā)［25］。

本研究中，1000 Gy及以下劑量的60Co－γ輻射可以促進(jìn)胡麻幼苗生長(zhǎng)，提高幼苗的株高、主根長(zhǎng)、地上部和根部鮮重。原因一方面可能是低劑量的60Co－γ輻射可刺激幼苗體內(nèi)產(chǎn)生生長(zhǎng)素，從而刺激生長(zhǎng)［26］；另一方面可能是種子時(shí)期接受的γ射線(xiàn)刺激了幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中核酸物質(zhì)和可溶性蛋白的合成［27，28］。本研究還發(fā)現(xiàn)，9000 Gy以上60Co－γ輻射過(guò)的種子在正常生長(zhǎng)條件下可以萌發(fā)，但往往難以長(zhǎng)大存活，不能成苗，說(shuō)明高劑量輻射處理嚴(yán)重破壞了種子的生長(zhǎng)點(diǎn)，抑制了種胚分生細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)［29］。在100 mmol／L NaCl脅迫下，6000 Gy60Co－γ輻射的種子不能成苗，說(shuō)明鹽脅迫和高劑量輻射的雙重脅迫加劇了種子的損傷。

植物種子的抗輻射能力與其大小、種皮厚度、結(jié)構(gòu)、含水率、內(nèi)部物質(zhì)（酚類(lèi)化合物、纖維素等）有關(guān)，胡麻種子較大，種皮厚，且含有亞麻籽油、果膠、亞麻膠等抗輻射物質(zhì)，因此胡麻種子對(duì)60Coγ輻射并不敏感，促進(jìn)其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的最佳劑量與其他植物相比偏大，但與同是油料作物的油菜［30］相似。

3.2 適當(dāng)劑量60Co－γ輻射調(diào)節(jié)鹽脅迫下胡麻抗氧化酶活性

在逆境脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和清除活性氧的平衡會(huì)被打破，積累大量活性氧自由基等過(guò)氧化產(chǎn)物。為了適應(yīng)逆境環(huán)境，保護(hù)自身避免活性氧傷害，植物會(huì)利用體內(nèi)SOD、CAT、POD等抗氧化酶清除過(guò)多的活性氧，以此來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡。SOD將植物細(xì)胞中的活性氧轉(zhuǎn)化成H2O2，POD、CAT則進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，三者協(xié)同配合以清除植物體內(nèi)多余的活性氧［31］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在100 mmol／L NaCl脅迫下，胡麻幼苗葉片中SOD、CAT、POD活性升高，說(shuō)明鹽脅迫下胡麻幼苗通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、POD活性來(lái)清除過(guò)多的活性氧和過(guò)氧化產(chǎn)物，以減輕鹽害，這與余明龍等［32］在大豆上的研究結(jié)果一致。在100 mmol／L NaCl脅迫下，1000 Gy及以下劑量60Co－γ輻射可提高胡麻幼苗葉片SOD、CAT、POD活性，劑量大于1500 Gy時(shí)酶活性下降，說(shuō)明一定劑量的60Co－γ輻射可通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)胡麻抗鹽性。分析原因可能是適宜的60Co－γ輻射可使植物細(xì)胞內(nèi)ATP含量提高，從而調(diào)節(jié)抗氧化酶mRNA的數(shù)量，最終提高酶的數(shù)量，而高劑量輻射會(huì)打破ATP的傳導(dǎo)途徑，最終影響酶的活性［33］；另一方面，低劑量的60Co－γ輻射可上調(diào)編碼抗氧化酶基因的表達(dá)［34］。

3.3 適當(dāng)劑量60Co－γ輻射抑制鹽脅迫下胡麻幼苗的MDA積累

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其含量反映植物膜脂過(guò)氧化程度及植物遭受逆境傷害的程度，含量越高膜脂過(guò)氧化程度越大，是公認(rèn)的衡量質(zhì)膜損傷程度的指標(biāo)，反映了植物的抗氧化能力和抗逆性［35］。在本研究中，正常培養(yǎng)條件下1500 Gy及以下劑量使胡麻幼苗葉片MDA含量下降，說(shuō)明60Co－γ輻射可減輕胡麻幼苗膜脂過(guò)氧化，劑量達(dá)到3000 Gy時(shí)，MDA含量上升，說(shuō)明高劑量的60Co－γ輻射可加速膜脂過(guò)氧化，這與在谷稗［33］、檸檬［36］上的研究結(jié)果一致。鹽脅迫下胡麻幼苗葉片MDA含量升高，說(shuō)明鹽脅迫會(huì)在一定程度上破壞胡麻幼苗細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能；鹽脅迫下1500 Gy以下60Co－γ輻射可降低胡麻幼苗葉片MDA含量，說(shuō)明一定劑量的60Co－γ輻射可保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，緩解鹽脅迫對(duì)細(xì)胞膜的傷害，而高劑量的60Co－γ輻射則加劇了細(xì)胞膜的損傷，這與Qi等［16］對(duì)擬南芥的研究結(jié)果一致，原因可能是60Co－γ輻射刺激了膜脂過(guò)氧化過(guò)程中某些基因的表達(dá)。

3.4 適當(dāng)劑量60Co－γ輻射增加鹽脅迫下胡麻幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

當(dāng)逆境脅迫發(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)主動(dòng)積累可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的滲透勢(shì)，以此保持細(xì)胞內(nèi)部生物膜結(jié)構(gòu)的完整性和蛋白質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性［37］。本試驗(yàn)中，鹽脅迫下胡麻幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量升高，說(shuō)明胡麻在鹽脅迫下通過(guò)積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)抵御鹽脅迫給細(xì)胞帶來(lái)的滲透脅迫，維持水分平衡，這與大豆［38］在鹽脅迫下的反應(yīng)一致。鹽脅迫下一定劑量的60Coγ輻射可顯著提高胡麻幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，而高劑量輻射使脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量下降，表明適宜劑量的60Co－γ輻射可使胡麻幼苗積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)抵御鹽脅迫造成的滲透脅迫，從而提高耐鹽性。鹽脅迫下高劑量60Co－γ輻射會(huì)破環(huán)胡麻幼苗細(xì)胞膜透性，使細(xì)胞膜透性增大，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量下降。這一結(jié)果與在大豆［39，40］、無(wú)芒雀麥［41］上的結(jié)果類(lèi)似。

3.5 適當(dāng)劑量60 Co－γ輻射提高鹽脅迫下胡麻幼苗生物活性物質(zhì)含量和體外抗氧化能力

酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、抗誘變、抗病毒等作用，可預(yù)防動(dòng)脈硬化、冠心?。?2］；黃酮類(lèi)物質(zhì)能有效清除人體內(nèi)氧自由基，具有抗衰老、改善心腦血管疾病、促進(jìn)傷口愈合等作用［43］。DPPH自由基清除能力法和鐵離子還原／抗氧化能力法（FRAP）是常用的測(cè)定植物活性成分體外抗氧化活性的方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［44］。以往研究表明，胡麻芽期總黃酮、總多酚類(lèi)物質(zhì)含量及抗氧化活性比種子時(shí)期高［8］，但目前對(duì)胡麻芽苗生物活性物質(zhì)的研究尚處于起步階段。隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，胡麻的開(kāi)發(fā)利用已不僅僅局限于胡麻籽，胡麻芽苗保健品和藥品的開(kāi)發(fā)同樣具有廣闊前景。鹽脅迫和60Coγ輻射對(duì)植物生物活性物質(zhì)含量和體外抗氧化活性的研究尚少，對(duì)胡麻芽苗生物活性物質(zhì)和抗氧化活性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 mmol／L NaCl脅迫使胡麻幼苗總多酚、總黃酮含量增加，并提升體外抗氧化能力；低劑量（600 Gy）60Co－γ輻射可進(jìn)一步提高胡麻幼苗總多酚、總黃酮含量和體外抗氧化活性，但高劑量輻射卻使總多酚、總黃酮含量和體外抗氧化活性顯著下降。這是因?yàn)樵?0Co－γ輻射、NaCl脅迫的逆境條件下，胡麻通過(guò)積累黃酮類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)來(lái)抵御逆境傷害，維持自身生長(zhǎng)，但輻射劑量超過(guò)一定閾值則嚴(yán)重?cái)_亂了胡麻體內(nèi)生物活性物質(zhì)的合成和代謝過(guò)程。這與UV－B照射對(duì)番茄［45］、紫花苜蓿［43］影響的研究結(jié)果類(lèi)似。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同劑量60Co－γ輻射對(duì)100 mmol／L NaCl脅迫下胡麻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)、抗氧化生理特性、生物活性物質(zhì)含量及體外抗氧化活性的影響，認(rèn)為一定劑量的60Co－γ輻射可促進(jìn)鹽脅迫下胡麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，通過(guò)提高葉片抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低MDA含量來(lái)增強(qiáng)胡麻抗鹽性，以1000 Gy60Coγ輻射的種子抗鹽性最強(qiáng)。一定劑量的60Co－γ輻射可顯著增加鹽脅迫中胡麻芽苗中總黃酮、總多酚等生物活性物質(zhì)含量及體外抗氧化活性，其中以600 Gy60Co－γ輻射最佳。

本研究?jī)H測(cè)定了生理生化指標(biāo)，并未在分子生物學(xué)層面上進(jìn)行更深入的探究。深入探究鹽脅迫下不同劑量60Co－γ輻射對(duì)胡麻基因表達(dá)調(diào)控的影響，揭示60Co－γ輻射增強(qiáng)胡麻抗鹽性和增加生物活性物質(zhì)含量的分子機(jī)制是我們下一步的研究目標(biāo)，以期從生理和分子調(diào)控聯(lián)合機(jī)制開(kāi)展60Co－γ輻射提高胡麻抗鹽性和品質(zhì)的研究。