楊小霞，方強(qiáng)恩，張勃，張金青

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

植物在低溫脅迫環(huán)境中，一些組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)會有一定的變化［1］，這些變化主要集中于液泡、質(zhì)體、脂滴、細(xì)胞壁、以及質(zhì)膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。如，質(zhì)體通常通過變形的方式分解淀粉來增加細(xì)胞質(zhì)的可溶性糖濃度，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力［2-3］。質(zhì)膜的外吐作用將細(xì)胞質(zhì)小泡（包括小液泡）中包含的大分子物質(zhì)釋放到質(zhì)膜外，參與細(xì)胞壁構(gòu)建，增加細(xì)胞壁的堅(jiān)固性，增強(qiáng)植物細(xì)胞的抗寒性，防止植物細(xì)胞因冰凍失水而造 成機(jī)械性損害［4-5］。杜艷等［6］對七葉樹（Aesculus chinensis）冬芽的研究表明，隨溫度的降低，其冬芽細(xì)胞內(nèi)的液泡黑色致密物、膜泡和吞噬泡不斷增加，這些液泡內(nèi)含物的增加有利于阻止冰晶的形成，可以提高越冬植物細(xì)胞的抗寒防凍能力，且細(xì)胞間發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象。方強(qiáng)恩等［7］對紫花苜蓿（Medicago sativa）越冬芽的研究中表明，在自然越冬過程中，越冬芽幼葉細(xì)胞內(nèi)的液泡由大體積液泡且透明逐漸被分割為小體積液泡，透明度也逐漸降低，質(zhì)膜內(nèi)陷，質(zhì)體變?yōu)樵卵佬位蝰R蹄狀，質(zhì)體內(nèi)淀粉粒減少甚至消失，細(xì)胞之間發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)經(jīng)過適應(yīng)性調(diào)整，逐漸提高了越冬芽的抗寒能力。植物越冬芽細(xì)胞器與膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是植物安全越冬的關(guān)鍵［8］。因此，植物超微結(jié)構(gòu)的觀察和分析對揭示植物越冬芽越冬抗寒具有重要的科學(xué)意義。

矩鐮莢苜蓿（M.archiducis-nicolai），又稱青藏扁蓿豆，是豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生野生優(yōu)質(zhì)牧草，分布于我國西部高寒地區(qū)［9］。研究表明，該植物的越冬芽對寒冷的環(huán)境具有極強(qiáng)的耐受性［10］。目前，關(guān)于矩鐮莢苜蓿的研究主要涉及地理分布、栽培技術(shù)［11］，營養(yǎng)價值的［12］、遺傳多樣性［10，13］等方面。但是，矩鐮莢苜蓿地下芽在低溫脅迫下超微結(jié)構(gòu)的變化仍不清楚。因此，本試驗(yàn)以矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉為材料，通過觀察其自然越冬過程中芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化，旨在解釋矩鐮莢苜蓿地下芽越冬抗寒的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，以期為矩鐮莢苜?？购N與寒地栽培技術(shù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料為矩鐮莢苜蓿（M.archiducis-nicolai）自然種群個體，采自青藏高原東緣天?？h甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)高山草原試驗(yàn)站禁牧草場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1矩鐮莢苜蓿地下芽的取樣方法試驗(yàn)在2018年8月-2019年2月進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)?shù)貧鉁兀▓D1）的變化，將矩鐮莢苜蓿地下芽分4個時期取樣4次。1）生長期（SS）：最低氣溫在5 ℃以上，平均氣溫不低于10 ℃，取樣日期為2018年7月15日；2）秋末冷適應(yīng)期（CA）：最低氣溫在0 ℃以上，平均氣溫不低于5 ℃，取樣日期為2018年9月24日；3）初冬冷脅迫期（ES）：從最低氣溫降到0 ℃以下開始，到平均氣溫降到0 ℃前，取樣日期為2018年10月26日；4）隆冬凍脅迫期（FS）：從平均氣溫降到0 ℃以下開始，到回升至5 ℃之前，取樣日期為2018年12月11日；根據(jù)氣溫的變化，每次在試驗(yàn)地采集矩鐮莢苜蓿生長健康、長勢一致的地下芽8-10個，迅速清洗干凈，以備切塊固定。

1.2.2透射電鏡芽幼葉切片的制備預(yù)冷及固定：將矩鐮莢苜蓿地下芽快速清洗干凈，放在預(yù)冷處理的載玻片上，用鋒利刀片從芽端幼葉頂部切取0.1 cm×0.2 cm的小塊，置于青霉素小瓶中，加入預(yù)冷的固定液（0.1 mol/L、pH值=7.0的磷酸緩沖液）中，室溫下固定2 h。

脫水：室溫下用漂洗液漂洗3次，每次漂洗15 min，再用1%四氧化鋨固定2 h。吸出四氧化鋨，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH值=7.0）漂洗1 h，其中中間進(jìn)行4次換液，隨后在50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇（2次）溶液中逐級進(jìn)行常溫脫水，每次20 min，EPON812環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合。

切片和染色：用（EMUC6）萊卡超薄切片機(jī)切片，厚度為70 nm。最后將超薄切片撈于載物網(wǎng)上，經(jīng)醋酸雙氧鈾（30 min）和檸檬酸鉛（10 min）進(jìn)行雙重染色。

觀察：樣品放于電鏡下（JEM-1230，日本）進(jìn)行觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 矩鐮莢苜蓿在生長期芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)液泡大，細(xì)胞核位于細(xì)胞壁附近，核仁清晰可見。細(xì)胞核外面有少數(shù)質(zhì)體（圖2-A，B，C），質(zhì)體內(nèi)含少量淀粉（圖2-C），多數(shù)質(zhì)體為圓形和橢圓形（圖2-A，B，C），少數(shù)為變形蟲狀（圖2-D）。細(xì)胞壁薄，胞間連絲數(shù)量多且清晰可見（圖2-F）。質(zhì)膜光滑，細(xì)胞未發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象。少數(shù)液泡在吞噬一些脂內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器（圖2-E，F(xiàn)，白色箭頭），多數(shù)液泡體積增大。

圖2 矩鐮莢苜蓿地下芽生長期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructural changes of young leaf cells of Medicago archiducis-nicolai in underground budding stage

2.2 矩鐮莢苜蓿在秋末冷適應(yīng)期芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)液泡還未開始溶解，部分液泡開始溶解為小液泡（圖3-D）。細(xì)胞核開始向細(xì)胞中央移動，核膜周緣有少量異染色體，核仁清晰。質(zhì)體內(nèi)含大量淀粉，且有許多質(zhì)體圍繞在細(xì)胞核周圍，質(zhì)體被膜完整，多為卵圓形狀和橢圓形狀（圖3-A）。胞間連絲的數(shù)量多，細(xì)胞壁薄。質(zhì)膜依然光滑，細(xì)胞未發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)（圖3-A，B，E）。

圖3 矩鐮莢苜蓿地下芽秋未冷適應(yīng)期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructural changes of young leaf cells of underground buds in Medicago archiducis-nicolai in late autumn cold adaptation

2.3 矩鐮莢苜蓿在初冬冷脅迫期芽幼葉細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)的大體積液泡基本已經(jīng)溶解為小體積液泡，且液泡正在內(nèi)吞細(xì)胞器和脂內(nèi)物質(zhì)（圖4A-F）。細(xì)胞核向細(xì)胞中央移動，核仁較清晰（圖4-A）。質(zhì)體變形為馬蹄狀和變形蟲狀（圖4-B），內(nèi)含有少量淀粉。芽幼葉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜內(nèi)陷呈波狀，發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖4-C），胞間連絲開始變得模糊（圖4-F），細(xì)胞壁較厚。細(xì)胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)（圖4-A）。

圖4 矩鐮莢苜蓿地下芽冷脅迫期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructural changes of young leaf cells in early winter cold stress stage of underground buds of Medicago archiducis-nicolai

2.4 矩鐮莢苜蓿在隆冬凍脅迫期芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

溫度在0～-20 ℃，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)的大液泡基本均溶解為小體積液泡，小體積液泡數(shù)量較多（圖5A-F）。細(xì)胞核幾乎都移動到細(xì)胞的正中央，部分細(xì)胞核仁消失（圖5-B），細(xì)胞核中有少量異染色體出現(xiàn)（圖5-A，B，C）。矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴出現(xiàn)（圖5-C，D）。質(zhì)體內(nèi)含有少量淀粉。細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，使得胞間連絲被阻斷而變得模糊且數(shù)量也減少，細(xì)胞壁增厚（圖5-F）。

圖5 矩鐮莢苜蓿地下芽隆冬脅迫期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastructural changes of young leaf cells of Medicago archiducis-nicolai underground buds during the early stage of winter freezing stress

3 討論

3.1 矩鐮莢苜蓿越冬芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對秋冬低溫的適應(yīng)

植物細(xì)胞中的水分主要來自液泡，低溫環(huán)境下，液泡通過減小體積，增大其內(nèi)密度來減少內(nèi)部水分，以此來抵御低溫環(huán)境，一旦液泡結(jié)冰受凍將會使整個植物受凍害［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，自然越冬過程中，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)的液泡初始較大且內(nèi)部透明，隨后被分割為小體積的液泡，并且逐步吞入脂內(nèi)物質(zhì)和各種細(xì)胞器。這與前人對其他植物的研究結(jié)果相類似，如韓善華等［15］對冬季沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）葉肉細(xì)胞、楊鳳仙等［5］對棉花（Gossypiumspp.）葉肉細(xì)胞的研究均發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境條件下，植物葉肉細(xì)胞內(nèi)液泡小且含有一些膜狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，液泡的體積也變小，研究表明，植物細(xì)胞在低溫環(huán)境下，液泡中會出現(xiàn)多膜狀結(jié)構(gòu)或小泡，液泡逐漸被分割為小液泡。這種變化可以防止細(xì)胞結(jié)冰，從而使植物適應(yīng)低溫環(huán)境［5，8］。

質(zhì)體是有機(jī)體細(xì)胞中的一種原質(zhì)體，具有多種形態(tài)，會因?yàn)橥饨绛h(huán)境的影響而發(fā)生變形，多變?yōu)樽冃蜗x狀、啞鈴形狀、馬蹄形狀等［3］。在自然低溫環(huán)境中，質(zhì)體中的淀粉粒隨日均氣溫的降低而減少，起初聚集在細(xì)胞核的周圍，后期幾乎消失，推測分解淀粉粒是質(zhì)體變形的原因之一［2］。淀粉粒通過不斷分解為可溶性糖，增加細(xì)胞質(zhì)濃度，以此適應(yīng)低溫環(huán)境［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，矩鐮莢苜蓿芽幼葉細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)體在越冬過程中，質(zhì)體由圓形或橢圓形變形為馬蹄形、變形蟲狀，其質(zhì)體內(nèi)的淀粉粒也逐漸減少。這與前人的研究結(jié)果相似，如陳旭微［6］對蠶豆（Vicia faa）下胚軸的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，蠶豆下胚軸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體中淀粉粒數(shù)量顯著下降，且部分質(zhì)體的形態(tài)由圓形變?yōu)閱♀徯?。這表明矩鐮莢苜蓿地下芽可能通過分解淀粉粒使質(zhì)體發(fā)生變形來適應(yīng)冬季寒冷的環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)體不再以分裂的方式增加數(shù)目時，質(zhì)體的形狀多為圓形或橢圓形［17］。本研究中，凍脅迫期，部分質(zhì)體的形狀為圓形，這可能是因?yàn)榫冂犌v苜蓿芽幼葉在該時期處于休眠狀態(tài)，因而質(zhì)體停止分裂，數(shù)目不再增加，不再分解淀粉，形狀也不再發(fā)生變化。

脂滴是一種分布廣泛、進(jìn)化高度保守的細(xì)胞器，由磷脂單分子層、中性脂核和大量脂滴以及相關(guān)蛋白組成［18］。研究發(fā)現(xiàn)，脂滴的出現(xiàn)與活性氧的清除有關(guān)，是在低溫環(huán)境下類囊體降解產(chǎn)物的聚集［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)均有脂滴的出現(xiàn)，在隆冬凍脅迫期出現(xiàn)的脂滴最多。王麗雪等［20］和劉艷［21］等的研究也表明，隨著低溫的加劇，葡萄（Vitis vinifera）和梨（Pyrusspp.）枝條細(xì)胞出現(xiàn)了大量的脂滴。已有研究表明，植物在低溫脅迫下出現(xiàn)大量脂滴可能是為了適應(yīng)其低溫的環(huán)境［22-23］。本研究中，隨著日均氣溫的逐漸降低，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的脂滴，這可能是該植物對低溫環(huán)境的一種積極的適應(yīng)性行為。

3.2 矩鐮莢苜蓿越冬芽越冬期抗寒性的變化

上述分析表明，秋末冷適應(yīng)期低溫環(huán)境中，越冬芽細(xì)胞內(nèi)的液泡、質(zhì)體、細(xì)胞核與脂滴的數(shù)量與功能經(jīng)過積極的適應(yīng)性變化，逐步增強(qiáng)了矩鐮莢苜蓿的抗寒性。到初冬冷脅迫期和隆冬凍脅迫期，隨著氣溫的逐漸降低，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離現(xiàn)象，致使胞間連絲的數(shù)量減少且逐漸變得模糊（圖4-3，圖5-6）。大量研究表明，低溫脅迫下，植物會發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，使得胞間連絲發(fā)生阻斷或斷連，從而產(chǎn)生共質(zhì)體分區(qū)，使植物體的整體連絲網(wǎng)絡(luò)被破壞，體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞受阻，甚至完全中斷，使植物的生長減弱甚至停止，植物體進(jìn)入暫時性的休眠，從而提高植物體對逆境的抗性［24］。據(jù)此分析，通過前期的低溫鍛煉，到嚴(yán)冬時期矩鐮莢苜蓿越冬芽細(xì)胞內(nèi)的生理活動已經(jīng)減弱至極低點(diǎn)，并通過進(jìn)入休眠狀態(tài)來適應(yīng)寒冷的冬季。

4 結(jié)論

自然越冬過程中，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細(xì)胞的各種細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了相應(yīng)的變化。隨低溫的加劇，芽幼葉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體變形，質(zhì)體內(nèi)淀粉粒不斷降解，大體積液泡幾乎消失，小液泡不斷的內(nèi)吞脂內(nèi)物質(zhì)和各種細(xì)胞器。脂滴細(xì)胞器數(shù)量不斷增加，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，胞間連絲逐漸變模糊甚至發(fā)生斷連。該植物地下芽通過細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化，使得自身進(jìn)入休眠狀態(tài)，進(jìn)而抵御寒冷脅迫，安全越冬。