王旭峰， 于夢(mèng)勤， 王振忠， 羅凱云， 劉樹滔,*

(1.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350108； 2.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心， 北京 100045；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康、環(huán)保和資源可持續(xù)發(fā)展等問(wèn)題的重視，植物基食品越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞，豆腐、百葉、豆干和素雞等傳統(tǒng)豆制品以及植物蛋白肉等新型含大豆蛋白制品在國(guó)內(nèi)發(fā)展迅速，使得大豆制品需求越來(lái)越大。豆制品的質(zhì)量(口感、持水性、風(fēng)味等)很大程度上取決于大豆蛋白的凝膠性[1]，如何獲得質(zhì)量高、穩(wěn)定性良好的凝膠產(chǎn)品一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。研究表明，蛋白質(zhì)的聚集對(duì)于凝膠結(jié)構(gòu)和品質(zhì)的形成十分關(guān)鍵，大顆粒蛋白聚集體是凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的“前體”[3]。研究表明，在凝固劑作用下，大顆粒蛋白質(zhì)聚集體首先聚集，組成凝膠的“框架”，隨后小顆粒蛋白質(zhì)聚集體或可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)一步結(jié)合到“框架”上，形成最終的凝膠結(jié)構(gòu)[4]。蛋白質(zhì)凝膠的形成可以被認(rèn)為是變性蛋白質(zhì)按一定順序聚集的結(jié)果，從蛋白質(zhì)分子- 初級(jí)顆粒- 微結(jié)構(gòu)- 凝膠網(wǎng)絡(luò)，微觀到宏觀的轉(zhuǎn)變過(guò)程共同決定了不同的膠體結(jié)構(gòu)，而最接近宏觀世界的結(jié)構(gòu)層次是主導(dǎo)膠體性能的最主要因素[5]。實(shí)現(xiàn)成膠過(guò)程的調(diào)控是提高蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的有效手段，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子之間的聚集或交聯(lián)反應(yīng)，可以獲得具有所需性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的食品凝膠[6]。目前已有研究利用多重乳液(W/OW)或添加多糖等物質(zhì)控制凝固劑的釋放來(lái)達(dá)到緩釋效果，從而改善蛋白質(zhì)的成膠能力[7-8]，但這些方法存在一定的局限性，如操作繁瑣、引入外添加物等，限制了其在食品加工中的應(yīng)用和發(fā)展。

金屬鹽離子(以下簡(jiǎn)稱鹽離子)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝膠是傳統(tǒng)豆制品加工中一條非常重要的途徑，常用的鹽類凝固劑主要是一些二價(jià)的金屬鹽離子，包括鈣鹽和鎂鹽[8-9]。據(jù)報(bào)道，鹽離子濃度對(duì)蛋白質(zhì)凝膠的形成具有重要影響，在低離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)傾向于形成細(xì)鏈網(wǎng)絡(luò)，而在高離子強(qiáng)度下則形成顆粒網(wǎng)絡(luò)[10]。此外，不同的鹽對(duì)于蛋白質(zhì)的凝固能力不同，與MgCl2和CaCl2相比，CaSO4誘導(dǎo)產(chǎn)生的凝膠結(jié)構(gòu)更加均勻、細(xì)膩[11]。Mohammadian等[12]研究了CaCl2、MnCl2和ZnCl2對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+誘導(dǎo)的凝膠比其他鹽離子誘導(dǎo)的凝膠更堅(jiān)硬，微觀結(jié)構(gòu)更致密。由此可見，不同鹽離子作用下蛋白質(zhì)的聚集行為存在較大差異，可以通過(guò)改變鹽離子的添加方式(種類、濃度等)對(duì)蛋白質(zhì)聚集和成膠的過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)凝膠結(jié)構(gòu)和品質(zhì)的有效改善。目前有關(guān)不同鹽離子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用及不同鹽誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集顆粒成膠性能方面的研究較少。

本研究擬利用蛋白質(zhì)聚集行為具有鹽離子種類和濃度依賴性的特征，以大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)為研究對(duì)象，采用一種新的兩步法制備鹽誘導(dǎo)SPI凝膠，即在相同鹽離子總濃度水平(35 mmol/L)下，第一步利用低濃度(0～15 mmol/L)的不同鹽離子(CaSO4、MgSO4或ZnSO4)誘導(dǎo)SPI聚集(預(yù)聚集)，制備不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的蛋白質(zhì)顆粒(凝膠前體)，比較不同鹽離子影響SPI結(jié)構(gòu)和聚集體形成的差異；第二步通過(guò)加入高濃度凝固劑(20～35 mmol/L，CaSO4)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)顆粒凝膠，研究不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)SPI聚集顆粒的成膠性能，探討鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI凝膠性質(zhì)的影響。希望本研究結(jié)果可為豆制品乃至植物蛋白凝膠產(chǎn)品的加工和品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL- 10MD型大容量高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD- 1A- 50型冷凍干燥機(jī)，上海賀帆公司；MS3000型激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern儀器公司；MCR302型旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕有限公司；J- 1500型圓二色譜儀，JASCO日本分光公司；FluoroMax- 4型高靈敏度熒光光譜儀，法國(guó)Horiba 公司；Nano ITC SV型等溫滴定量熱儀，美國(guó)TA公司；TA- XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SPI的制備

將脫脂豆粕按質(zhì)量比為1∶10與去離子水混合，利用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫下攪拌2 h，離心(7 000 r/min，4 ℃)20 min，上清液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，離心(4 000 r/min)10 min得到沉淀。離心后的沉淀按質(zhì)量比為1∶2溶解于去離子水中，并用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，直至其全部溶解。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到SPI粉末并置于-80 ℃冰箱中保存。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92 g/100g，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 g/100g，碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0 g/100g，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.7 g/100g，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.8 g/100g。

1.3.2SPI溶液的制備

將SPI粉末溶解于去離子水，常溫下攪拌2 h以上使其完全溶解，7 000 r/min離心10 min，去除不溶性物質(zhì)。利用2 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)上清液pH值為7.0，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度至60 mg/mL，置于95 ℃水浴下熱處理30 min，再經(jīng)冷水冷卻至室溫備用。

1.3.3不同鹽離子與熱變性SPI相互作用的熱力學(xué)測(cè)定

采用等溫滴定量熱儀進(jìn)行不同鹽離子與SPI相互作用的熱力學(xué)測(cè)試。將1.3.2中的SPI溶液質(zhì)量濃度稀釋至2 mg/mL，配制10.0 mmol/L CaSO4、MgSO4、ZnSO4溶液(鹽溶液濃度的選擇以CaSO4的溶解度為基礎(chǔ)，需使CaSO4完全溶解)。開始實(shí)驗(yàn)前先對(duì)儀器、進(jìn)樣針、滴定針進(jìn)行清洗及對(duì)所有溶液脫氣處理10 min，隨后進(jìn)行上樣。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，攪拌速度250 r/min，每次滴定體積為5 μL，兩次滴定時(shí)間間隔為300 s，共滴定18滴?？瞻讓?shí)驗(yàn)為鹽離子溶液滴定一級(jí)水，不同鹽離子與SPI的相互作用實(shí)驗(yàn)為鹽離子溶液滴定SPI溶液。

1.3.4不同鹽離子預(yù)聚集SPI的結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.4.1 SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

將CaSO4、MgSO4、ZnSO4溶液加入到熱變性SPI溶液中使鹽離子濃度為10.0 mmol/L，持續(xù)攪拌1 h，隨后利用0.01 mol/L(pH值7.0)的磷酸鹽緩沖溶液將處理后的SPI聚集體溶液質(zhì)量濃度稀釋至0.1 mg/mL。利用圓二色譜儀測(cè)定預(yù)處理SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定條件：樣品池光程0.1 cm，環(huán)境溫度25 ℃，靈敏度20 mdeg，掃描速度100 nm/min，每次掃描3次以生成數(shù)據(jù)，掃描范圍190～250 nm。每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)定。

1.3.4.2 SPI內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

采用高靈敏度熒光光譜儀測(cè)定SPI的內(nèi)源性熒光光譜。將CaSO4、MgSO4、ZnSO4溶液加入到熱變性SPI溶液中使鹽離子濃度為10.0 mmol/L，持續(xù)攪拌1 h，然后利用0.01 mol/L(pH值7.0)的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.4 mg/mL。參考王中江等[13]的方法并稍作改動(dòng)，以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了減少SPI內(nèi)部酪氨酸對(duì)熒光光譜的影響，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為290 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～450 nm，狹縫寬5 nm。

1.3.5SPI凝膠的制備

1.3.5.1 SPI預(yù)聚集顆粒制備

向熱變性SPI溶液(質(zhì)量濃度為60 mg/mL)中分別加入不同濃度(2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mmol/L)的不同鹽溶液(CaSO4、MgSO4、ZnSO4)，400 r/min下攪拌1 h，使其充分反應(yīng)，制得SPI預(yù)聚集顆粒。

1.3.5.2 SPI凝膠的制備

向已制備的含有不同SPI預(yù)聚集顆粒的溶液中加入CaSO4(凝固劑，適合制備填充型凝膠)至金屬鹽離子的終濃度為35 mmol/L，80 ℃水浴30 min誘導(dǎo)成膠。隨后冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱過(guò)夜備用。兩步法制備SPI凝膠過(guò)程中鹽離子添加比例如表1。以傳統(tǒng)一步法，即一次加入35 mmol/L CaSO4誘導(dǎo)SPI凝膠為對(duì)照。

表1 兩步法制備SPI凝膠過(guò)程中鹽離子添加比例Tab.1 Addition ratio of salt ions in preparation of SPI gel by two-step method

1.3.6SPI預(yù)聚集顆粒粒徑測(cè)定

采用激光粒度儀測(cè)定SPI預(yù)聚集顆粒的粒徑，將SPI聚集體溶液緩慢加入測(cè)量池中，至折光度到7%左右停止加樣。連續(xù)相折光系數(shù)取1.45(蛋白質(zhì))，分散相折光系數(shù)為1.33(水)，SPI預(yù)聚集顆粒的粒徑采用體積平均粒徑(D4,3)表示，多次測(cè)量取平均值。

1.3.7SPI預(yù)聚集溶液表觀黏度測(cè)定

采用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定預(yù)聚集處理的SPI溶液的表觀黏度，旋轉(zhuǎn)模式下選用椎板CP25，剪切速率為0.1～100.0 rad/s，樣品在25 ℃下平衡2 min后開始測(cè)定。將剪切速率作為函數(shù)的流動(dòng)曲線，利用Ostwald de Waele流變模型進(jìn)行擬合，公式如式(1)。

τ=Kγn。

(1)

式(1)中，τ是剪切應(yīng)力，Pa；γ為剪切速率，s-1，K(Pa·s)是黏度系數(shù)，n是流動(dòng)行為指數(shù)。

1.3.8SPI凝膠黏彈性測(cè)定

利用流變儀測(cè)定SPI凝膠的黏彈性，選用的轉(zhuǎn)子為PP50，Gap值為1 mm。如1.3.5所述，凝固劑加入后，混勻并立即上樣到流變測(cè)試平臺(tái)，啟動(dòng)程序并按系統(tǒng)指示進(jìn)行刮邊，為防止溫度較高時(shí)水分的蒸發(fā)損失，在轉(zhuǎn)子周圍涂抹上一層硅油，隨后立即進(jìn)行溫度掃描測(cè)試。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：應(yīng)變?yōu)?%(線性范圍區(qū)內(nèi))，頻率1 Hz。溫度程序設(shè)定：首先從25 ℃升溫至80 ℃，并在80 ℃下保持30 min，之后從80 ℃降溫至25 ℃。對(duì)形成的SPI凝膠進(jìn)行頻率掃描，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：應(yīng)變?yōu)?%，角頻率(ω)區(qū)間為1.0～100.0 rad/s，記錄彈性模量(儲(chǔ)能模量)G′和黏性模量(損耗模量)G″隨角頻率的變化情況。角頻率和SPI凝膠模量的關(guān)系用冪律模型進(jìn)行擬合分析，擬合公式如式(2)。

G=Kωn。

(2)

式(2)中，K值為冪律常數(shù)，n表示的是模量對(duì)角頻率的依賴程度。

1.3.9SPI凝膠強(qiáng)度測(cè)定

利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定SPI凝膠的硬度。將1.3.5中制備好的SPI凝膠取出放于室溫環(huán)境下使其回復(fù)至室溫。采用P/0.5探頭，將樣品置于測(cè)量臺(tái)上進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：測(cè)前、后速度為5 mm/s，測(cè)中速度為2 mm/s，穿刺距離為凝膠高度的70%，觸發(fā)力為0.05 N，穿刺樣品的壓力峰值定義為凝膠的硬度。測(cè)試至少3次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)測(cè)定3次，每次至少3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差及相關(guān)性分析，采用LSD法對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽離子與SPI 相互作用的熱力學(xué)分析

圖1 不同鹽離子與SPI相互作用的ITC分析結(jié)果Fig.1 ITC analysis results of interaction between different salt ions and SPI

為了分析不同鹽離子與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，利用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)對(duì)鹽離子與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熱量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)(圖1)。根據(jù)熱力學(xué)方程擬合得到二者相互作用時(shí)的熱力學(xué)參數(shù)[14-15]。由圖1可見，每個(gè)峰的面積對(duì)應(yīng)的是每滴定一滴鹽離子溶液時(shí)產(chǎn)生的熱量，隨著滴定的鹽離子量增加，峰的高度逐漸降低，說(shuō)明發(fā)生的熱量減少，當(dāng)發(fā)生的熱量接近于0時(shí)，說(shuō)明已達(dá)到滴定終點(diǎn)，SPI分子被完全結(jié)合。進(jìn)一步滴定時(shí)，只會(huì)產(chǎn)生正值的稀釋熱，且峰的高度趨于穩(wěn)定。從熱量變化來(lái)看，ZnSO4滴定引起的熱量變化遠(yuǎn)大于CaSO4和MgSO4，說(shuō)明Zn2+誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子聚集反應(yīng)更為劇烈。根據(jù)擬合所得的熱力學(xué)參數(shù)可知，不同鹽離子與SPI相互作用的過(guò)程是自發(fā)的(ΔG<0)吸熱(ΔH>0)反應(yīng)，這與Canababy等[16]利用Ca2+滴定大豆蛋白的結(jié)果一致。此外，Ross等[17]及石會(huì)剛等[18]總結(jié)了生物大分子與小分子之間的作用力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，即當(dāng)ΔH<0 時(shí)，二者的相互作用主要為靜電相互作用、范德華力或氫鍵作用，且當(dāng)ΔS>0時(shí)為靜電相互作用，ΔS<0時(shí)為范德華力或氫鍵作用；而當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，則為疏水相互作用。在本實(shí)驗(yàn)的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，ΔH>0，ΔS>0，這說(shuō)明鹽離子與SPI分子的相互作用是由熵變驅(qū)動(dòng)的，鹽離子的加入引起蛋白質(zhì)分子之間的相互作用主要表現(xiàn)為疏水相互作用。另外，由不同鹽離子與SPI分子相互反應(yīng)的擬合焓變(ΔH)可知，CaSO4和MgSO4引起的焓變相似，而ZnSO4滴定引起的焓變則相對(duì)更大，也證明了不同鹽離子與SPI相互作用的差異。

2.2 不同鹽離子對(duì)SPI 空間構(gòu)象的影響

2.2.1不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步分析不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI聚集結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)經(jīng)和未經(jīng)預(yù)聚集處理SPI的空間構(gòu)象進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，所有樣品在190～195 nm處均顯示一個(gè)正峰，這表示SPI中存在β-折疊結(jié)構(gòu)；且在210 nm附近都顯示出一個(gè)負(fù)峰，這是SPI中典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[19]。此外，經(jīng)不同鹽離子預(yù)聚集處理后SPI樣品的圓二色譜均發(fā)生了不同程度的紅移，向熱變性SPI中加入CaSO4、MgSO4、ZnSO4后的負(fù)峰從210 nm分別移動(dòng)到214、212、216 nm，這表明了更多α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。通過(guò)對(duì)圓二色譜結(jié)果擬合得到SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如表2。表2顯示，α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)是SPI主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。與原始的SPI相比，經(jīng)熱處理的SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低，無(wú)規(guī)卷曲含量升高。這是由于SPI經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被打開，分子間氫鍵斷裂，而α-螺旋結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)的羰基和氨基之間的氫鍵所維持的[20]，因此導(dǎo)致 α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，α-螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變。然而，進(jìn)一步加入不同鹽離子后，SPI樣品均呈現(xiàn)出α-螺旋結(jié)構(gòu)含量上升，β-折疊結(jié)構(gòu)含量下降的現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量與其表面疏水性成反比[21]，因此，這一現(xiàn)象可能是由于鹽離子的靜電屏蔽作用及蛋白質(zhì)與金屬鹽離子之間形成的鹽橋，使蛋白質(zhì)相互聚集，導(dǎo)致暴露在表面的疏水性基團(tuán)重新被包埋在內(nèi)部，降低了蛋白表面疏水性，從而使得α-螺旋結(jié)構(gòu)含量上升，β-折疊結(jié)構(gòu)含量下降。此外，有研究認(rèn)為，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的增加是由于加入鹽溶液后，蛋白質(zhì)通過(guò)分子間相互作用聚集，蛋白質(zhì)分子肽鏈間的氫鍵又重新形成[22-23]；然而，也有研究稱鹽離子可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子間的靜電作用而影響蛋白質(zhì)分子肽鏈間氫鍵的穩(wěn)定性，從而使SPI中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低[24]。

圖2 不同鹽離子預(yù)聚集處理的SPI圓二色譜Fig.2 CD chromatograms of SPI pre-aggregated with different salt ions

表2 不同鹽離子預(yù)聚集處理的SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Tab.2 Secondary structure content of SPI pre-aggregated with different salt ions %

2.2.2不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI熒光光譜的影響

圖3顯示的是不同鹽離子預(yù)聚集處理SPI的熒光光譜。在290 nm激發(fā)的SPI樣品熒光光譜主要是由色氨酸發(fā)射的，可以反映色氨酸殘基所處微環(huán)境的變化情況[25]。色氨酸殘基是疏水性殘基，其表現(xiàn)出的熒光峰大體在325～350 nm[13]。由圖3可見，所有SPI樣品的熒光光譜譜形幾乎沒有差別，而熱處理后SPI樣品的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，加入不同鹽離子的SPI樣品熒光強(qiáng)度降低。這是由于SPI被加熱后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，分子結(jié)構(gòu)被打開，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，使得色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)外部的極性環(huán)境。加入鹽離子后，SPI 樣品熒光強(qiáng)度的降低可以歸因于二價(jià)金屬離子與極性蛋白質(zhì)表面的相互作用，使得蛋白質(zhì)進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致暴露出來(lái)色氨酸殘基被重新包埋到蛋白聚集顆粒的內(nèi)部，從而引起熒光猝滅[26]，這與圓二色譜的結(jié)果保持一致。

圖3 不同鹽離子預(yù)聚集處理的SPI熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of SPI pre-aggregated with different salt ions

2.3 不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI顆粒粒徑的影響

蛋白質(zhì)聚集體粒徑大小與凝膠結(jié)構(gòu)和性能緊密相關(guān)。不同鹽離子誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集行為差異顯著，利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量不同鹽離子誘導(dǎo)形成的SPI聚集體顆粒的粒徑，其體積平均粒徑D4,3如表3。由表3可以看到，隨著鹽離子濃度的增加，SPI聚集體顆粒的D4,3逐漸增大。對(duì)于不同的鹽離子，在低濃度條件下(2.5～7.5 mmol/L)，CaSO4誘導(dǎo)蛋白顆粒的粒徑明顯大于MgSO4；而在高濃度下(10～15 mmol/L)，兩種鹽離子對(duì)D4,3的影響無(wú)顯著差異(P<0.05)。相較而言，在ZnSO4作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生了更高程度的聚集，形成的聚集體粒徑最大。加入不同鹽離子后SPI聚集體顆粒D4,3的差異可能

表3 不同鹽離子誘導(dǎo)形成的SPI聚集體顆粒的D4,3Tab.3 D4,3 of SPI aggregate particles induced by different salt ions

是由于鹽離子聚集速率和能力的不同。由ITC結(jié)果可知，ZnSO4與蛋白質(zhì)分子之間的反應(yīng)劇烈程度遠(yuǎn)高于CaSO4和MgSO4，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子來(lái)不及重排而迅速聚集，形成較大且粗糙的SPI聚集體顆粒；而聚集速率較慢的鹽離子則會(huì)緩慢地使蛋白質(zhì)分子聚集，形成均勻的、較小的SPI聚集體顆粒。

2.4 不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI溶液表觀黏度的影響

圖4顯示了3種鹽離子在不同濃度條件下誘導(dǎo)的SPI聚集體溶液的表觀黏度隨剪切速率的變化情況。圖4顯示，隨剪切速率的增加，所有SPI聚集體溶液的黏度都逐漸減小，呈現(xiàn)出一種剪切稀化的現(xiàn)象，說(shuō)明SPI聚集體溶液是一種典型的非牛頓流體。此外，鹽離子濃度的增加可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此，當(dāng)溶液穩(wěn)定時(shí)，鹽離子的濃度越高，SPI 聚集體溶液呈現(xiàn)出越高的表觀黏度。不同鹽離子預(yù)聚集處理后的SPI溶液的流動(dòng)行為指數(shù)如表4。由表4可知，15.0 mmol/L ZnSO4預(yù)聚集處理的樣品由于黏度較高，其流動(dòng)曲線擬合性較差，其余樣品的流動(dòng)曲線均具有良好的擬合性(R2>0.99)。當(dāng)樣品的流動(dòng)行為指數(shù)為1時(shí)，則認(rèn)為該樣品為牛頓流體，如果其流動(dòng)行為指數(shù)越接近1，則認(rèn)為其具有更好的流動(dòng)性；反之，則認(rèn)為其為剛性的[27-29]。由本研究結(jié)果可知，樣品的流動(dòng)行為指數(shù)隨著預(yù)聚集鹽離子濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明SPI的聚集程度隨鹽離子的濃度增加而增加。此外，同一濃度下，ZnSO4預(yù)聚集處理的SPI溶液的流動(dòng)行為指數(shù)均較CaSO4、MgSO4低，可見ZnSO4的聚集能力更強(qiáng)。這可能與不同鹽離子的離子半徑相關(guān)，Mohammadian等[12]的研究指出，離子半徑在蛋白質(zhì)分子間相互作用中起著重要作用，與其他鹽離子相比，鋅離子半徑較小、電荷密度較高，因此對(duì)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的交聯(lián)能力，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖4 SPI聚集體溶液表觀黏度隨剪切速率的變化Fig.4 Apparent viscosity of SPI aggregate solution varies with shear rate

表4 不同鹽離子預(yù)聚集處理后的SPI溶液的流動(dòng)行為指數(shù)

2.5 不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI凝膠黏彈性的影響

為了探討不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI凝膠黏彈性的影響，對(duì)SPI凝膠進(jìn)行頻率掃描實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5。彈性模量(G′)和黏性模量(G″)分別描述了SPI凝膠樣品的固態(tài)(彈性)和液態(tài)(黏性)特征的程度[30]。圖5顯示，所有SPI凝膠樣品都呈現(xiàn)出明顯的凝膠特征，即G′>G″，并且在整個(gè)頻率變化范圍內(nèi)，凝膠的G′和G″都隨著角頻率ω的增大而逐漸增加。使用冪律模型進(jìn)一步研究所有SPI凝膠樣品的動(dòng)態(tài)黏彈性行為，對(duì)凝膠的G′與角頻率(ω)的關(guān)系進(jìn)行擬合。K值表示的是擬合模型的冪律常數(shù)，可以用來(lái)評(píng)判凝膠的彈性，指數(shù)n可表示G′對(duì)ω的依賴程度，同時(shí)n值還可以用來(lái)表征形成凝膠結(jié)構(gòu)作用力的性質(zhì)[30-31]。當(dāng)n>0時(shí)，表示為物理性凝膠，其主要作用力為弱的非共價(jià)鍵；當(dāng)n=0時(shí)則表示為化學(xué)性凝膠，主要由較強(qiáng)的共價(jià)鍵組成，一般來(lái)說(shuō)，其凝膠模量對(duì)頻率不具有依賴性[32]。G′與ω?cái)M合結(jié)果如表5，由表5可知，大多數(shù)SPI凝膠樣品的n值都在0.1左右，說(shuō)明G′呈現(xiàn)出弱的頻率依賴性，鹽離子誘導(dǎo)的凝膠是主要由離子鍵、疏水相互作用和氫鍵等非共價(jià)鍵形成的一種物理性的弱凝膠。在一定范圍內(nèi)，隨著鹽離子濃度的提高，SPI凝膠的K值顯著增大，說(shuō)明預(yù)聚集處理能夠大幅度改善凝膠的黏彈性。由表5可知，經(jīng)10.0 mmol/L CaSO4、10.0mmol/L MgSO4以及5.0 mmol/L ZnSO4預(yù)聚集處理的凝膠具有最好的彈性性質(zhì)，相比于對(duì)照樣品，K值分別提高了49.5%、30.0%和59.9%。然而，過(guò)度的預(yù)聚集處理會(huì)導(dǎo)致凝膠黏彈性顯著下降，這可能歸因于預(yù)聚集過(guò)程中形成的不同結(jié)構(gòu)SPI聚集顆粒的成膠性能不同，在較低鹽離子濃度條件下(CaSO4和MgSO4濃度小于10 mmol/L，ZnSO4濃度小于5 mmol/L)，鹽離子引起的聚集反應(yīng)相對(duì)溫和，產(chǎn)生了尺寸較大、結(jié)構(gòu)緊湊的聚集顆粒，有助于形成具有粗鏈和均勻致密網(wǎng)絡(luò)的SPI凝膠，從而強(qiáng)化了凝膠結(jié)構(gòu)和性能；當(dāng)鹽濃度進(jìn)一步提高時(shí)，反應(yīng)速率迅速加快，蛋白質(zhì)分子則會(huì)發(fā)生隨機(jī)聚集，容易形成過(guò)大、粗糙的聚集體，從而導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)不均勻和較低的黏彈性[32-34]。

圖5 不同鹽離子預(yù)聚集處理的SPI凝膠彈性模量和黏性模量Fig.5 Elastic modulus and viscosity modulus of SPI gel pre-aggregated with different salt ions

表5 冪律模型擬合的K值和n值

2.6 不同鹽離子預(yù)聚集處理對(duì)SPI凝膠硬度的影響

鹽離子的預(yù)聚集處理對(duì)SPI凝膠硬度的影響如圖6。由圖6可知，鹽離子的預(yù)聚集處理在一定濃度范圍內(nèi)顯著提高了SPI凝膠的硬度，經(jīng)10 mmol/L CaSO4、10 mmol/L MgSO4和2.5 mmol/L ZnSO4預(yù)聚集處理的SPI凝膠獲得最大硬度，分別為2.19、2.16、2.12 N，而未經(jīng)預(yù)聚集處理的凝膠硬度為1.75 N；但當(dāng)鹽離子濃度進(jìn)一步增加時(shí)，SPI凝膠硬度下降。另一方面，當(dāng)添加相同濃度鹽離子時(shí)，CaSO4和MgSO4預(yù)聚集處理的凝膠硬度接近且變化趨勢(shì)一致；ZnSO4預(yù)聚集處理的SPI凝膠硬度與另兩種鹽離子預(yù)聚集處理的凝膠硬度具有顯著差異(P<0.05)。尤其是當(dāng)ZnSO4濃度增加至7.5 mmol/L時(shí)，凝膠的硬度大幅度降低，而經(jīng)15 mmol/L ZnSO4預(yù)聚集處理的SPI已無(wú)法形成良好的凝膠體。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)念A(yù)聚集處理可以促進(jìn)SPI形成更強(qiáng)的凝膠，反之則會(huì)導(dǎo)致SPI 凝膠性能變差，表現(xiàn)出較低的凝膠硬度，這與流變性數(shù)據(jù)近乎一致。

不同小寫字母表示樣品間存在顯著差異(P<0.05)。圖6 不同鹽離子預(yù)聚集處理的SPI凝膠硬度變化Fig.6 Change of hardness of SPI gel pre-aggregated with different salt ions

3 結(jié) 論

本研究利用ITC、圓二色譜、熒光色譜等研究了不同金屬鹽離子與SPI分子間相互作用的差異及其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和聚集行為的影響，并進(jìn)一步通過(guò)SPI凝膠的流變、質(zhì)構(gòu)等性質(zhì)的變化探討不同鹽離子誘導(dǎo)的蛋白聚集體的成膠行為。熱力學(xué)研究結(jié)果表明，不同鹽離子與SPI分子的結(jié)合存在明顯差異，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，進(jìn)而影響蛋白聚集體的性質(zhì)，如粒徑、表觀黏度等。蛋白凝膠研究結(jié)果顯示，相較于傳統(tǒng)一步添加凝固劑成膠的方法(未經(jīng)預(yù)聚集處理)，低濃度鹽離子的預(yù)聚集處理能促進(jìn)形成更強(qiáng)的SPI凝膠，顯著提高凝膠的模量和硬度，但蛋白質(zhì)過(guò)度預(yù)聚集會(huì)導(dǎo)致凝膠性質(zhì)下降。希望本研究結(jié)果可為SPI乃至植物蛋白凝膠制品的質(zhì)構(gòu)改良提供了一種新的思路和方法，為SPI在凝膠類食品加工中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論參考。