楊可心 劉國華 郭寶珠 鄭愛娟 陳志敏 常文環(huán) 王澤棟 蔡輝益
(中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所,農(nóng)業(yè)部生物飼料重點實驗室,北京100081)
羽毛是養(yǎng)殖業(yè)屠宰固廢的重要組成部分,我國每年肉雞和蛋雞總出欄量可超100億羽,以羽毛占體重比5%~7%計算,可產(chǎn)生數(shù)百萬噸羽毛。其中,水禽羽毛可加工為附加值較高的羽絨制品,而雞羽毛常因附加值較低被廢棄。雞羽毛具有75%以上的粗蛋白質(zhì)含量,主要由一種“硬蛋白”——羽毛角蛋白構(gòu)成,這種蛋白由氫鍵、二硫鍵和其他交聯(lián)作用共聚形成復雜穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)[1],從而具有強大的抗張性[2]、柔韌性和機械強度,難以被常見蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)消化[3],因此也很難被動物直接利用。羽毛的氨基酸、礦物質(zhì)微量元素和維生素種類豐富,將其抗性物質(zhì)破壞,則能發(fā)揮極高的飼用價值。20世紀末,以高溫高壓水解法、膨化法、酸解堿解法等傳統(tǒng)方法進行羽毛資源飼料化加工,有效解決了羽毛處理問題。但高溫高壓法導致羽毛中熱敏氨基酸的損失[4],酸解堿解法導致氨基酸的破壞[5],使產(chǎn)物品質(zhì)下降。同時,能耗高、廢棄產(chǎn)物多等的特點是傳統(tǒng)加工方式引起環(huán)境問題的最主要原因,導致羽毛飼料化面臨新的挑戰(zhàn)和機遇。微生物發(fā)酵技術(shù)兼具改善飼料原料營養(yǎng)價值結(jié)構(gòu)和環(huán)境友好的特點。本研究擬篩選可高效降解羽毛的微生物,對羽毛進行微生物發(fā)酵技術(shù)處理,改善羽毛營養(yǎng)價值。目前已有研究表明,可分離出不同種屬微生物對羽毛具有降解效果,如尖孢鐮刀菌[6]、絲狀真菌[7]、地衣芽孢桿菌[8-10]、枯草芽孢桿菌[11]、蠟樣芽孢桿菌[12-13]、弗氏鏈霉菌[14]等。本研究通過分離得到的羽毛降解菌進行羽毛微生物發(fā)酵,可有效改善羽毛的營養(yǎng)價值結(jié)構(gòu),提升羽毛利用率和可溶性蛋白及氨基酸含量,為開發(fā)動物廢棄物資源提供生物材料。
1.1.1 菌種
牛、羊瘤胃富集菌種,保藏于實驗室。
1.1.2 羽毛采集及處理
羽毛采集于北京昌平南口試驗基地;新鮮廢棄的42日齡白羽肉雞羽毛。羽毛處理:剔除羽毛中雞肉殘渣、血塊、腳皮等雜質(zhì),用水反復沖洗至潔凈狀態(tài),暴曬晾干。為保證羽毛底物均勻性和穩(wěn)定性,剔除粗大成羽,粉碎后過18目篩,取篩上物作為羽毛培養(yǎng)基底物。
1.1.3 培養(yǎng)基
1)LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L,自然pH,121 ℃滅菌20 min。
2)LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15 g/L,自然pH,121 ℃滅菌20 min。
3)酪蛋白培養(yǎng)基:干酪素(酪蛋白)10 g/L、牛肉浸粉 3 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L,pH 7.0,115 ℃滅菌30 min。
4)羽毛培養(yǎng)基1:完整羽毛1根、營養(yǎng)鹽溶液10 mL(NaCl 0.5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.7 g/L、MgSO40.1 g/L),pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。
5)羽毛培養(yǎng)基2:羽毛粉1%(m/v)、營養(yǎng)鹽溶液100 mL(NaCl 0.5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.7 g/L、MgSO40.1 g/L),pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。
1.2.1 菌種初篩
將活化的菌液點圖于酪蛋白培養(yǎng)基,設(shè)置5個重復,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察并測量降解圈直徑和菌落直徑,計算降解圈直徑/菌落直徑的比值。選擇比值大、透明度高的菌株作為復篩菌株。
1.2.2 菌種復篩
將活化的菌液以2%(v/v)的接種量分別接種于羽毛培養(yǎng)基1和2中,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。分別設(shè)置無菌空白對照組。觀察記錄羽毛培養(yǎng)基1中完整羽毛降解情況。試驗結(jié)束后測定羽毛培養(yǎng)基2的降解液可溶性蛋白含量。
1.2.3 菌種鑒定
1.2.3.1 菌落和細菌形態(tài)觀察
用平板畫線法將菌株NLG1接種在LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h,肉眼觀察菌落形狀、顏色、表面質(zhì)地和菌落邊緣等形態(tài),并進行革蘭氏染色制片觀察。
1.2.3.2 細菌生物學鑒定
菌株NLG1經(jīng)多次純化傳代后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行細菌16S rDNA基因測序。將測得序列結(jié)果在NCBI的BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫已測標準菌株進行比對。采用MEGA 4構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.4 細菌生長曲線測定
將菌株NLG1接種在LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)24 h,每小時取樣1次,在600 nm下測定菌液吸光度(OD )并繪制細菌生長曲線。
1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化
活化菌液于無菌離心管中4 000 r/min離心10 min,棄上清液,留沉淀,無菌生理鹽水反復洗滌重懸2次,制成體積為1 mL、活菌數(shù)為107CFU/mL的菌種重懸液。將菌種重懸液轉(zhuǎn)接于羽毛培養(yǎng)基2中,搖床180 r/min、37 ℃培養(yǎng)3 d。改變溫度(25、27、29、31、33、35、37、41、43 ℃)、初始pH(5、6、7、8、9、10、11、12)、活菌數(shù)(106、107、108、109CFU/mL)、底物濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、外加2%碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉)和發(fā)酵時間(0、1、2、3、4、5、6、7、8 d),研究發(fā)酵條件對菌株NLG1羽毛降解的影響,測定發(fā)酵液可溶性蛋白含量。
1.2.6 可溶性蛋白含量測定
采用考馬斯亮藍G250法[15]測定羽毛發(fā)酵液中可溶性蛋白含量。
1.2.7 上清液氨基酸成分分析
以優(yōu)化后條件進行羽毛發(fā)酵,取培養(yǎng)0(當天)和3 d的發(fā)酵液,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,棄沉淀,取上清液并過濾膜過濾。參照QB/T 18246—2000,采用全自動氨基酸分析儀(日立L-8900,日本)測定氨基酸總量。取一定量樣品上清液與磺基水楊酸均勻混合,于4 ℃靜置60 min后采用低溫離心機12 000 r/min離心20 min,除去樣液中多肽或小肽后采用全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量。
試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0中one-way ANOVA進行單因素方差分析,采用Duncan氏法進行多重比較。以P<0.05為顯著性判斷標準。
通過酪蛋白培養(yǎng)基進行初篩,共得到16株降解酪蛋白、產(chǎn)生透明圈的菌株。根據(jù)透明圈直徑/菌落直徑的比值大小進行比較,留取50%株菌作為后續(xù)試驗用菌。初篩結(jié)果如表1和圖1所示。
表1 不同菌株酪蛋白平板培養(yǎng)基產(chǎn)圈情況
圖1 初篩菌株產(chǎn)圈能力
分別接種8株初篩菌株的羽毛培養(yǎng)基1、2的降解情況、降解液可溶性蛋白含量測定結(jié)果分別見圖2、圖3。為保證結(jié)果可靠性,選擇羽毛發(fā)育程度、形態(tài)、質(zhì)量相同的單根完整羽毛制作羽毛培養(yǎng)基1。圖2所示,以空白(無菌)培養(yǎng)基為對照,經(jīng)3 d培養(yǎng)后,除接種NLG2和NLG6的羽毛降解不明顯外,其余菌株均能將培養(yǎng)基羽毛不同程度降解,其中NLG1和S2-2可將其降解為細碎粉狀,S1-1、LY、S1-2和S2-1則將其降解為羽毛段或僅剩羽干。研究發(fā)現(xiàn)在羽毛降解中,菌株NLG1和S2-2降解羽毛速度快、降解完整性更高。
羽毛培養(yǎng)基2的降解液可溶性蛋白含量測定結(jié)果如圖3所示。所有接種菌液的培養(yǎng)基,其降解液可溶性蛋白含量均較空白對照組顯著增加(P<0.05)。其中接種NLG1的羽毛降解液可溶性蛋白含量最高,為(9.21±0.06) μg/mL。
結(jié)合羽毛培養(yǎng)基1、2的結(jié)果,菌株NLG1可快速降解羽毛、可溶性蛋白含量高,確定其為目標菌株。
圖中對應各菌株接種順序從左到右依次為:空白(無菌)、NLG1、NLG2、NLG6、S1-1、S1-2、S2-1、S2-2、LY。
數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。
2.3.1 菌落形態(tài)和染色結(jié)果
將菌株NLG1接種于LB固體培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,肉眼觀察結(jié)果,如圖4所示,培養(yǎng)初期,菌落形態(tài)接近圓形、顏色淺黃且不透明,表面光滑邊緣整齊;培養(yǎng)后期,菌落顏色呈白色或乳白色,表面粗糙不規(guī)則、有皺褶,中間有突起或凹陷,邊緣不整齊,四周云霧狀擴散。將該菌進行革蘭氏染色,結(jié)果如圖4所示,染色后顏色呈紫色,形態(tài)為桿狀,有芽孢,故該菌株為革蘭氏陽性(G+)芽孢桿菌。
A:菌株NLG1在LB固體培養(yǎng)基的菌落形態(tài);B:菌株NLG1細菌革蘭氏染色結(jié)果(100×)。
2.3.2 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果
經(jīng)總DNA的提取、擴增,送至生工基因測序后得到的結(jié)果在NCBI的BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫已測標準菌株基因序列進行比對分析。結(jié)果如圖5所示,菌株NLG1的16S rDNA基因序列與貝萊斯芽孢桿菌NR 075005.2 (BacillusvelezensisNR 075005.2)具有同源性,長度約1 484 bp,GenBank保守序列登錄號為MZ 959415。綜合形態(tài)學和分子鑒定的結(jié)果,初步判定并命名為貝萊斯芽孢桿菌NLG1(BacillusvelezensisNLG1)。
由圖6可知,菌株NLG1在0~3 h進入發(fā)育遲緩期;在3~5 h迅速繁殖進入生長對數(shù)期;隨后生長速度變緩,在13~15 h進入穩(wěn)定期;培養(yǎng)時長超過15 h后進入衰亡期。
Bacillus subtilis:枯草芽孢桿菌;Bacillus velezensis:貝萊斯芽孢桿菌;Bacillus vietnamensis:越南芽孢桿菌;Bacillus sporothermodurans:耐熱芽孢桿菌。
圖6 菌株NLG1的生長曲線
2.5.1 溫度對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖7可知,27 ℃為其降解羽毛的最適溫度,測得可溶性蛋白含量最高,為(23.73±0.07) μg/mL,較其他溫度條件均差異顯著(P<0.05)。
2.5.2 初始pH對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖8可知,發(fā)酵初始pH由5增加至10時,羽毛降解液中可溶性蛋白含量線性增加,并達到最高值(34.20±0.57) μg/mL;當初始pH增加至11、12時,降解液中可溶性蛋白含量迅速降低后再次增加,且與初始pH為10時可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。
圖7 溫度對菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)
圖8 初始pH對菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)
2.5.3 底物濃度對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖9可知,底物濃度由0.5%增加至3.0%,降解液中可溶性蛋白含量呈先增加后降低,并在底物濃度為2.5%,可溶性蛋白含量抵達峰值為(38.56±2.21) μg/mL,且相對其他底物濃度可溶性蛋白含量均差異顯著(P<0.05)。因此,2.5%的底物濃度更利于菌株NLG1降解羽毛。
圖9 底物濃度對菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)
2.5.4 活菌數(shù)對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖10可知,接種活菌數(shù)由106CFU/mL增加至109CFU/mL時,降解液中可溶性蛋白含量隨接種活菌數(shù)濃度增加呈線性增加趨勢。以此說明,在時間及其他各條件不變的情況下,接入活菌數(shù)越多對羽毛降解和可溶性蛋白產(chǎn)生越有利。
圖10 活菌數(shù)對菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)
2.5.5 外加碳源對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖11可知,不添加任何外加碳源的對照組降解液中可溶性蛋白含量較添加任意外加碳源組均差異顯著(P<0.05);可溶性淀粉組與麥芽糖組降解液可溶性蛋白含量之間差異不顯著(P>0.05),與其他外加碳源組均差異顯著(P<0.05)。因此,其他條件穩(wěn)定不變的條件下,在菌株NLG1降解羽毛過程中額外補充可溶性淀粉更利于羽毛快速降解、釋放可溶性蛋白。
圖11 外加碳源對菌株NLG1降解羽毛
2.5.6 發(fā)酵時間對菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響
由圖12可知,降解液中可溶性蛋白含量呈增加、平穩(wěn)、降低、再平穩(wěn)的趨勢。在發(fā)酵的第3天,可溶性蛋白含量迅速增加到(32.76±0.07) μg/mL;在發(fā)酵的第3~5天維持不變,自第6天起可溶性蛋白含量降低且平穩(wěn)。
圖13為菌株NLG1在0~8 d內(nèi)羽毛降解變化圖。瓶中羽毛隨時間推移,羽干、羽枝逐漸被降解,降解液顏色變深、液體變渾濁。
2.6.1 羽毛降解液中氨基酸總量測定結(jié)果
由表2可知,在第0天的羽毛發(fā)酵液中雖然能檢測出17種氨基酸,但各個氨基酸的檢出量極低,氨基酸總量也僅為27.41 mg/g;在第3天的羽毛發(fā)酵液中檢測出的氨基酸種類保持不變,但各個氨基酸的檢出量和總氨基酸含量均有所增加。除組氨酸、蛋氨酸含量增加較少外,其余各個氨基酸含量都有較大幅度提高,尤其半胱氨酸含量增加了14.24 mg/g。
圖12 發(fā)酵時間對菌株NLG1降解羽毛
圖13 菌株NLG1羽毛降解過程
2.6.2 羽毛降解液中游離氨基酸含量測定結(jié)果
在NLG1降解的第0天,從上清液中檢測到包括基礎(chǔ)游離氨基酸及其他游離氨基酸在內(nèi)的游離氨基酸共計23種。除此之外檢測出尿素、?;撬岷图‰模礄z測出胱氨酸和苯丙氨酸這2種基礎(chǔ)游離氨基酸。降解第3天在羽毛降解上清液中可檢測出18種基礎(chǔ)氨基酸及其另外10種游離氨基酸衍生物、尿素、?;撬岷图‰?。經(jīng)3 d降解后的上清液中除甘氨酸、鳥氨酸和羥脯氨酸含量分別降低了0.012 2、0.000 5和0.561 0 mg/g外,其余游離氨基酸、衍生物等均有較大程度的增加?;A(chǔ)氨基酸中纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸谷氨酸和丙氨酸含量增加明顯。而其他氨基酸中β-丙氨酸含量有大幅增加,羥脯氨酸和鳥氨酸含量降低;通過檢測發(fā)現(xiàn)尿素、牛磺酸和肌肽含量也有增加。
溫度、初始pH、底物濃度、活菌數(shù)和發(fā)酵時間以及適合的碳源是影響羽毛降解的必要條件,更是影響微生物生長及代謝的重要因素。尹靜等[16]從腐爛藍藻中分離的粘質(zhì)沙雷氏菌SYBC YH(SerratiamarcescensSYBC YH)降解羽毛產(chǎn)可溶性蛋白最適溫度為40 ℃,最適pH為7。本研究所采用的菌株產(chǎn)可溶性蛋白的發(fā)酵溫度、初始pH作用范圍更廣,溫度可為25.0~43.0 ℃,最適溫度為27.0 ℃;初始pH可為5~12,最適pH為10。通過調(diào)節(jié)溫度以及初始pH發(fā)現(xiàn),該菌的羽毛降解能力在接近室溫、初始pH為堿性時更強。傅偉[9]在研究中證明,用0.1% Ca(OH)2處理3 h對微生物降解羽毛具有促進作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn),初始pH 10~12出現(xiàn)折線趨勢可能也是這一原因引起。羽毛作為唯一碳、氮源底物,濃度低時微生物最大限度利用羽毛、釋放可溶性蛋白,底物消耗殆盡后,可溶性蛋白可充當二次底物導致消耗現(xiàn)象;底物過剩,導致培養(yǎng)基密集度和黏度增加,致使通氧量不足,引發(fā)微生物的底物消耗能力受限,影響可溶性蛋白含量[17]。當微生物降解羽毛的作用時間以及底物濃度一定時,添加的活菌越多羽毛降解速度越快、可溶性蛋白產(chǎn)量越多。額外添加的碳源及時緩解了羽毛底物碳源匱乏問題,同時也能誘導微生物產(chǎn)生誘導型羽毛降解酶[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),添加可溶性淀粉與添加麥芽糖的可溶性蛋白含量差異不顯著,而結(jié)果優(yōu)于添加麥芽糖組,可能是可溶性淀粉水解過程中產(chǎn)生多種類碳源均能進一步促進菌株生長、作用,且可溶性淀粉取材廉價,更適作為試驗研究的優(yōu)選外加碳源。發(fā)酵是微生物降解羽毛保持動態(tài)平衡的過程。郭剛等[19]所采用的地衣芽孢桿菌在發(fā)酵第3天時可溶性蛋白含量增長至最高后迅速降低。本研究所采用菌株發(fā)酵3~5 d亦使可溶性蛋白含量維持穩(wěn)定狀態(tài),羽毛分解更徹底。
表2 羽毛上清液中總氨基酸組成及含量變化
表3 羽毛上清液中游離氨基酸組成及含量變化
續(xù)表3項目 Items第0天 Day 0 第3天 Day 3 增加量 Increasing content脯氨酸 Pro0.121 31.254 41.133 1天冬酰胺 Asn0.293 40.293 4瓜氨酸 Citn0.099 51.115 01.015 5鳥氨酸 Orn0.045 60.045 1-0.000 5磷酸絲氨酸 Pser0.273 20.965 10.692 0牛磺酸 Taurine0.136 40.151 50.015 1尿素 Urea0.097 40.965 90.868 5α-氨基已二酸 AAD0.012 40.079 80.067 4α-氨基丁酸 AABA0.244 70.244 7β-丙氨酸 β-Ala5.493 45.493 4β-氨基異丁酸 IUPAC0.517 60.517 6γ-氨基丁酸 GABA0.025 80.061 80.036 1肌肽 CAR0.101 50.180 20.078 7羥脯氨酸 HYP0.690 70.129 7-0.561 0合計 Total3.969 566.327 062.357 4
羽毛是由多種氨基酸組成的復雜蛋白質(zhì),羽毛降解菌將其分解成小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、多肽類、游離氨基酸及其他物質(zhì)。本試驗測定發(fā)酵前后的氨基酸組分,發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵條件和微生物可影響羽毛降解液的氨基酸種類[13,20-21]。發(fā)酵后上清液中氨基酸含量增加,其中半胱氨酸含量最多;除色氨酸未檢出外,其余7種必需氨基酸占氨基酸總含量的34.83%。半胱氨酸的產(chǎn)生意味著存在大量二硫鍵的羽毛結(jié)構(gòu)被打開,通過微生物降解將其還原成胱氨酸,推測本研究采用的菌株NLG1具有二硫鍵還原作用,同樣在涂國全等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)羽毛降解液中存在大量二硫鍵還原酶。色氨酸在羽毛降解過程中可能被微生物作為二次底物消耗轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。在游離氨基酸檢測中,除檢測出了大量的尿素外還檢測出β-丙氨酸等氨基酸衍生物,因此說明,氨基酸總量降低、游離氨基酸含量增加,是由于微生物降解羽毛過程中發(fā)生了大量的轉(zhuǎn)氨基、脫氨基作用。發(fā)酵后羽毛上清液中檢測出必需游離氨基酸總量占總檢出量的85.07%,如纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等。纈氨酸是一種支鏈氨基酸,也是動物必需氨基酸之一,是動物體蛋白質(zhì)的重要組成成分[22],也是蛋白質(zhì)合成代謝中的重要參與者[23],能促進機體生長[24]、能量供給[25]、增強免疫[26]及改善畜產(chǎn)品品質(zhì)[27]。苯丙氨酸既屬于芳香族氨基酸又屬于必需氨基酸,是藥物的中間體和原料,同時也應用于化工和食品領(lǐng)域生產(chǎn)護膚品和添加劑阿斯巴甜的原料[28]??梢?,羽毛降解液是一種氨基酸來源,也是必需氨酸的非常重要來源,為后期應用奠定基礎(chǔ)。
① 本試驗篩選出1株可降解羽毛的天然微生物菌株,鑒定并命名為貝萊斯芽孢桿菌NLG1。
② 基于羽毛培養(yǎng)基,貝萊斯芽孢桿菌降解羽毛培養(yǎng)條件優(yōu)化為:溫度27 ℃,初始pH 10,接種活菌數(shù)109CFU/mL,底物濃度2.5%,外加碳源為可溶性淀粉,培養(yǎng)時間3 d。
③ 貝萊斯芽孢桿菌可降解羽毛,羽毛發(fā)酵液上清液中可溶性蛋白含量為(32.76±0.07) μg/mL,水解氨基酸總量提高了87.67 mg/g,游離氨基酸及衍生物總量提高了62.36 mg/g,改善了羽毛的營養(yǎng)價值和氨基酸組成結(jié)構(gòu)。