趙宇，艾雯妍，文思穎，楊曉莉，劉雪,*

1. 西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境修復(fù)與健康研究院，昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650224

隨著人類工農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，采礦、冶金、電鍍、電工、染料和紡織等人為因素造成的土壤重金屬污染是當(dāng)下世界不容忽視的環(huán)境問題[1]?！度珖寥牢廴緺顩r調(diào)查公報》(2014年)顯示，我國耕地土壤點位超標(biāo)率為19.4%，土壤重金屬總超標(biāo)率為16.1%，受重金屬污染的耕地面積約占耕地總面積的1/5，其中Cd超標(biāo)率為7%[2]，As超標(biāo)率為2.7%[3]，分別是耕地土壤位列第一和第三的主要污染物。Cd、As屬“五毒元素”，是危險致癌物質(zhì)，世界范圍內(nèi)土壤Cd背景值為0.01～2.0 mg·kg-1，均值約0.35 mg·kg-1[2]，全球土壤As含量均值為6 mg·kg-1，我國土壤As含量均值為11.2 mg·kg-1，是全球土壤As濃度的近2倍[4]。Cd、As的人為來源廣泛，包括礦山開采、有色金屬冶煉等行業(yè)，農(nóng)藥和化肥固體廢棄物、農(nóng)用塑料薄膜，殺蟲劑、除草劑和磷酸鹽肥料的施放、燃煤、木材保存劑等[5]，此外，污水亦是一個主要人為來源，我國耕地污灌污染面積約占總面積的45%[6]。

植物作為初級生產(chǎn)者，是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)流動的“入口”，而微生物數(shù)量眾多且分布廣泛，參與生物地球化學(xué)循環(huán)并發(fā)揮重要作用。由于重金屬污染廣泛，為穩(wěn)定重金屬含量并降低其毒性，生物在適應(yīng)重金屬脅迫過程中產(chǎn)生了一系列抗重金屬系統(tǒng)，進(jìn)化出多種抗性特征(趨避、直接排出、減弱生物毒性和降低自身敏感度等)[7]。聯(lián)合微生物和植物的不同生態(tài)結(jié)構(gòu)功能可為重金屬污染土壤修復(fù)提供可行途徑。通過植物在土壤中構(gòu)成特異性根際系統(tǒng)，直接或間接活化吸收或固化土壤中重金屬[8]。植物根際是植物根系與土壤形成的微小生境(根表1～2 mm)，在根際微區(qū)，與植物發(fā)生相互作用的大量微生物被稱為根際微生物[9]。利用土壤-微生物-植物的共存關(guān)系，充分發(fā)揮植物與微生物的作用優(yōu)勢，通過移除或固定化提高重金屬污染土壤的修復(fù)效率，最終達(dá)到削減土壤重金屬含量或生物有效性的目的[10]。因此，本文圍繞近年來國內(nèi)外Cd、As污染土壤的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)，基于農(nóng)田土壤及作物Cd、As污染現(xiàn)狀分析，重點概述修復(fù)機制與效率的研究進(jìn)展，以期為重金屬污染土壤的聯(lián)合修復(fù)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 農(nóng)田土壤及作物Cd、As污染現(xiàn)狀(Current pollution status of cadmium and arsenic in farmland soils and crops)

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國農(nóng)田Cd污染面積達(dá)2萬hm2，Cd含量超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品年產(chǎn)量達(dá)14.6億kg[11]。我國原農(nóng)業(yè)部2003年的一項調(diào)查顯示，中國部分地區(qū)糙米中Cd含量為0.4～1.0 mg·kg-1，Cd污染糙米量在10%以上[12]。根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618—2018)，我國農(nóng)用地土壤Cd濃度標(biāo)準(zhǔn)限值為0.3～0.8 mg·kg-1，土壤As濃度標(biāo)準(zhǔn)限值為20～40 mg·kg-1。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(GB 2762—2012)，適用新鮮蔬菜的土壤Cd質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為≤0.05 mg·kg-1，適用于大米的土壤Cd質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為≤0.2 mg·kg-1；適用于谷物、新鮮蔬菜的土壤As質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為≤0.5 mg·kg-1。

我國部分地區(qū)及其他國家污染農(nóng)田土壤及農(nóng)作物Cd含量如表1所示[13]。調(diào)查分析我國湖南、云南、貴州和浙江等地區(qū)Cd污染較為嚴(yán)重(1.9～30.7 mg·kg-1)，青椒、土豆等農(nóng)作物Cd含量達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的0.85倍～6.5倍(0.17～3.29 mg·kg-1vs. 0.2mg·kg-1)。印度、孟加拉和牙買加等國家Cd污染亦較為嚴(yán)重(0.5～13.7 mg·kg-1)，黃秋葵、胡蘿卜和馬鈴薯等塊莖類、茄果類農(nóng)作物Cd含量較高(0.4～6.58 mg·kg-1)，富集系數(shù)(bioconcentration factors, BCF)高達(dá)13.4～70(表1)，但巴基斯坦、荷蘭、牙買加和埃及出現(xiàn)土壤Cd含量與農(nóng)作物Cd含量呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象。

表1 我國部分地區(qū)及其他部分國家農(nóng)田土壤及農(nóng)作物Cd含量Table 1 Cd concentrations in farmland soils and crops in some regions of China and other countries

我國部分地區(qū)及其他國家農(nóng)田土壤及農(nóng)作物As污染情況如表2所示[14]。湖南省、云南省個舊、東川As污染嚴(yán)重，土壤中濃度高達(dá)63.9～302 mg·kg-1，是我國農(nóng)用地土壤As標(biāo)準(zhǔn)限值的1.6倍～7.6倍，該地區(qū)葉菜類農(nóng)作物(小苦菜、白菜等)亦表現(xiàn)出較高As含量(1.26～8.86 mg·kg-1)，為標(biāo)準(zhǔn)限值(0.5 mg·kg-1)的2.5倍～17.7倍。其他國家As污染差異較大(38～14 800 mg·kg-1)，農(nóng)作物As含量多處于標(biāo)準(zhǔn)值以下，但匈牙利土壤As含量超過標(biāo)準(zhǔn)值，為10～2 000 mg·kg-1，蘑菇As含量高達(dá)11.9 mg·kg-1是標(biāo)準(zhǔn)值(0.5 mg·kg-1)的23.8倍。相反，西班牙、澳大利亞和墨西哥土壤As含量高達(dá)789～14 800 mg·kg-1，但水稻As含量較低(0.1～0.2 mg·kg-1)，這一現(xiàn)象與表1中巴基斯坦、荷蘭、牙買加和埃及出現(xiàn)的土壤Cd含量與農(nóng)作物Cd含量呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象相似，表明作物中Cd、As含量與土壤Cd、As含量有一定聯(lián)系，但不完全取決于土壤Cd、As含量，也可能因作物種類、取食部位等而異?？偟膩碚f，相較于重金屬總量，重金屬的生物有效性能更準(zhǔn)確地反映可被作物/植物吸收的量[15]。

表2 我國部分地區(qū)及其他部分國家農(nóng)田土壤及農(nóng)作物As含量Table 2 As concentration in farmland soils and crops in some regions of China and other countries

2 微生物-植物聯(lián)合修復(fù)機制(Mechanism of microbe-plant combined remediation)

2.1 修復(fù)材料

微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)中微生物主要包括叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)、內(nèi)生菌(endophytes)和根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)等。

(1)根際真菌包括腐生和菌根真菌，重金屬污染土壤修復(fù)中應(yīng)用較多的為菌根真菌。AMF是菌根真菌中分布最廣、與農(nóng)林生產(chǎn)關(guān)系最為密切的一類菌根真菌，它能與植物根系形成共生體，可有效改善植物生長狀況，提升植物對重金屬的抗逆性、吸收、轉(zhuǎn)運和富集能力，強化重金屬的植物提取、根系穩(wěn)定化過程，進(jìn)而提高植物修復(fù)效率[48]。

(2)內(nèi)生菌是指生活于健康植物各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌或真菌，一般指內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌[49]，接種內(nèi)生真菌N.coenophialum不僅可以增強宿主植物(例如，葦狀羊茅(Loliumarundinaceum))對重金屬的耐受性，促進(jìn)植物根部生長和吸收、轉(zhuǎn)運Cd，亦可顯著增加其生物量，提高植物提取重金屬能力及重金屬提取修復(fù)效率[50]。

(3)PGPR指能夠在根際或根表面穩(wěn)定存活且在根際附近生產(chǎn)和分泌各種物質(zhì)，直接或間接促生的有益微生物的總稱[51]，大部分PGPR能夠產(chǎn)生生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和乙烯等影響植物生長發(fā)育的植物激素，促進(jìn)側(cè)根和根毛的生長和伸長，增加根系表面積，促進(jìn)植物對營養(yǎng)和水分的吸收，從而產(chǎn)生促生效果[52]。

用于修復(fù)的植物主要為超積累植物，判定標(biāo)準(zhǔn)為地上部分和根部之間的元素濃度比，其中比率>1.0表明污染物主要積聚在地上部分[53]。超積累植物一般具備以下特點：根系具有活化(植物提取)或固定化(植物穩(wěn)定)重金屬的作用；極強的重金屬轉(zhuǎn)運能力，可將吸收的重金屬轉(zhuǎn)運至地上部，表現(xiàn)為較高的地上部/根濃度比；體內(nèi)重金屬濃度大于一定的臨界值，通常為普通植物在同一生長條件下的100倍[54]；地上部對積累的重金屬具有解毒作用，可在重金屬污染土壤生長，且無重金屬毒害現(xiàn)象[55]。今已發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物已超過500多種[56]，目前已發(fā)現(xiàn)的Cd超富集植物約80余種，如東南景天(Sedumalfredii)、龍葵(Solanumnigrum)等[57]，As超富集植物約10余種，如蜈蚣草(Pterisvittata)、大葉井口邊草(Pteriscretica)等[58]。

2.2 修復(fù)機制

植物修復(fù)利用一種或幾種植物來修復(fù)受污染的土壤，靈活且具有成本效益，并被歸類為環(huán)境友好型方法，因降低污染物擴散的風(fēng)險，并通過避免挖掘受污染的場地來保護原始生態(tài)型，可考慮在全球范圍大力實施[59-60]。去除重金屬的3種主要植物修復(fù)機制是植物穩(wěn)定、植物提取和植物揮發(fā)。植物穩(wěn)定限制了重金屬進(jìn)入食物鏈的流動性；植物提取是從土壤中吸附重金屬并積聚在植物組織中；植物揮發(fā)是利用植物的吸收、積累和揮發(fā)而減少土壤中一些揮發(fā)性污染物，即植物將污染物吸收到體內(nèi)后將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)物質(zhì)，并以毒性較小或無害的形式釋放到大氣中。同時，這些機制可能會受到多種因素的影響，例如植物物種、介質(zhì)的性質(zhì)、金屬的生物利用度以及螯合劑的添加等[61-62]。

微生物自身的解毒機理分生物吸附和生物積累2步進(jìn)行，微生物累積過程又可分為胞外富集或沉淀，胞內(nèi)富集、細(xì)胞表面吸附、絡(luò)合。當(dāng)重金屬被吸收轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，微生物通過區(qū)隔化作用將其轉(zhuǎn)運到代謝不活躍區(qū)域(如液泡)封閉起來，或?qū)⒔饘匐x子和熱穩(wěn)定蛋白結(jié)合，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榈投拘螒B(tài)。

微生物-植物聯(lián)合修復(fù)中，微生物能夠在重金屬脅迫下誘導(dǎo)植物抗氧化防御系統(tǒng)、金屬電阻/封存系統(tǒng)啟動，以抵御有氧脅迫對植物的危害，而抗氧化防御系統(tǒng)能力增強可提高植物對重金屬的耐受性，加強植物重金屬抗性來降低植物毒性效應(yīng)。植物修復(fù)效率在很大程度上依賴于重金屬的生物有效性，因此可利用根際細(xì)菌、內(nèi)生菌及菌根真菌作用改變重金屬形態(tài)與價態(tài)，活化土壤重金屬增強植物的吸收積累[63]，不僅如此，其分泌的螯合物還可與植物體內(nèi)重金屬結(jié)合，改變重金屬在植物體內(nèi)的存在形態(tài)，促進(jìn)重金屬向地上部的轉(zhuǎn)運[64-65]，由此提高植物的修復(fù)效率(圖1)。

圖1 植物-微生物聯(lián)合修復(fù)作用機制注：AMF為叢枝菌根真菌；ACC為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶；CTK為細(xì)胞分裂素；GAs為赤霉素；IAA為吲哚乙酸。Fig. 1 The mechanism of microbe-plant combined remediationNote: AMF means arbuscular mycorrhizal fungi; ACC means 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase; CTK means cytokinin; GAs means gibberellins; IAA means indoleacetic acid.

2.2.1 微生物及植物重金屬抗性機制

微生物-植物聯(lián)合修復(fù)中，關(guān)于功能性微生物菌種、微生物解毒機理和植物抗性的過程機理等已有較多報道[66-67]。菌根真菌菌絲外表面的松結(jié)合態(tài)黏液、真菌分泌物(摩西球囊霉等)、真菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜組分(殼聚糖、黑色素、纖維素及其衍生物等)均能吸附或螯合重金屬，其中殼聚糖對外源重金屬的吸附/螯合率高達(dá)90%，重金屬大量固定吸收積累在植物根及真菌中，由此降低重金屬對植物的毒害作用，提高植物金屬抗性[68-70]。

超富集植物具有極強的重金屬富集能力歸因于其特有的重金屬耐受、吸收、轉(zhuǎn)運和解毒機制，Cd可通過與三葉鬼針草(Bidenspilosa)體內(nèi)小分子有機酸和植物螯合肽等物質(zhì)結(jié)合及細(xì)胞壁吸附和液泡隔離等方式降低細(xì)胞質(zhì)中游離金屬離子濃度，降低金屬離子毒性，通過高效解毒提高植物的重金屬抗性[71]，同時激活抗氧化酶抵抗重金屬毒性，包括過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(aseorbate peroxidase, APX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)等[72]?？寡趸缚汕宄亟饘俣拘运a(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，增強植物對重金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的耐受性，抗氧化酶大多是電子供體，可與自由基反應(yīng)，ROS在與其特定位點結(jié)合后將轉(zhuǎn)化為無毒和無活性產(chǎn)物(H2O等)[73]。另外，Cd處理誘導(dǎo)龍葵(Solanumnigrum)大量產(chǎn)生ROS和積累硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(thiobarbituric acid-reacting substances, TBARS)，同時根系抗氧化酶CAT和SOD活性分別增加57%和38%，植物非蛋白巰基(NPT)總量提高2.4倍，半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)分別被消耗34.8 mol·g-1和13.32 mol·g-1[74]。豨薟(SiegesbeckiaorientalisL.)在Cd脅迫下通過上調(diào)熱激蛋白70基因、重金屬耐受蛋白基因和捕光葉綠素蛋白前體基因等，提高Cd的耐受性，有效抵御氧化損失，此外，通過天然抗性巨噬細(xì)胞蛋白家族(NRAMP)調(diào)控Cd跨膜運輸，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族、P型-ATPase調(diào)控Cd在液泡中的區(qū)隔化，提高對Cd的解毒能力[75]。芥菜(BrassicajunceaL.)在160 mmol·L-1Cd水培處理下，GR活性提高3倍，非蛋白巰基化合物(non-protein thiols, NP-SH)、GSH含量的增加和GR的高活性使BrassicajunceaL.對Cd的抗性增強[76]。

As通過產(chǎn)生各種ROS在植物中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起運輸、代謝過程變化和抑制生長等一系列反應(yīng)[77]，因此激發(fā)抗氧化系統(tǒng)被認(rèn)為是植物響應(yīng)As等重(類)金屬脅迫的重要機制[78-79]，而SOD在As超富集植物蜈蚣草(P.vittata)和井欄邊草(P.multifida)中As積累和解毒中發(fā)揮重要作用[80]。P.vittata等As超富集植物可高效消除As暴露產(chǎn)生的氧化脅迫，As對細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，形成ROS而毒害細(xì)胞。用As處理P.vittata時，其體內(nèi)非酶類抗氧化物和抗氧化酶等均隨As濃度的升高而增加[81]，表明As暴露可對P.vittata產(chǎn)生氧化脅迫。對比超富集植物P.vittata與非超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)對As的脅迫響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)非超富集植物P.ensiformis體內(nèi)抗氧化酶活性顯著低于超富集植物P.vittata，且膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)和TBARS濃度顯著高于P.vittata，表明超富集植物具有較強的抗氧化脅迫能力[82]。水培體系中，P.multifida體內(nèi)As(Ⅲ)占比高達(dá)33%，可能是將As(Ⅲ)通過水/甘油轉(zhuǎn)運蛋白運輸、儲存和隔離在液泡中以降低其對植物的毒性[83]。土培實驗中，隨土壤As含量增加，P.vittata和P.multifida根/葉片砷酸鹽還原酶(arsenate reductase, AR)活性增加，P.vittata根/葉片SOD活性顯著增加，表明AR和SOD在As積累和解毒方面具有重要作用[80]。另外，歐洲鳳尾蕨(Pteriscretica)中PcACR2和PcACR3基因編碼的功能蛋白可在As脅迫下執(zhí)行As(Ⅴ)還原和As(Ⅲ)跨膜轉(zhuǎn)運，且轉(zhuǎn)錄水平與非超富集植物相比分別增加了6.5倍和45倍，表明PcACR2和PcACR3的轉(zhuǎn)錄明顯具有As響應(yīng)性[84]。

2.2.2 微生物-植物共生機制

植物在重金屬污染土壤生長過程中伴生數(shù)量龐大、種類繁多的可耐受高濃度重金屬的微生物，其進(jìn)化過程中產(chǎn)生了重金屬耐性，并與植物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[64]，這一現(xiàn)象可歸因于菌根共生體形成的物理性防御體系和產(chǎn)生的生化拮抗物質(zhì)，以及通過改善宿主植物的營養(yǎng)狀況、改變植物根系形態(tài)和改變根際環(huán)境的理化情況等途徑調(diào)控植物的生理代謝過程[85]。在協(xié)同與共生作用下，菌根、內(nèi)生菌與根系形成共生體，通過改變土壤pH、釋放螯合劑及誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)改變重金屬的形態(tài)和生物有效性，強化植物修復(fù)過程[85]，促進(jìn)根系發(fā)育生長，提高抗毒能力、存活率和生長率，加強植物根系對重金屬的吸收和向植物地上部的轉(zhuǎn)運。

從Cd超積累植物東南景天(S.alfredii)體內(nèi)分離的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)SaMR12能夠分泌大量吲哚乙酸(IAA)[86]，增加植物根長及根表面積，分泌有機酸絡(luò)合Cd，提高對Cd的耐受能力，上調(diào)天然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Nramp)、重金屬ATP酶(HMA)等家族基因的表達(dá)和對Cd的吸收[87]。同時，As超富集植物蜈蚣草(P.vittata)內(nèi)生菌芽孢桿菌(Bacillussp.)、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)等亦能分泌IAA來提高植物對As耐性[88]，其地上部寄生的抗As細(xì)菌(AsRB1)可將As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)[89]。叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)對P.vittata根系的侵染率約為50%，顯著提高P.vittata地上部生物量[90]。

目前，關(guān)于微生物對植物重金屬抗性與解毒機理的研究主要集中在運用植物激素、有機酸等提高重金屬抗性的作用，在分子水平上對其抗性機制的研究已有報道，研究表明一些細(xì)菌質(zhì)粒中含有Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ag+、Co2+和Pb2+等抗性基因，如在汞抗性系統(tǒng)中含有汞還原酶基因，可將有毒的汞離子轉(zhuǎn)換為毒性較小的揮發(fā)性金屬汞[91]。

2.2.3 土壤重金屬活化機制

一般植物在吸收非必需金屬元素時均會表現(xiàn)出一定的中毒癥狀，但超富集植物可以吸收數(shù)倍甚至數(shù)百倍于普通植物所能吸收的量，解釋這種現(xiàn)象的可能機制是超積累植物能夠活化根際土壤中重金屬[92]。微生物可分泌氨基酸、有機酸等代謝產(chǎn)物，溶解重金屬化合物和礦物，提高金屬元素的生物有效性，促進(jìn)植物根系對重金屬的吸收[65]。生物表面活性劑可通過與土壤液相中的游離金屬離子絡(luò)合、降低界面張力使土壤中重金屬離子與表面活性劑直接接觸2種方式促進(jìn)對土壤中重金屬的吸收[93]。根系分泌物中低分子量有機酸(如羧酸、酚酸等)，可通過酸化作用降低根際土壤pH、改變土壤氧化還原電位及重金屬絡(luò)合作用，促進(jìn)土壤重金屬溶解、活化，進(jìn)而促進(jìn)植物吸收[94]。根系分泌物的分泌機制主要包括：根內(nèi)分泌物合成與代謝、細(xì)胞質(zhì)膜陰離子通道啟動和促進(jìn)胞內(nèi)有機陰離子物質(zhì)外排，該過程受環(huán)境脅迫影響，研究表明，重金屬脅迫可誘導(dǎo)植物有機酸分泌增強，進(jìn)而促進(jìn)土壤重金屬活化[95]。

研究發(fā)現(xiàn)，東南景天(S.alfredii)可能通過誘導(dǎo)根系分泌癸酸、苯甲酸、月桂酸、壬酸、果糖、赤蘚糖醇、羥基乙酸、甘露醇、海藻糖、核糖醇和磷酸等活化Cd促進(jìn)植物吸收，亦可通過降低有機酸分泌減少Cd活化以提高植物耐受力，表明S.alfredii通過改變根系分泌物的組成或含量來耐受或吸收Cd[96]。

蜈蚣草(P.vittata)具有獨特穩(wěn)定的植酸酶，使其能夠在低磷土壤環(huán)境中獲取磷，除了對缺磷土壤的自然適應(yīng)性外，包括植酸酶在內(nèi)的磷酸酶可有效地從植酸鹽和其他有機磷中水解無機磷，與As進(jìn)行競爭吸收，提高對As的抗性[97]。As脅迫下，As超富集植物P.vittata、Pterismultifida等蕨類植物主要根系分泌物植酸和草酸的占比達(dá)93%以上，而在其他植物根系分泌物未檢測出植酸，表明植酸是蕨類植物特異性根系分泌物。As脅迫使蕨類植物植酸分泌量增加，P.vittata植酸分泌量比非超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)高262%，植酸含有6個磷酸根基團和12個可解離質(zhì)子，與Fe有較強的配位能力，從而促進(jìn)根際FeAsO4溶解，有效增強P.vittata吸收Fe和As[98]。

2.2.4 葉細(xì)胞重金屬解毒機制

液泡隔離是植物維持體內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)、降低毒性的重要方式。液泡中的硫肽和有機酸可與重金屬離子螯合，降低游離金屬離子活性，降低其對細(xì)胞器的毒性[99]。例如，As超積累植物P.vittata根系可將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)，經(jīng)木質(zhì)部被高效轉(zhuǎn)運至地上葉片(木質(zhì)部As(Ⅲ)轉(zhuǎn)運速率是As(Ⅴ)的近9倍)[100]，而后通過谷氧還蛋白基因GRX5直接或間接與液泡膜跨膜蛋白作用，將As(Ⅲ)轉(zhuǎn)運至液泡[101]，通過液泡隔離降低As毒性。另外，金屬硫蛋白(metallothionein, MTS)是一類普遍存在具有結(jié)合金屬能力和高誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)，當(dāng)擬南芥金屬硫蛋白基因At MT2a和At MT3在蠶豆中表達(dá)時，可降低Cd對保衛(wèi)細(xì)胞的毒性作用，避免葉綠體降解[102]，植物感應(yīng)Cd脅迫后，可產(chǎn)生植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase, PCS)促進(jìn)植物螯合肽(phytochelatin, PC)的形成，螯合肽捕獲Cd并形成低毒螯合物，將其隔離在液泡中[103]。此外，細(xì)胞壁果膠被認(rèn)為是將Cd阻滯在細(xì)胞壁的關(guān)鍵物質(zhì)[104]，西紅柿(Solanumlycopersicum)細(xì)胞壁果膠含量及果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)活性與細(xì)胞壁Cd累積量呈正相關(guān)[105]。

3 聯(lián)合修復(fù)技術(shù)應(yīng)用效率與限制因素(Efficiency and influencing factors of combined remediation)

3.1 應(yīng)用效率

植物/微生物在重金屬脅迫條件下可誘導(dǎo)抗氧化防御系統(tǒng)降低重金屬的毒性作用，提高植物/微生物對重金屬的耐受性，以此提高微生物對重金屬的活化/鈍化和植物對重金屬的吸收富集[90]。

一些特定的微生物可以明顯提高植物對于土壤中重金屬污染物的去除效率[106]。綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的添加可能使污染土壤中的Ca2+、Mg2+等離子浸出，并對植物吸收Cd產(chǎn)生競爭，降低水稻籽粒Cd含量，增加干質(zhì)量和籽粒中礦質(zhì)養(yǎng)分的積累[107]，同時具有溶解磷酸鹽產(chǎn)生生長素的作用[108]。印度芥菜(Brassicajuncea)根系分泌的特殊物質(zhì)，可專一性地溶解根系土壤難溶態(tài)Cd，接種25 mL菌液后，Brassicajuncea地上、地下部Cd含量達(dá)到21.1 mg·kg-1和8.76 mg·kg-1，同時土壤Cd降低4.43%[109]。接種巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumdeBary)使得伴礦景天(Sedumplumbizincicola)地上部和地下部生物量分別提高8.7%～66.7%和13.6%～81.8%，且地上部Cd含量提高29.2%～60.4%，土壤Cd去除率26.7%～42.9%[110]。張云霞等[111]發(fā)現(xiàn)鬼針草(B.pilosa)對Cd表現(xiàn)出穩(wěn)定積累特性和較強富集能力，鬼針草修復(fù)Cd污染土壤的Cd去除率為12.9%～18.6%。從污染土中篩選出的絲核菌(Rhizoctoniasp.)可產(chǎn)生類似赤霉素的活性物質(zhì)，在一定程度上可促進(jìn)超積累植物P.vittata生長，減輕P.vittata根系質(zhì)膜損傷，提高其生物量和對As的吸收能力，且促進(jìn)As從地下部向地上部轉(zhuǎn)運，接種后P.vittata地上部、地下部As含量高達(dá)4 916 mg·kg-1和1 207 mg·kg-1[112]。與未接種的對照組相比，接種內(nèi)生菌短小芽孢桿菌(B.pumilus)E2S2顯著增加了東南景天(S.plumbizincicola)中Cd的積累，增加了43%[113]。接種卷邊網(wǎng)褶菌(Paxillusinvolutus)可使毛枝柳(Salixdasyclados)莖中Cd總含量顯著增加，從每株植物0.89 g增至1.08 g，增量高達(dá)22%，與非生物增強土壤相比，Paxillusinvolutus的可萃取Zn、Cd、Pb和Cu的濃度分別提高了1.33倍、1.22倍、1.33倍和1.11倍[114]。

對近幾年研究運用微生物-植物聯(lián)合修復(fù)Cd、As污染農(nóng)田土壤的部分應(yīng)用案例進(jìn)行了系統(tǒng)歸納總結(jié)，如表3所示。

表3 微生物-植物聯(lián)合修復(fù)Cd、As污染土壤應(yīng)用Table 3 Application of microbial-plant combined remediation of Cd and/or As contaminated soils

續(xù)表3污染元素Pollution element微生物Microorganism植物Plant土壤Cd或As含量/(mg·kg-1)Soil Cd or As concentration/(mg·kg-1)修復(fù)作用機理Remediation mechanism土壤Cd或As含量降低效率Soil Cd or As content reduction efficiency參考文獻(xiàn)ReferencesAs代爾夫特菌Delftia sp.蜈蚣草Pteris vittata83.6增強對重金屬脅迫的抵抗力,提高蜈蚣草生長發(fā)育和As吸收Enhance the resistance ability to heavy metals stresses, and improve plant growth and As uptake of Pteris vittata植物生物量增加了53%,As吸收增加了44%Plant biomass was increased by 53% and As uptake was increased by 44%[121]叢枝菌根真菌Arbuscular mycorrhizal fungi蜈蚣草Pteris vittata0.12菌根定植增加P轉(zhuǎn)運蛋白的合成來增加P吸收能力Mycorrhizal colonization increases the synthesis of P transporters to increase P uptake capacity蜈蚣草生物量增加7.08 g·pot-1The biomass of Pteris vittata was increased by 7.08 g·pot - 1[122]代爾夫特菌Delftia sp. Ts33蜈蚣草Pteris vittata83.6根際微生物活動增強植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,提高植物對病原的抵抗能力The activity of rhizosphere microorgan-isms enhances the uptake of nutrients by plants and improves the resistance to pathogens施用菌劑處理蜈蚣草的生物量增加18%～53%The biomass of Pteris vittata was increased by 18%～53% with bacterial agents[123]沙雷氏菌Serratia sp. MSMC541羽扇豆Lupinus luteus2.2 Cd13.3 As對多種重金屬As、Cd具有耐性且菌種細(xì)胞壁可大量吸附重金屬It is resistant to various heavy metals in-cluding As and Cd, and the cell wall of the strain can absorb a large amount of heavy metals羽扇豆As、Cd地下-地上轉(zhuǎn)運降低10%～50%,植物生物量提高10%～40%As and Cd transport from the root to the shoot of Lupinus luteus was decreased by 10%～50%, and plant biomass was increased by 10%～40%[124]摩西球囊霉G. mossea白三葉草Trifolium repens82.7增強植物根系對重金屬的屏障作用,降低重金屬毒性作用,促進(jìn)植物生長Enhance the barrier effect of plant roots towards heavy metals, reduce the toxicity of heavy metals, and promote plant growth白三葉草植物干質(zhì)量增加3.62 g·pot-1The dry weight of Trifolium repens was increased by 3.62 g·pot-1[125]

3.2 限制因素

3.2.1 土壤理化性質(zhì)

植物、微生物生存均需特定的適宜環(huán)境條件范圍，超出或低于均會影響生存，從而導(dǎo)致土壤pH值、水分和溫度等對聯(lián)合修復(fù)效率具有一定程度的影響。當(dāng)pH<5時，植物和微生物活性均受抑制[10]，在土壤pH=3極酸條件下，多年生黑麥草(Loliumperenne)和蒲公英(Taraxacummongolicum)種子無法萌發(fā)，影響植株生長和Cd吸收富集能力，當(dāng)土壤pH由5.5降至4.5時，Loliumperenne地上部、地下部Cd含量分別降低12 mg·kg-1和106 mg·kg-1，Cd富集系數(shù)顯著降低[126]。一些常見微生物如摩西球囊霉(Glomusmosseae)適宜中性或略堿性(pH 5.8～6.8)土壤環(huán)境，珍珠巨孢囊霉(Gigasporamargarita)適宜微酸性(pH 4.3～5.1)土壤條件。此外，不同AMF對pH的適應(yīng)范圍也不盡相同，如球囊霉屬(Glomus)多出現(xiàn)在pH=5～9土壤中，而無梗囊霉(Acaulospora)、巨孢囊霉屬(Gigaspora)和盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)則主要出現(xiàn)在pH<7土壤中[127]。

3.2.2 土壤重金屬形態(tài)與生物有效性

重金屬的吸附解吸、溶解沉淀和氧化還原平衡等決定著土壤溶液中重金屬濃度。在一定條件下，吸附態(tài)和沉淀態(tài)可相互轉(zhuǎn)換，通過降低pH使吸附態(tài)重金屬解吸進(jìn)入土壤溶液，從而增加植物對重金屬的吸收積累。植物對Cd的敏感性可能與Cd在土壤中主要以可交換態(tài)和有機質(zhì)結(jié)合態(tài)形式存在有關(guān)，其結(jié)合力較弱，Cd易釋放至土壤溶液，增加土壤生物有效態(tài)Cd含量[15]。As則與其相反，在土壤中以陰離子形式存在，提高pH使土壤顆粒表面負(fù)電荷增加，可減弱As的吸附作用，提高土壤溶液中有效態(tài)As含量，促進(jìn)植物As吸收[128]。

3.2.3 根際微生物與修復(fù)植物種類

植物類型影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)，根系脫落物、分泌物等物質(zhì)是維持根際微生物數(shù)量和活性的重要因素[129]。根際微生物通過定殖、競爭、共生和調(diào)節(jié)土壤營養(yǎng)動態(tài)等活動影響植物生長，不同微生物在植物根際的功能不同[130]。主要體現(xiàn)在根際細(xì)菌通過改變重金屬價態(tài)及賦存形態(tài)(絡(luò)合態(tài)、脫烷基)來降低重金屬毒性；根際真菌通過輔助宿主植物獲取礦質(zhì)營養(yǎng)[131]，提高寄主植物生物量。同時，外部因素對根際微生物產(chǎn)生影響，通過根際微生物影響植物[132]。例如，棉花枯萎孢子萌發(fā)實驗中，在抗病健株根分泌物作用下枯萎孢子萌發(fā)率為22.4%～26.3%，而在感病健株根分泌物中孢子萌發(fā)率為34.9%～57.7%，說明感病健株根分泌物可刺激孢子萌發(fā)[133]，而根分泌物中的糖類、氨基酸可能作為營養(yǎng)源，通過影響根際微生物的種類、數(shù)量及分布，提高微生物種群的數(shù)量，間接制約病原微生物的生長[134]。另外，植物種類不同，根際微生物的多樣性和優(yōu)勢種有顯著差異[135]，重金屬土壤中根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)會因為植物的種植而發(fā)生改變，同時根際細(xì)菌群落的相互作用也會影響植物的多樣性與修復(fù)效果。不同As濃度下，考察荊(Cirsiumarvense)和簇毛草(Deschampsiacaespitosa)的根系異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量，由EUB338探針混合物估計的細(xì)菌數(shù)量D.caespitosa顯著高于C.arvense樣品中，分別為7.27 logCFU·g-1和6.29 logCFU·g-1[135]。

4 結(jié)論與展望(Conclusion and prospect)

近年來，微生物-植物聯(lián)合修復(fù)Cd、As污染土壤的研究與應(yīng)用因其成本低、對土壤和環(huán)境的破壞較小以及適用于多金屬污染場地等優(yōu)點，前期關(guān)于植物根際細(xì)菌已有較多文獻(xiàn)報道，植物內(nèi)生菌可更高效提高污染土壤的植物修復(fù)效率，但其在重金屬污染農(nóng)田土壤修復(fù)的實際應(yīng)用較少。目前，一些低累積農(nóng)作物品種-微生物的協(xié)同作用和低累積農(nóng)作物品種替代種植等“邊產(chǎn)出邊修復(fù)”的模式不僅可維持農(nóng)田土壤的種植價值，亦可控制Cd、As等重金屬的食品安全風(fēng)險，但同時針對不同重金屬污染物種類、污染程度和栽培方式等情況篩選高抗、低累積作物品種亦是亟待解決的問題。

現(xiàn)有關(guān)于微生物-植物聯(lián)合修復(fù)Cd、As污染土壤的研究報道多為實驗室研究成果，農(nóng)田應(yīng)用相對較少。這是由于田間條件通常極端且惡劣，細(xì)菌接種物一般只能存活數(shù)小時到數(shù)天；各超富集植物對重金屬耐受性不同，導(dǎo)致大規(guī)模任務(wù)需要農(nóng)業(yè)設(shè)備的經(jīng)驗和專業(yè)知識，且完全修復(fù)場地所需的時間相對較長等，這一系列問題阻礙了農(nóng)田修復(fù)的有效實施。

農(nóng)田土壤重金屬污染復(fù)雜多元，污染來源多樣且具有協(xié)同效應(yīng)，修復(fù)過程困難、對象單一、效率較低?，F(xiàn)有修復(fù)技術(shù)在Cd、As污染土壤治理中已取得一定發(fā)展，但面臨農(nóng)田土壤Cd、As污染的嚴(yán)峻形勢，可從多手段聯(lián)合修復(fù)角度開展深入研究，具體包括：

(1)進(jìn)一步篩選根際抗性促生微生物和高效植物，建立微生物、植物資源庫，優(yōu)化微生物-植物聯(lián)合修復(fù)配置組合，挖掘微生物和植物互作機制及協(xié)同機制，結(jié)合重金屬污染結(jié)構(gòu)、污染特征、污染程度，準(zhǔn)確、高效、針對性修復(fù)重金屬污染。

(2)以現(xiàn)有微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展微生物-植物-改良劑、復(fù)合微生物-植物等技術(shù)，聯(lián)合多種修復(fù)技術(shù)實現(xiàn)重金屬復(fù)合污染修復(fù)并進(jìn)行實際應(yīng)用。

(3)根際微生物多樣且大量不可培養(yǎng)微生物有待挖掘，可充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)，通過基因篩選、分離、克隆和編輯等手段，加強微生物遺傳改良，為獲得具有多種重金屬抗性的微生物增加可能性。

(4)目前大量農(nóng)田因農(nóng)藥、化肥的大量使用使土壤肥力下降，理化性質(zhì)破壞嚴(yán)重，在修復(fù)方法實際應(yīng)用中，結(jié)合植物物種和微生物對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性，研究不同組合方式聯(lián)合修復(fù)在不同生態(tài)環(huán)境的實際應(yīng)用效果，因地制宜達(dá)到修復(fù)目的。