譚 潔，陳思伊，梁善范，陸亦在，黃 麗，蘇 穎

(南寧市疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530023)

藥物濫用幾乎在每個國家都是越來越多，它們常與犯罪行為、健康危害、事故、災(zāi)難等聯(lián)系在一起，危害極大[1-2]。因此，社會需要付出巨大的財力去減少或制止這種濫用。大多數(shù)藥物濫用都是非法的。目前測定人尿中濫用藥物的方法主要有液相色譜法(LC)[3]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[4]、氣相色譜法(GC)[5]和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[6-7]。GC-MS聯(lián)用技術(shù)以其特有的優(yōu)勢在添加藥物檢測中發(fā)揮著重要的作用[8]，其同時具有氣相色譜高分離性能及質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點，既快速又準(zhǔn)確。而當(dāng)前GC-MS聯(lián)用法大多建立在全掃描(Scan)和選擇離子(SIM)模式基礎(chǔ)上，建立多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的測定方法卻鮮有報道。在此基礎(chǔ)上，本試驗將建立一種快捷、準(zhǔn)確可靠且能同時測定人尿中18種濫用藥物以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測的GC-MS/MS聯(lián)用法，提高檢驗靈敏度的同時更好的消除直接溶劑提取產(chǎn)生的基質(zhì)干擾，為常見18種濫用藥物監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜-串聯(lián)7000D質(zhì)譜儀，Agilent公司；冷凍高速離心機，Sigma公司；氮吹儀，北京中惠普分析技術(shù)研究所。18種對照標(biāo)準(zhǔn)品(單標(biāo)，濃度均為1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；烯丙異丙基巴比妥(1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；SKF525(1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA，With 1%TMCS)，Cerilliant公司；甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher公司；乙酸乙脂(色譜純)，F(xiàn)isher公司；無水乙醚(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉(優(yōu)級純)，成都市科龍化工試劑廠；鹽酸(優(yōu)級純)，太倉滬試試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 方 法

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5 ms(30 m × 250 μm× 0.25 μm，Agilent公司)；進樣口溫：250 ℃；進樣量：1 μL；分流方式：不分流；柱溫：80 ℃保持1 min，以15 ℃/min程序升溫至300 ℃保持 2 min；流速：3 mL/min(He，99.999%)。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：EI，70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四級桿溫度MS2、MS1：150 ℃；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；溶劑延遲3 min。

1.2.3 樣品前處理

取待測尿液2 mL，加入10 μL不同濃度的2種內(nèi)標(biāo)混合液，混勻，先加入1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 3～4，用3 mL乙醚:乙酸乙酯(1:2)萃取溶劑，漩渦振蕩提取10 min，8000 r/min下離心5 min，轉(zhuǎn)移有機相，尿液再加10%氫氧化鈉調(diào)pH 11～12，加入3 mL乙醚-乙酸乙酯(1:2)溶劑，渦振蕩提取 10 min，8000 r/min下離心5 min，最后將有機相與酸性條件提取的有機相合并，40 ℃下氮氣吹干，用200 μL乙酸乙酯定容后供GC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 溶劑對萃取率的影響

實驗中考察了3種不同極性(乙醚，乙酸乙酯，乙醚-乙酸乙酯(1:2))的萃取劑對尿樣種18種濫用藥物的提取效果的影響。取3份加標(biāo)尿樣樣本，調(diào)節(jié)pH 3～4，加入3 mL上述3種萃取溶劑提取第一次，再調(diào)節(jié)pH 11～12，加入3 mL上述3種萃取溶劑提取第二次。結(jié)果表明：以乙醚為萃取溶劑時，苯丙胺、甲基苯丙胺和3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺未檢出，即乙醚未能將它們從尿液中有效提取；以乙酸乙酯為萃取溶劑時，18種濫用藥物均檢出，但氮吹去溶劑過程耗時較長；以乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取溶劑時，18種濫用藥物均被有效提取，且氮吹過程比純乙酸乙酯溶劑用時短。因此選擇乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取溶劑。

2.1.2 pH值對萃取率的影響

取5份加標(biāo)尿樣樣本，分別調(diào)節(jié)pH 3～4、pH 5～6、pH 7～8、pH 9～10、pH 11～12，以3 mL乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取劑，漩渦振蕩萃取10 min。結(jié)果表明，巴比妥、異戊巴比妥和苯巴比妥在pH 3～4時能被有效提取，其余的15種濫用藥物則在pH 11～12時被有效提取，而在pH 5～10條件下，苯巴比妥、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺和哌替啶均未檢出，即未被有效提取。因此在萃取時，選擇pH 3～4、pH 11～12條件下各提取一次。

2.2 18種濫用藥物和兩種內(nèi)標(biāo)的保留時間和離子對

采用多步程序確定和優(yōu)化質(zhì)譜條件。第一步，獲取每一個分析物質(zhì)的全掃描(Scan)圖譜。在選擇了合適的母離子后，采集不同碰撞能量(10 eV和25 eV)下的子離子全掃描質(zhì)譜。選擇合適的子離子并確定MRM離子對。最后在MRM模式下，最終子離子(每種物質(zhì)至少兩個離子對)的選擇和碰撞能量的優(yōu)化以最佳的信噪比(S/N)確定。結(jié)果見表1。

確定18種濫用藥物和2種內(nèi)標(biāo)的離子對和碰撞能后，通過對柱溫程序、分流比、載氣流速等色譜條件進行優(yōu)化，在1.2.1的色譜條件和1.2.2質(zhì)譜分析條件下，取不同質(zhì)量濃度的20種混合標(biāo)樣進樣，獲得理想峰形，其色譜圖如圖2所示，出峰時間見表1。

表1 18種標(biāo)準(zhǔn)品和2種內(nèi)標(biāo)的保留時間、定性離子對和碰撞能量、檢出限Table 1 Retention time, qualitative ion pairs, collision energy, and detection limit of eighteen standard compounds and two internal standard compounds

續(xù)表1

2.3 定性分析

按1.2.3.1處理樣品時，同時進行空白和空白加標(biāo)實驗(色譜圖見圖1、圖2)。根據(jù)分析物的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間比較(相對誤差在±5%內(nèi))，以及分析物所選的離子對相對豐度比與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的離子對相對豐度比的比較(偏差不大于20%)，對18種濫用藥物進行鑒定。

圖1 添加2種內(nèi)標(biāo)空白樣品的MRM圖(RT烯丙基異丙基巴比妥=8.040 min，RTSKF525=12.760 min)Fig.1 The MRM spectra of Blank sample with two internal standard compounds.

圖2 添加18種濫用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)空白樣品的MRM圖Fig.2 The MRM spectra of Blank sample with eighteen standard compounds and two internal standard compounds.

2.4 方法靈敏度

取空白健康人尿液2 mL，準(zhǔn)確加入哌替啶、美沙酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺、氯胺酮、巴比妥、地西泮、異戊巴比妥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.3 μg，可卡因、可待因、苯巴比妥、艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.6 μg，硝西泮、咪達唑侖、阿普唑侖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3 μg，氯硝西泮、勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 μg作為計算檢出限樣品。按照1.2.3部分提及的方法進行提取和檢驗，以3倍信噪比計算檢出限，結(jié)果見表1。檢出限在0.06～1.8 μg/mL，滿足尿樣檢測的需求。

2.5 應(yīng)用舉例

本方法已成功應(yīng)用于能力驗證《尿液中濫用藥物的定性分析測定》，檢出尿樣中3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺和氯胺酮。其色譜圖見圖3。

圖3 添加2種內(nèi)標(biāo)的樣品MRM圖Fig.3 The MRM spectra of sample with two internal standard compounds.

3 結(jié) 論

本試驗建立了同時測定人尿中18種濫用藥物的GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測分析法，方法的檢出限為 0.06～1.8 μg/mL，滿足尿樣檢測的需求。通過優(yōu)化樣品前處理和儀器的測定條件，方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、基質(zhì)干擾少，為人尿樣樣品中18種常見濫用藥物監(jiān)測提供了可靠參考依據(jù)。