劉子軒， 高 雅， 王文倩， 章慧鶯,*， 陳海濤,*， 黃 典， 曾 艷

(1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 北京工作站， 北京 101121；3.國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心， 天津 300308)

肉類是人類重要的食品資源，在全球人口增加，肉類產(chǎn)能下降的趨勢下，傳統(tǒng)畜牧業(yè)已無法滿足人們對肉品的需求。植物基肉制品作為肉類替代品，已成為近年來食品產(chǎn)業(yè)的研究熱點(diǎn)[1]。由于存在豆腥味突出、缺乏特征肉香等問題，目前植物基肉制品尚難以滿足消費(fèi)者的需求[2]。植物肉能否模擬真實(shí)的肉香，是提高消費(fèi)者接受度的關(guān)鍵驅(qū)動力，也是提升產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物在肉味前體的形成中起著至關(guān)重要的作用，常被添加到美拉德反應(yīng)體系中以產(chǎn)生肉味[3]。為滿足植物基肉制品的發(fā)展需求，以非肉源蛋白為原料制造理想的肉味基料成為肉味香精及替代肉制品行業(yè)亟需解決的課題[4]。食用菌營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，具有較高的蛋白質(zhì)含量[5]。食用菌蛋白質(zhì)通過酶解可釋放大量多肽和游離氨基酸，是制備肉味基料前體物的理想原料。高娟等[6]以羊肚菌酶解液為原料，探究制備肉味調(diào)味基料的最優(yōu)條件，得到的產(chǎn)物肉香濃郁，風(fēng)味協(xié)調(diào)。Lotfy等[7]以雙孢蘑菇蛋白酶解物為原料成功制備了牛肉香精，并對比了常規(guī)和微波兩種加熱方式對產(chǎn)物風(fēng)味的影響。Chen等[8]考察了不同溫度對于雙孢蘑菇酶解液- 半胱氨酸- 木糖反應(yīng)體系風(fēng)味形成的影響，為食用菌源美拉德反應(yīng)體系的工藝優(yōu)化提供了理論指導(dǎo)。食用菌原料品種豐富，不同品種食用菌風(fēng)味及前體物質(zhì)均存在一定差異。目前已有的研究大多是關(guān)于食用菌酶解液美拉德反應(yīng)條件方面的探討，對于原料品種對反應(yīng)基料風(fēng)味的影響尚未見報道。

揮發(fā)性化合物組成是評價肉味基料風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前在揮發(fā)性化合物檢測中常采用氣相色譜- 質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)聯(lián)用技術(shù)。但該技術(shù)無法分析鑒定出一些含量少而對風(fēng)味至關(guān)重要的化合物，且預(yù)處理步驟和分析時間限制了其應(yīng)用。氣相色譜- 離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是近幾年興起的一種氣相分離檢測技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的高分離能力和離子遷移譜分辨率高、靈敏度高、操作簡單、分析快捷等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[10-12]，但尚未見其應(yīng)用于肉味美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的文獻(xiàn)報道。

本研究擬以香菇、杏鮑菇、平菇、雙孢蘑菇4種食用菌為原料制備肉味基料，通過描述性感官評價、GC-IMS與GC-MS對美拉德反應(yīng)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并通過主成分分析(principal components analysis, PCA)及正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)探索4種熱反應(yīng)肉味基料的風(fēng)味成分，旨在探明不同品種食用菌制備熱反應(yīng)肉味基料的風(fēng)味差異，為食用菌源熱反應(yīng)肉味基料的制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種食用菌干品(香菇、杏鮑菇、平菇、雙孢蘑菇)，購于北京市永輝超市；D-木糖、L-半胱氨酸(食品級)，河南興源化工產(chǎn)品有限公司；纖維素酶(10萬 U/g)、木瓜蛋白酶(10萬 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(2萬 U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；磺基水楊酸、濃鹽酸、十二水合磷酸氫二鈉、十水合四硼酸鈉(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(色譜純)，天津博納艾杰爾科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；2-甲基-3-庚酮、正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF- 101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；固相微萃取手動進(jìn)樣器、固相微萃取纖維(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；BJ- 200型高速多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；TGL16M型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Trace1310- ISQ型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司；Flavour Spec?型氣相色譜- 離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S.公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1食用菌酶解液的制備

食用菌粉碎，過60目篩。稱取5 g食用菌干粉于250 mL四口燒瓶中，按料液比1∶24(g/mL)加入蒸餾水，勻漿。待混合液達(dá)到設(shè)定溫度后，加入1 000 U/g纖維素酶，1 500 U/g木瓜蛋白酶和1 500 U/g風(fēng)味蛋白酶于50 ℃下水解2.5 h，酶解結(jié)束后于100 ℃條件下滅酶10 min，冷卻至室溫，離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)，取上層清液備用[13]。

1.3.2食用菌美拉德反應(yīng)液的制備

量取10 mL食用菌酶解液于200 mL高溫耐壓瓶中，固定L-半胱氨酸添加量0.04 g/mL、D-木糖添加量0.06 g/mL，加入磁力攪拌子攪拌。利用集熱式恒溫磁力攪拌器油浴進(jìn)行控溫，反應(yīng)溫度140 ℃，反應(yīng)時間150 min。反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰水中終止反應(yīng)，得到食用菌水解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物并對其依次編號。以杏鮑菇酶解液為原料制得的樣品記為MRP- Pe，以平菇酶解液為原料制得的樣品記為MRP- Po，以雙孢蘑菇酶解液為原料制得的樣品記為MRP- Ab，以香菇酶解液為原料制得的樣品記為MRP- Le。

1.3.3食用菌酶解液游離氨基酸的測定

采用高效液相色譜法對酶解液中游離氨基酸進(jìn)行測定。樣品前處理方法為：量取3 mL食用菌酶解液樣品，與1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的磺基水楊酸混合均勻，靜置，在4 ℃，10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，加入0.1 mol/L HCl稀釋1.5倍，過0.22 μm濾膜，加入正纈氨酸和肌氨酸作為內(nèi)標(biāo)，待儀器檢測。

色譜條件：色譜柱為Durashell AA氨基柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)；柱溫45 ℃；流動相A(12.5 mmol/L Na2HPO4和12.5 mmol/L Na2B4O7溶于超純水，pH值8.2)和流動相B(45%甲醇，45%乙腈，10%水)梯度洗脫程序?yàn)?～6 min內(nèi)使用6%～10%比例的流動相B開始洗脫，6～8 min保持10%比例的流動相B，8～10 min流動相B比例增加到16%，10～23 min流動相B比例增加到40%，23～40 min流動相B比例增加到40～50%，31～34 min保持流動相B比例100%，35～38 min內(nèi)流動相B比例下降為6%。二極管陣列檢測器波長設(shè)置為338 nm和262 nm，進(jìn)樣量為2 μL。

1.3.4感官評價

采用定量描述性分析方法對樣品進(jìn)行評價。美拉德反應(yīng)樣品稀釋50倍，準(zhǔn)確量取20 mL稀釋后的樣品于50 mL無味塑料樣品瓶中，隨機(jī)編號。

感官評價小組由12名(6男，6女，23～40歲)具有一年以上感官評價經(jīng)驗(yàn)的人員組成。評價小組經(jīng)討論確定樣品主要的香氣屬性及描述詞，并確定香氣評價參照標(biāo)準(zhǔn)品。香氣屬性分別為青香、甜香、油脂香、烤香、咸香和硫化物氣味。香氣屬性參照標(biāo)準(zhǔn)品分別為：青香(葉醇)、甜香(乙基麥芽酚)、油脂香(反,反-2,4-癸二烯醛)、烤香(2,5-二甲基吡嗪)、咸香(二甲基三硫醚)、硫化物氣味(3-巰基-2-丁醇)和肉香(清燉肉湯)。香氣強(qiáng)度評分范圍為1(弱)至9(強(qiáng))。樣品評價重復(fù)3次。

1.3.5氣相色譜-質(zhì)譜分析

頂空固相微萃取條件：準(zhǔn)確量取500 μL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，向樣品中加入一定濃度的2-甲基3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)，用PTFE- silicone瓶蓋密封。樣品在50 ℃水浴條件下平衡20 min后，插入老化后的萃取頭在50 ℃條件下萃取30 min，萃取結(jié)束后在GC-MS進(jìn)樣口(250 ℃)解吸5 min。

色譜條件：色譜柱為TG- WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至110 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣方式為不分流模式。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z為45～450 u。

1.3.6氣相色譜-離子遷移譜分析

頂空進(jìn)樣條件：準(zhǔn)確量取0.5 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中。在90 ℃下孵化15 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，頂空進(jìn)樣針溫度85 ℃，進(jìn)樣體積500 μL。

色譜條件：色譜柱為FS-SE- 54- CB- 1毛細(xì)管柱(15 m×0.53 mm，0.5 μm)；色譜柱溫度60 ℃；載氣為N2(純度≥99.999%)；載氣流速為0～2 min，2 mL/min，2～10 min，10 mL/min，10～20 min，100 mL/min，20～30 min，150 mL/min；總運(yùn)行時間為30 min。

離子遷移譜條件：漂移管長度5 cm，管內(nèi)線性電壓400 V/cm，IMS溫度45 ℃。以峰高在保留時間和離子遷移時間軸上的積分表示化合物峰體積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶解液中游離氨基酸含量通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定。GC-IMS檢測采用設(shè)備自帶儀器分析軟件，包括LAV和插件(Reporter、Gallery plot)對樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行采集和分析，通過NIST 14氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行定性分析，通過信號峰體積進(jìn)行化合物定量分析。GC-MS檢測結(jié)果通過NIST 14氣相保留指數(shù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行定性分析，根據(jù)各揮發(fā)性化合物峰面積與已知質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值進(jìn)行定量分析。每組數(shù)據(jù)測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SIMCA 14.0進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌酶解液中游離氨基酸分析結(jié)果

酶解產(chǎn)生的氨基酸對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官屬性有著重要影響。不同食用菌酶解液的游離氨基酸種類和含量如表1。由表1可知，從食用菌酶解液中共檢測出17種氨基酸，在4種食用菌酶解液樣品中，最主要的氨基酸種類為賴氨酸、亮氨酸和纈氨酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到酶解液游離氨基酸總量的8%以上。這3種氨基酸均為典型的苦味氨基酸，研究表明，苦味氨基酸的化學(xué)活性較高，很容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也會在美拉德反應(yīng)過程中被大量消耗，與風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有很大的相關(guān)性[14]。因此，食用菌酶解液可以作為制備MRP前體物的理想原料。

表1 不同食用菌酶解液游離氨基酸分析結(jié)果Tab.1 Results of free amino acid analysis of enzymatic hydrolysates from different mushroom

氨基酸在加熱過程中通過Strecker降解生成對應(yīng)的Strecker醛。纈氨酸和亮氨酸經(jīng)Strecker降解可以生成2-甲基丙醛和3-甲基丁醛，在一定濃度下具有典型的堅(jiān)果香和油脂香，對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物特征風(fēng)味的形成有重要貢獻(xiàn)[15]。從表1可以看出，在杏鮑菇和雙孢蘑菇酶解液中檢測到了較高含量的纈氨酸和亮氨酸，后續(xù)風(fēng)味分析結(jié)果表明其對應(yīng)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中Strecker醛的含量也處在較高水平。不同品種食用菌酶解液氨基酸種類和含量的差異，與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的差異密切相關(guān)。

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價結(jié)果

圖1 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of different Maillard reaction products

采用定量描述性感官評價的分析方法，分別對不同食用菌酶解液美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行感官分析，分析結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，以香菇酶解液為原料制得的反應(yīng)樣品表現(xiàn)出最強(qiáng)的肉香屬性，以雙孢蘑菇酶解液為原料制得的反應(yīng)樣品表現(xiàn)出最強(qiáng)的烤香屬性和咸香屬性，這兩種樣品同時也具有較強(qiáng)的油脂香氣；以杏鮑菇酶解液為原料制得的樣品整體香氣強(qiáng)度較低。不同食用菌酶解液美拉德反應(yīng)后，得到的樣品在感官輪廓上存在顯著差異。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-IMS分析結(jié)果

采用GC-IMS對不同品種食用菌為原料制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，由Reporter插件生成揮發(fā)性化合物的離子遷移譜，如圖2。

相對遷移時間為目標(biāo)化合物與對應(yīng)電場反應(yīng)離子峰遷移時間的比值。圖2 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氣相- 離子遷移譜Fig.2 GC-IMS images of different Maillard reaction products

圖2(a)為不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分離子遷移譜的三維譜圖，由圖2(a)可以看出，不同樣品中的揮發(fā)性成分在種類和含量上均存在差異。為了直觀比較樣本間的差異信息，結(jié)合二維俯視圖[圖2(b)]進(jìn)一步對樣品的離子遷移譜進(jìn)行分析。圖2(b)縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時間，橫坐標(biāo)代表相對離子遷移時間。橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰，反應(yīng)離子峰兩側(cè)的每一點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物。顏色代表物質(zhì)的濃度。對于參比物和分析物中濃度相同的揮發(fā)物，摳除后的背景會呈現(xiàn)白色。藍(lán)色表示化合物濃度低于參考值，紅色表示化合物濃度高于參考值[16]。RIP表示反應(yīng)離子峰遷移時間，不同電場中反應(yīng)離子峰的遷移時間不同。MRP- Po樣品的RIP為4.96 ms，MRP- Pe的RIP為4.71 ms，MRP- Ab的RIP為4.96 ms，MRP- Le的RIP為4.71 ms。從圖2(b)可以看出，4種樣品揮發(fā)性成分存在差異。不同樣品中揮發(fā)性成分的差異主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強(qiáng)度及時間上。以MRP- Po樣品譜圖為參照，MRP- Ab和MRP- Le譜圖上的藍(lán)色信號峰和紅色信號峰較多，說明其包含的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多，而MRP- Pe譜圖上藍(lán)色信號峰和紅色信號峰較少，說明其包含的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較少。

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時間和離子遷移時間，通過GC-IMS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配從而對揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，結(jié)果如表2。由表2可知，從不同食用菌美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中共檢測出59種揮發(fā)性物質(zhì)單體及部分物質(zhì)的二聚體和三聚體，主要包括醇類6種，醛類19種，酮類4種，酯類2種，烴類3種，酸類1種，呋喃類3種。由于GC-IMS內(nèi)置數(shù)據(jù)庫尚不夠完善，因此分析結(jié)果中有21種揮發(fā)性成分未能定性，未定性的化合物用編號表示。由表2可以看出，不同食用菌原料制得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分存在明顯差異。在59種揮發(fā)性化合物中，以雙孢蘑菇和平菇為原料制得的樣品中種類最多，共58種，其余依次為以香菇為原料制得的樣品55種，以杏鮑菇為原料制得的樣品53種。有7種化合物僅在個別樣品中被檢到，其余化合物為4種樣品中所共有的揮發(fā)性成分，但在不同樣品中的相對含量有所差異。

表2 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性化合物的GC-IMS分析結(jié)果Tab.2 Results of analysis of volatile compounds in different Maillard reaction products by GC-IMS

續(xù)表2

在以雙孢蘑菇為原料制得的美拉德反應(yīng)基料中，醛類化合物含量顯著高于其他3種樣品，其中，3-甲基丁醛是最主要的揮發(fā)性成分。3-甲基丁醛主要來源于亮氨酸的Strecker降解，而前期實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，雙孢蘑菇酶解液中亮氨酸含量顯著高于平菇和香菇酶解液中亮氨酸含量，與杏鮑菇酶解液中亮氨酸含量無顯著差異。因此，不同原料品種對部分醛類化合物構(gòu)成的影響，可能由品種間氨基酸類前體物質(zhì)差異所致。此外，還檢測到己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等直鏈醛類化合物，它們大多以脂肪酸為前體物質(zhì)，經(jīng)脂肪的氧化降解而形成。醛類物質(zhì)香氣閾值較低，具有脂香氣味，對樣品整體香氣輪廓的形成具有較大貢獻(xiàn)。

在以香菇為原料制得的美拉德反應(yīng)基料中，醇類化合物含量顯著高于其他3種樣品，其次為以平菇為原料制得的樣品。醇類化合物是食用菌中的主要揮發(fā)性成分，其前體物質(zhì)主要是原料中的多不飽和脂肪酸。1-辛烯-3-醇又被稱為蘑菇醇，具有強(qiáng)烈的蘑菇和泥土香氣[17]；2-辛醇也具有典型的蘑菇風(fēng)味[18]。醇類物質(zhì)對于整體風(fēng)味有一定的修飾作用，但是醇類物質(zhì)的閾值比醛類物質(zhì)高，對風(fēng)味作用相對較小。

在以雙孢蘑菇為原料制得的美拉德反應(yīng)基料中，酮類化合物含量最高，在以杏鮑菇為原料制得的美拉德反應(yīng)基料中，酮類化合物含量最低。殷朝敏等[19]對不同品種食用菌揮發(fā)性成分的分析結(jié)果表明，酮類是雙孢蘑菇和平菇中相對含量最高的揮發(fā)性成分，杏鮑菇中酮類物質(zhì)含量較少。酮類物質(zhì)可由亞油酸氧化降解生成氫過氧化物而產(chǎn)生，因此，不同品種間酮類物質(zhì)的差異可能是由品種間初生代謝產(chǎn)物差異所致。酮類化合物具有特殊的香氣，短鏈酮類常具有脂肪和焦香氣味[20]。

在4種食用菌美拉德反應(yīng)樣品中均檢出了含量較高的糠醛。以杏鮑菇為原料制得的樣品中糠醛含量最高，其次為以平菇和雙孢蘑菇為原料制得的樣品，以香菇為原料制得的樣品中糠醛含量最低。研究表明，糠醛是呋喃類物質(zhì)重要衍生物之一，主要通過糖降解途徑生成，使樣品呈現(xiàn)典型的油炸和烘烤香氣，對于特征香氣輪廓的形成具有重要貢獻(xiàn)[15]。食用菌原料中糖組成和含量的差異可能對不同樣品中糠醛的含量差異有一定影響。

此外，GC-IMS的鑒定結(jié)果中還存在大量未能定性的化合物，占到了化合物總數(shù)的30%左右，這主要是由于GC-IMS內(nèi)置定性數(shù)據(jù)庫還不夠完善。為獲得樣品揮發(fā)性組分的綜合信息，本研究結(jié)合GC-MS對4種食用菌的美拉德反應(yīng)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果

采用固相微萃取結(jié)合GC-MS分析反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分組成，結(jié)果如表3。由表3可知，從4種食用菌美拉德反應(yīng)產(chǎn)物樣品中共鑒定出68種揮發(fā)性成分，包括醇類9種，醛類10種，酸類10種，酮類7種，醚類2種，酯類3種，呋喃類5種，吡嗪類2種，含硫化合物20種。以杏鮑菇、雙孢蘑菇、平菇和香菇為原料制得的美拉德反應(yīng)樣品中分別檢測出41、42、43和57種揮發(fā)性成分。

與其他3種樣品相比，以香菇為原料制得的美拉德反應(yīng)樣品中含硫化合物組成尤為豐富。這主要與使用原料為干香菇有關(guān)。香菇中含有大量的含硫雜環(huán)化合物，包括1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷，1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷等。含硫雜環(huán)化合物由前體物質(zhì)香菇酸在谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶的作用下產(chǎn)生二硫雜環(huán)丙烷中間體聚合而成，由于它們的穩(wěn)定性不高，容易分解生成硫醚類化合物[21]。含硫化合物被認(rèn)為是形成肉香的重要化合物，能夠?yàn)槊览路磻?yīng)產(chǎn)物提供基礎(chǔ)肉香[22]。含硫化合物中，所有樣品均檢出的物質(zhì)有9種，包括硫醇、硫醚、噻吩、噻唑等，但其含量均存在一定差異，半胱氨酸的熱降解及其與羰基化合物之間的反應(yīng)是生成含硫化合物的主要途徑。

在以雙孢蘑菇為原料制得的樣品中，酸類化合物，尤其是高分子酸的含量顯著高于其他樣品。美拉德反應(yīng)樣品中的酸類化合物大部分是相同碳原子的醇類、酮類、醛類化合物的氧化產(chǎn)物。研究表明，高分子的酸往往具有蠟香和脂肪香氣，由于酸的香味閾值較大，對樣品的特征風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但酸類化合物與其他香氣組分具有協(xié)同效應(yīng)，可以增加樣品香氣的豐富度與整體強(qiáng)度。

在4種食用菌美拉德反應(yīng)樣品中，吡嗪類化合物含量均存在一定差異。吡嗪類化合物是單獨(dú)被GC-MS檢測到的一類化合物。吡嗪類化合物通常情況下是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，具有可可、烤香及堅(jiān)果香氣，在咖啡、薯片、豆醬、堅(jiān)果等許多食品中被檢出。從表3分析結(jié)果可以看到，在4種美拉德反應(yīng)樣品中，吡嗪類化合物的檢出量很低，這可能是由于反應(yīng)體系中半胱氨酸的添加抑制了吡嗪類化合物的生成[23]。

和GC-IMS相比，GC-MS鑒定出相對更豐富的含硫、含氮和呋喃類化合物，但GC-MS無法分析鑒定出一些低沸點(diǎn)的易揮發(fā)組分，如3-甲基丁醛、丁醛、2-甲基丙醛、1-丁醇、2-丁酮、2-戊酮等。采用GC-IMS和GC-MS兩種技術(shù)手段協(xié)同分析，可以獲得樣品更加全面的揮發(fā)性風(fēng)味成分信息。

2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的PCA分析

PCA是目前應(yīng)用最為廣泛的一種無監(jiān)督的多元統(tǒng)計學(xué)分析方法。為了更加直觀地分析4組樣品的風(fēng)味差異，選取不同原料制得美拉德反應(yīng)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的峰強(qiáng)度進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖3。圖3(a)為以GC-IMS測定結(jié)果為數(shù)據(jù)集進(jìn)行PCA分析的得分圖。從圖3(a)可以看到，PC1和PC2分別解釋了總方差的46.5%和29.9%，兩者貢獻(xiàn)率之和為76.4%，說明數(shù)據(jù)降維后所得綜合變量在二維空間能較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息。通過二維空間的數(shù)據(jù)分布差異可以直觀地觀察到組間和組內(nèi)樣品間的差異性，組內(nèi)各樣品相對距離較近或重疊，說明不同美拉德反應(yīng)樣品的重復(fù)性較好，不同樣品各組數(shù)據(jù)的成簇區(qū)域有明顯的間距，說明不同原料制得的樣品間的特異性較明顯，PCA模型能夠依據(jù)GC-IMS測定得到的揮發(fā)性成分對樣品進(jìn)行有效區(qū)分。

表3 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性化合物的GC-MS分析結(jié)果Tab.3 Results of analysis of volatile compounds in different Maillard reaction products by GC-MS

續(xù)表3

4種MRP樣品GC-MS測定結(jié)果的PCA得分圖如圖3(b)。由圖3(b)可知，PC1和PC2分別解釋了總方差的59.5%和28.2%，兩者貢獻(xiàn)率之和為87.7%，數(shù)據(jù)降維后所得綜合變量在二維空間能較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息。從圖3(b)可以看出，不同樣品在得分圖上可以大致劃分為3個區(qū)域，其中，以香菇為原料制得的樣品和以雙孢蘑菇為原料制得的樣品能夠?qū)崿F(xiàn)有效的分離，以杏鮑菇和平菇為原料制得的樣品不能完全區(qū)分開。這可能和SPME- GC-MS對于低沸點(diǎn)組分的檢出能力偏低有關(guān)。

圖3 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分GC-IMS和 GC-MS數(shù)據(jù)的主成分分析Fig.3 PCA of GC-IMS and GC-MS data analysis of volatiles compounds in different Maillard reaction products

2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的OPLS-DA分析

和PCA相似，OPLS-DA也是基于降維的多維向量分析方法。但是OPLS-DA為有監(jiān)督的分析，可以預(yù)設(shè)分類，彌補(bǔ)了PCA方法的不足，強(qiáng)化組間差異，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[24]。分別以GC-IMS和GC-MS鑒定的揮發(fā)性組分相對含量為X變量，以樣品類別為Y變量進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果如圖4。由圖4(a)可以看出，依據(jù)GC-IMS分析結(jié)果，4種美拉德反應(yīng)樣品可以實(shí)現(xiàn)較好地區(qū)分效果，OPLS-DA模型解釋率參數(shù)R2Y為0.992，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.982，說明該模型對4種MRP樣品風(fēng)味具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力。圖4(b)為GC-MS分析結(jié)果的OPLS-DA分析模型得分圖。由圖4(b)可知，R2Y為0.982，Q2為0.959，說明該模型對不同食用菌源MRP樣品具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力，相比于PCA分析結(jié)果，OPLS-DA使組間差異更明顯。

圖4 不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分GC-IMS和GC-MS 數(shù)據(jù)的正交偏最小二乘判別分析Fig.4 OPLS-DA of GC-IMS and GC-MS data analysis of volatiles compounds in different Maillard reaction products

變量投影重要性(variable important in projection, VIP)可以進(jìn)一步量化OPLS-DA的每個變量對樣品分類的貢獻(xiàn)，VIP值越大，變量在不同樣品間的差異越顯著，通?？梢詫IP>1表示為關(guān)鍵變量[25]。依據(jù)VIP值，從GC-IMS分析結(jié)果中共篩選出10種潛在的揮發(fā)性特征標(biāo)志物，包括醇類1種(1-辛烯-3-醇)，醛類4種(3-甲基丁醛二聚體、己醛單體、己醛三聚體、苯甲醛單體)，酮類1種(2,3-戊二酮)，呋喃類2種(糠醛單體、糠醛二聚體)，酸類1種(甲酸)，烴類1種(β-羅勒烯)。從GC-MS分析結(jié)果中同樣篩選出10種潛在的揮發(fā)性特征標(biāo)志物，包括醇類3種(2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇)，醛類1種(苯乙醛)，酸類2種(3-甲基丁酸、辛酸)，含硫化合物3種[2-甲基-3-戊烷硫醇、1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚]，呋喃類化合物1種(糠醛)。

在圖4得到的VIP>1的化合物中，醛類化合物種類最多，因此醛類化合物對于不同來源食用菌原料制備得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味有重要影響。醛類化合物主要由不飽和脂肪酸熱降解產(chǎn)生，由此推測，不同品種食用菌中脂肪酸類前體物質(zhì)的差異是醛類物質(zhì)最終種類和含量差異的主要原因之一。部分醛類化合物如3-甲基丁醛等是氨基酸Strecker降解的產(chǎn)物，這些化合物的差異和不同原料中氨基酸組成的差異密切相關(guān)。此外，含硫化合物因其具有極低的閾值，在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味形成過程中起著關(guān)鍵的作用。與其他樣品相比，以香菇為原料制得的美拉德反應(yīng)樣品中含硫化合物種類和含量均較為豐富，且樣品中存在一些香菇原料特有的含硫化合物，如1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷等，這使其肉香風(fēng)味較其他樣品更加突出，因此可以作為制備食用菌源肉味美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最佳反應(yīng)原料。

3 結(jié) 論

本研究選擇香菇、雙孢蘑菇、杏鮑菇和平菇為原料，進(jìn)行酶解和美拉德反應(yīng)，制備食用菌源肉味基料。采用描述性感官分析、GC-IMS和GC-MS對不同來源MRP的風(fēng)味特征進(jìn)行分析。結(jié)果表明，原料的選用對于產(chǎn)品的風(fēng)味有明顯影響，以香菇為原料制備的MRP樣品具有明顯的肉香，是制備食用菌源美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最佳原料。揮發(fā)性風(fēng)味成分分析結(jié)果表明，醇類、醛類、酮類、酸類、呋喃類和含硫化合物為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要揮發(fā)性化合物，采用GC-IMS和GC-MS兩種技術(shù)手段協(xié)同分析，可以獲得不同樣品更加全面的揮發(fā)性風(fēng)味成分信息。不同樣品間揮發(fā)性成分存在顯著差異，多元統(tǒng)計學(xué)方法可根據(jù)揮發(fā)性化合物組成對不同樣品進(jìn)行有效區(qū)分。通過變量重要性投影篩選出的標(biāo)志性化合物主要包括醛類、醇類、酸類和含硫化合物，這些化合物的差異與不同品種食用菌中前體物質(zhì)組成的差異密切相關(guān)。本研究旨在為食用菌源肉味基料的原料選擇和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。在后續(xù)研究中可以進(jìn)一步對不同食用菌中前體物質(zhì)與風(fēng)味成分變化的相關(guān)性進(jìn)行研究，闡明其對風(fēng)味的影響機(jī)制。