李 林 宮彬彬 許長(zhǎng)鋒 曹 萌 李建嫄 趙 梅 唐偉斌

(1.邢臺(tái)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，邢臺(tái)054001；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院病理科，邢臺(tái)054001)

隨著人們生活水平的不斷提高和營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變，人們的飲食習(xí)慣正逐步向更健康、更營(yíng)養(yǎng)的方向發(fā)展。牛奶作為一種天然的營(yíng)養(yǎng)食品，人們對(duì)牛奶的需求也發(fā)生了量到質(zhì)的轉(zhuǎn)變。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，經(jīng)常用高精料飼糧喂養(yǎng)泌乳期的奶牛以獲得更高的產(chǎn)奶量。但是，高精料飼糧與粗飼料相比，其有效纖維含量有限，所以往往會(huì)引起瘤胃pH的降低，導(dǎo)致瘤胃微生物的裂解，提高瘤胃壁的滲透能力，使大量細(xì)菌組分，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等得以轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液循環(huán)，造成奶牛的亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)。蹄葉炎、胃腸道損傷、肝膿腫和乳腺炎是SARA常見的臨床癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，LPS作為大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的外膜成分，能夠通過(guò)血液循環(huán)從乳管侵入乳腺，改變?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，提高炎癥因子的表達(dá)，并對(duì)乳腺組織造成嚴(yán)重?fù)p傷[1]。

丁酸鈉作為一種新型的飼料添加劑，有效成分是丁酸，其作為揮發(fā)性脂肪酸的一種，主要由膳食纖維的腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉作為飼料添加劑能夠增強(qiáng)新生牛犢的抗氧化能力[4]，并且對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)性能和腸道完整性具有非常顯著的作用[5-7]。此外，丁酸鈉還具有刺激機(jī)體氧化磷酸化、保護(hù)線粒體和加速脂肪酸氧化的功能[8-10]。體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)丁酸鈉對(duì)奶牛組織器官的抗炎、抗損傷方面發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，但其在奶牛乳腺組織方面的研究較少，且不深入。因此，本試驗(yàn)在丁酸鈉作為新型飼料添加劑的基礎(chǔ)上，初次運(yùn)用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(MAC-T細(xì)胞)，通過(guò)向MAC-T細(xì)胞中添加丁酸鈉，分析丁酸鈉對(duì)MAC-T細(xì)胞的修復(fù)作用與調(diào)節(jié)機(jī)制，為丁酸鈉在改善泌乳期奶牛健康方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

MAC-T細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張?jiān)词缃淌陴佡?zèng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 MAC-T細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代

MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素及4.5 g/L葡萄糖)，每隔24 h更換1次新培養(yǎng)基，在37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用含0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液消化，1 500×g離心3 min，小心棄掉上清，將MAC-T細(xì)胞分別接種于6孔板、12孔板以及96孔板中。

1.2.2 LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞損傷模型的建立

將MAC-T細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)(5×104個(gè)/孔)，分別加入含有不同濃度(0、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)LPS的無(wú)血清培養(yǎng)基；在37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果)。然后每孔加入20 μL的5 mg/mL四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將上清棄去，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，微量振蕩器振蕩，于RT-6000半自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)各孔490 nm處的吸光度值，每組設(shè)置8個(gè)平行孔。

根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，確定LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞損傷模型的適宜濃度為1 000 ng/mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板當(dāng)中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用不同濃度(0、2、4、8、16、32 μmol/L)的丁酸鈉處理細(xì)胞24 h(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果)。收集細(xì)胞后加入200 μL的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)原液重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，采用美國(guó)BD FACS Calibur型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，確定16 μmol/L丁酸鈉對(duì)MAC-T細(xì)胞無(wú)不良影響。

1.3.2 丁酸鈉對(duì)LPS作用下MAC-T細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

將MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板當(dāng)中，用1 000 ng/mL的LPS預(yù)處理6 h，然后清洗細(xì)胞，再用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照。

1.3.3 丁酸鈉對(duì)LPS作用下MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

當(dāng)MAC-T細(xì)胞在6孔板中融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用1 000 ng/mL的LPS預(yù)處理6 h，然后清洗細(xì)胞，再用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h，收集細(xì)胞用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，2 500×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，暫保存至-20 ℃。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為20201010、20201121、20210210)，分別嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次。

1.3.4 丁酸鈉對(duì)LPS作用下MAC-T細(xì)胞凋亡蛋白mRNA的表達(dá)

總RNA提取與cDNA合成：將處理完收集的MAC-T細(xì)胞用TRIzol試劑根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度，取1 μg總RNA根據(jù)cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

目的基因及內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物設(shè)計(jì)：目的基因及內(nèi)參基因β-actin引物根據(jù)GenBank序列，用Primer Premier 5軟件自行設(shè)計(jì)，引物由上海生工公司合成，目的基因及β-actin引物序列見表1。

表1 目的基因及β-actin引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響

由圖1所示，用不同濃度LPS處理MAC-T細(xì)胞6 h后，與對(duì)照組相比，在100 ng/mL的LPS處理下，MAC-T細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；在1 000、10 000 ng/mL的LPS處理下，MAC-T細(xì)胞活力極顯著下降(P<0.01)。而預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，丁酸鈉對(duì)10 000 ng/mL的LPS處理下MAC-T細(xì)胞無(wú)修復(fù)作用。因此，本試驗(yàn)選用1 000 ng/mL的LPS來(lái)建立MAC-T細(xì)胞的損傷模型。

2.2 丁酸鈉對(duì)MAC-T細(xì)胞凋亡率的影響

由圖2所示，用不同濃度丁酸鈉處理MAC-T細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，在32 μmol/L的丁酸鈉處理下，MAC-T細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；而在2～16 μmol/L的丁酸鈉處理下，MAC-T細(xì)胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)。因此，選用16 μmol/L的丁酸鈉進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2同。

2.3 丁酸鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖3所示，對(duì)照組MAC-T細(xì)胞呈扁平的無(wú)規(guī)則形態(tài)，貼壁狀態(tài)良好；而1 000 ng/mL LPS處理6 h后，與對(duì)照組相比，LPS處理組MAC-T細(xì)胞核固縮、破裂，細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，并出現(xiàn)大面積死亡脫落現(xiàn)象；而用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h后，與LPS處理組相比，LPS+丁酸鈉處理組MAC-T細(xì)胞邊緣清楚，胞內(nèi)顆粒較少，死亡脫落現(xiàn)象明顯減少。

圖2 丁酸鈉對(duì)MAC-T細(xì)胞凋亡率的影響

圖3 丁酸鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 丁酸鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

由表2所示，用1 000 ng/mL的LPS處理6 h后，與對(duì)照組相比，LPS處理組MAC-T細(xì)胞中SOD活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，而MDA含量顯著升高(P<0.05)；而用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h后，與LPS處理組相比，LPS+丁酸鈉處理組MAC-T細(xì)胞中SOD活性和T-AOC顯著升高(P<0.05)，而MDA含量顯著降低(P<0.05)。

表2 丁酸鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.5 丁酸鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞凋亡蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

如圖4所示，用1 000 ng/mL的LPS處理6 h后，與對(duì)照組相比，LPS處理組MAC-T細(xì)胞中半胱天冬蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)；而用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h后，與LPS處理組相比，LPS+丁酸鈉處理組MAC-T細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，#表示與LPS處理組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

泌乳期奶牛長(zhǎng)期飼喂高精料飼糧會(huì)往往會(huì)引發(fā)許多機(jī)體健康問(wèn)題，如機(jī)體酸中毒、乳腺炎、蹄葉炎等。其主要原因是由于高精料飼糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃揮發(fā)性脂肪酸含量增加，瘤胃pH下降。這種較低的瘤胃pH會(huì)對(duì)瘤胃造成不利影響，擾亂瘤胃微生物群的組成[11-12]。而且，低瘤胃pH會(huì)引起革蘭氏陰性菌菌體裂解產(chǎn)生內(nèi)毒素[13]，其可以通過(guò)胃腸道進(jìn)入體循環(huán)，引起全身的炎癥反應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧會(huì)導(dǎo)致泌乳期奶牛機(jī)體健康受損，抗氧化應(yīng)激能力下降，最終導(dǎo)致乳品質(zhì)的降低[15]。乳品質(zhì)的降低主要與奶牛乳腺炎的發(fā)生有關(guān)，而造成乳腺炎的根因往往是由于外源性或內(nèi)源性的細(xì)菌如LPS的感染而引起的氧化應(yīng)激，從而觸發(fā)了免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)了乳腺細(xì)胞內(nèi)抗原的產(chǎn)生[16]。

體外培養(yǎng)的MAC-T細(xì)胞由于缺乏機(jī)體系統(tǒng)性的保護(hù)機(jī)制，因此極容易發(fā)生氧化損傷，LPS作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑已在體外模型中得到廣泛應(yīng)用[17]。Wang等[18]用不同濃度的LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)1 000和10 000 ng/mL LPS可造成小鼠乳腺上皮細(xì)胞的炎性損傷。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，1 000 ng/mL LPS可造成MAC-T細(xì)胞存活率顯著降低，并且炎癥水平明顯升高。在本試驗(yàn)中，通過(guò)LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞損傷模型發(fā)現(xiàn)，在LPS處理細(xì)胞6 h后，隨著LPS濃度的升高，MAC-T細(xì)胞活力下降。并且，100 ng/mL LPS處理可顯著降低細(xì)胞存活率，1 000和10 000 ng/mL LPS處理可極顯著降低細(xì)胞存活率。本試驗(yàn)和前人研究結(jié)果一致。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉對(duì)10 000 ng/mL LPS處理造成的細(xì)胞損傷不具備修復(fù)作用。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中我們選擇1 000 ng/mL的LPS作為適宜的處理濃度。

丁酸鹽作為一種安全的抗生素替代品，在養(yǎng)殖業(yè)受到廣泛關(guān)注。但丁酸鹽有異味且不穩(wěn)定，而丁酸鈉由于其穩(wěn)定、無(wú)臭的特性而被廣泛用于畜牧生產(chǎn)中。研究表明，丁酸鈉對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞的能量來(lái)源具有重要作用，并且還具有抗菌、抗炎和抗氧化特性。最近研究表明，丁酸鈉還可以通過(guò)改善肉雞的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和肉品質(zhì)來(lái)緩解LPS對(duì)肉雞的不利影響[20]。Zhou等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以通過(guò)改善腸道微生物群和胃腸道屏障，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎。Qiu等[22]用不同濃度的丁酸鈉處理豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的丁酸鈉對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，而高濃度的丁酸鈉會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯(G0/G1期)來(lái)增加細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)用不同濃度的丁酸鈉處理MAC-T細(xì)胞24 h后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度(2～16 μmol/L)的丁酸鈉對(duì)細(xì)胞無(wú)不良影響，而在32 μmol/L丁酸鈉處理下，其細(xì)胞凋亡率顯著上升。這表明高濃度的丁酸鈉會(huì)造成細(xì)胞的非正常凋亡，其結(jié)果與前人研究一致。因此，我們選用16 μmol/L的丁酸鈉作為適宜的處理濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

氧化反應(yīng)對(duì)身體至關(guān)重要，但過(guò)量的氧化反應(yīng)可能造成組織損傷。活性氧(reactive oxygen，ROS)是線粒體生理代謝的副產(chǎn)物，可參與多種細(xì)胞信號(hào)通路以及組織損傷和病理生理過(guò)程。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)抗氧化防御能力或缺乏最佳水平的抗氧化劑，這些物質(zhì)可能就會(huì)引起氧化應(yīng)激[23-25]。在家畜中，幾種疾病如肺炎、小腸的炎癥和乳腺炎都與氧化應(yīng)激有關(guān)，且有研究報(bào)道認(rèn)為乳腺氧化損傷和乳腺炎是隨著血清中氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)如MDA、一氧化氮(NO)等含量的增加而發(fā)生的。Salimi等[26]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以通過(guò)ROS的形成和線粒體損傷促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Sun等[27]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以保護(hù)大鼠肝臟免受高脂飲食誘導(dǎo)的機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的抗氧化酶類的活性，確認(rèn)丁酸鈉的抗氧化能力是否與細(xì)胞環(huán)境中ROS清除有關(guān)。SOD作為一種抗氧化酶，能夠及時(shí)清除具有活性的氧自由基，可以通過(guò)降低細(xì)胞外刺激(如紫外線照射)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)高水平超氧化物自由基而發(fā)揮作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MAC-T細(xì)胞呈扁平的無(wú)規(guī)則形態(tài)，貼壁狀態(tài)良好；而1 000 ng/mL LPS處理6 h后，與對(duì)照組相比，MAC-T細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、破裂，并出現(xiàn)大面積死亡脫落現(xiàn)象，MDA含量顯著升高，而SOD活性和T-AOC顯著降低；而用16 μmol/L丁酸鈉處理24 h后，與LPS處理組相比，細(xì)胞死亡脫落現(xiàn)象明顯減少，MDA含量顯著降低，SOD活性和T-AOC顯著升高。以上結(jié)果提示，丁酸鈉能夠緩解LPS造成的MAC-T細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

ROS在衰老、炎癥和癌癥中發(fā)揮重要作用。ROS也可以通過(guò)刺激質(zhì)膜死亡受體來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞死亡形式，導(dǎo)致受損細(xì)胞(如DNA損傷或發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞)的有序和有效清除。細(xì)胞凋亡可以由細(xì)胞的內(nèi)部信號(hào)(如基因毒性應(yīng)激)或外部信號(hào)(如配體與細(xì)胞表面死亡受體的結(jié)合)觸發(fā)。Bcl-2家族是最具代表性的參與凋亡細(xì)胞死亡調(diào)控的蛋白家族，包括抗凋亡和促凋亡成員[28]。Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路，抑制大腦中動(dòng)脈閉塞模型小鼠Bax等凋亡因子的上升。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞中，Caspase-3、Caspase-9、BaxmRNA表達(dá)水平顯著或極顯著升高，而Bcl-2 mRNA表達(dá)水平卻極顯著降低。但是，當(dāng)向細(xì)胞中添加丁酸鈉以后，與LPS處理組相比，MAC-T細(xì)胞中的凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平顯著降低，而抗凋亡的蛋白Bcl-2 mRNA水平表達(dá)顯著升高。另外，LPS+丁酸鈉處理組中Caspase-3、Caspase-9和BaxmRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，而Bcl-2 mRNA表達(dá)水平卻低于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，丁酸鈉對(duì)LPS造成的MAC-T細(xì)胞損傷起到了一定的修復(fù)作用，減少了細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

用1 000 ng/mL LPS處理MAC-T細(xì)胞會(huì)造成MAC-T細(xì)胞的非正常凋亡和氧化應(yīng)激損傷；而16 μmol/L丁酸鈉可以抑制MAC-T細(xì)胞的凋亡，并對(duì)LPS造成的氧化應(yīng)激損傷起到一定的修復(fù)作用。