王小亞 饒永超 陳大海 唐 宏 林家棟 張福平* 施曉麗*

(1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550025；2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025；4.貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)，貴陽(yáng)550025)

賴氨酸(Lys)是單胃動(dòng)物飼糧中的必需氨基酸，也稱為“生長(zhǎng)性氨基酸”，主要參與酶、多肽激素和蛋白質(zhì)的合成；賴氨酸也可作為一種生酮氨基酸，參與葡萄糖的代謝；此外，賴氨酸的添加量對(duì)體內(nèi)氨基酸的平衡和其他氨基酸的吸收利用也產(chǎn)生影響[1-2]。而賴氨酸缺乏會(huì)造成氮平衡失調(diào)、食欲下降、皮下脂肪含量減少、氨基酸代謝受損等不良影響[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼糧中添加適量的賴氨酸可促進(jìn)籠養(yǎng)蛋雛鴨的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而提高其采食量[5]。陳志敏等[6]報(bào)道，飼糧賴氨酸水平顯著影響肉仔雞采食量。家禽在飼養(yǎng)過(guò)程中采食行為受到不同因素的影響，如葡萄糖、脂肪和氨基酸等因素決定采食量，而采食和能量消耗主要受外部環(huán)境、激素以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等信號(hào)分子共同調(diào)控，其調(diào)控過(guò)程極其復(fù)雜[7-8]。家禽采食行為的調(diào)節(jié)主要由外周組織和中樞神經(jīng)控制。外周組織通過(guò)感受器反映體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝，并通過(guò)分泌多種肽和類固醇激素來(lái)調(diào)節(jié)采食；中樞神經(jīng)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物和家禽的攝食行為中有重要作用，包括下丘腦和腦干[9-10]，下丘腦作為最關(guān)鍵的調(diào)控中樞，通過(guò)多種促食行為和抑食神經(jīng)肽的共同作用來(lái)調(diào)節(jié)采食。中樞神經(jīng)和外周組織在受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的刺激后會(huì)產(chǎn)生多種信號(hào)分子(如神經(jīng)肽、激素和代謝產(chǎn)物)，這些信號(hào)分子在下丘腦的特定神經(jīng)元亞群中啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，與特定的受體結(jié)合形成信號(hào)通路，從而在細(xì)胞水平上調(diào)控家禽采食和能量消耗等生理作用[11]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于挖掘畜禽潛在候選基因和生物學(xué)通路。例如，Jehl等[12]研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦作為雞采食的調(diào)節(jié)中樞，低能量水平飼糧對(duì)脂肪和肝臟組織轉(zhuǎn)錄組無(wú)作用，但對(duì)下丘腦轉(zhuǎn)錄組有很大作用，說(shuō)明低能量水平飼糧影響下丘腦釋放、膽固醇合成和突觸活動(dòng)的表達(dá)，揭示了下丘腦與營(yíng)養(yǎng)水平的調(diào)節(jié)關(guān)系。Lv等[13]研究表明，添加高劑量染料木黃酮可降低雛雞的采食量，導(dǎo)致雞下丘腦苦味受體的一些差異表達(dá)基因下調(diào)，從而改變雞對(duì)甜味的感知，激活苦味受體信號(hào)通路。Yang等[14]利用RNA-Seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，部分候選基因和信號(hào)通路與地方雞飼料利用效率有關(guān)，如血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)、組織蛋白酶S(cathepsin，CTSS)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)等是影響飼料利用效率的候選基因，而細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)是導(dǎo)致飼料利用效率差異的主要通路。上述有關(guān)雞采食量轉(zhuǎn)錄組分析已被廣泛研究，取得了一定進(jìn)展。近年來(lái)，賴氨酸是營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱門話題，盡管此前已有相關(guān)研究，但大多數(shù)關(guān)于賴氨酸的研究多集中于肉雞賴氨酸的需要量、生產(chǎn)性能等方面[15-17]。貴州黃雞作為一個(gè)肉蛋兼用型品種，其氨基酸需要量低于快大型肉雞和肉用的黃羽肉雞，所以貴州黃雞對(duì)賴氨酸需要量不同于這些雞種。因此，本研究旨在通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對(duì)飼喂不同賴氨酸水平飼糧的貴州黃雞下丘腦組織進(jìn)行測(cè)序研究，深入了解賴氨酸調(diào)控貴州黃雞采食量的分子機(jī)制，挖掘與其采食量相關(guān)的關(guān)鍵基因和調(diào)控通路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健康的1日齡貴州黃雞雛雞400羽，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20羽。各組分別飼喂賴氨酸水平為0.7%、0.9%、1.1%和1.3%的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期6周。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前育雛舍全面消毒，封閉48 h，通風(fēng)1周。采用網(wǎng)上籠養(yǎng)，每籠20只。每天08:00、14:00、20:00進(jìn)行人工飼喂，自由飲水。舍內(nèi)紅外燈供熱，第1周舍內(nèi)溫度平均為32～35 ℃，之后每周降溫2～3 ℃，4周后常溫飼養(yǎng)，雞舍相對(duì)濕度保持在60%～65%，試驗(yàn)雞嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)免疫進(jìn)行。記錄好1～6周齡的采食量，計(jì)算平均日采食重：

平均日采食重=[(飼料總添加量-
飼料總剩余量)/試驗(yàn)天數(shù)]/20。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品選擇與采集

以不同賴氨酸水平飼糧飼喂到6周齡的貴州黃雞為研究對(duì)象，根據(jù)平均日采食量結(jié)果，選取1～6周齡平均日采食量差異極顯著(P<0.01)的0.9%賴氨酸水平組(b組)和1.3%賴氨酸水平組(d組)進(jìn)行測(cè)序，從這2組試驗(yàn)雞只中各挑選活潑健康的3只雞進(jìn)行挫骨處死，共6只雞。置于冰上打開頭顱，迅速取出下丘腦，沖洗后裝入無(wú)酶離心管中，置于液氮中暫存，轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RNA提取。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3.2 測(cè)序分析

用Trizol法提取下丘腦組織總RNA，純化后對(duì)總RNA完整性和濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后，構(gòu)建文庫(kù)，先使用Qubit 2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，插入片段符合預(yù)期后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L)，建庫(kù)合格后，采用Illumina HiSeqTM2000平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、質(zhì)控，同時(shí)，對(duì)有效數(shù)據(jù)(clean data)進(jìn)行Q20、Q30和GC含量計(jì)算。使用HISAT2 v2.0.5軟件將過(guò)濾后有效讀數(shù)與雞參考基因組(Gallus_gallus_5.0)進(jìn)行比對(duì)，獲取序列的比對(duì)效率和序列在參考基因組上的定位信息。使用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析(每個(gè)組3個(gè)重復(fù))。利用Cuffdiff軟件進(jìn)行定量分析，通過(guò)以每千個(gè)堿基的片段每百萬(wàn)片段映射的轉(zhuǎn)錄本(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)值來(lái)表示基因的表達(dá)水平，根據(jù)各樣品所有基因的FPKM值計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient，R2)，繪制成熱圖，可直觀評(píng)估組間或組內(nèi)樣品的重復(fù)相關(guān)性。以|log2(差異倍數(shù))|>0且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。采用Cluster Profile軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析，利用KOBAS 2.0軟件篩選KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.genome.jp/kegg/)差異基因富集到信號(hào)通路，以P<0.05作為差異顯著性的閾值。

1.3.3 測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)挑選了6個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的可靠性。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為相對(duì)基因定量的內(nèi)參基因，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系20 μL：10 μL Taq PCR Master Mix，7 μL ddH2O，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；并采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同組中基因的表達(dá)量?；蛞镄畔⒁姳?。

表2 基因引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

平均日采食量數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法對(duì)組間差異進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

以|log2(差異倍數(shù))|>0且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。采用Cluster Profile軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析，利用KOBAS 2.0軟件篩選KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中差異基因富集到信號(hào)通路，以P<0.05作為差異顯著性的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧賴氨酸水平對(duì)1～6周齡貴州黃雞平均日采食量的影響

由表3可知，4個(gè)組1～2周齡平均日采食量差異不顯著(P>0.05)。0.7%、0.9%、1.1%賴氨酸水平組3～4周齡平均日采食量極顯著高于1.3%賴氨酸水平組(P<0.01)，0.9%、1.1%賴氨酸水平組顯著高于0.7%賴氨酸水平組(P<0.05)。0.7%、0.9%、1.1%賴氨酸水平組5～6周齡平均日采食量極顯著高于1.3%賴氨酸水平組(P<0.01)，0.9%、1.1%賴氨酸水平組顯著高于0.7%賴氨酸水平組(P<0.05)。0.7%、0.9%、1.1%賴氨酸水平組1～6周齡平均日采食量極顯著高于1.3%賴氨酸水平組(P<0.01)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)與比對(duì)結(jié)果

構(gòu)建b組和d組各3個(gè)下丘腦組織樣品的文庫(kù)，原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后，獲得了各個(gè)樣品測(cè)序有效序列、有效堿基數(shù)、錯(cuò)誤率及GC、Q20、Q30含量(表4)。每個(gè)樣品產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)均在43 519 236以上，共獲得262 700 782個(gè)有效序列和39.41 G有效堿基數(shù)，其中，各個(gè)樣品測(cè)序錯(cuò)誤率均為0.03%，Q20、Q30含量分別在97%、93%以上，GC含量均在49.78%以上。由表5可知，每個(gè)樣品所產(chǎn)的測(cè)序讀數(shù)比對(duì)到雞參考基因組上比對(duì)率均大于89%，比對(duì)到唯一位置的比對(duì)率在88%以上，比對(duì)到多個(gè)位置的比對(duì)率占1.4%～1.7%。上述結(jié)果證明RNA-Seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好。

表3 飼糧賴氨酸水平對(duì)1～6周齡貴州黃雞平均日采食量的影響

表4 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表5 6個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)結(jié)果

2.3 基因表達(dá)的定量分析

通過(guò)盒形圖展示6個(gè)樣品基因表達(dá)水平的分布情況。結(jié)果表明，每個(gè)樣品的基因表達(dá)量最大值均大于14，上四分位在4～5，中位數(shù)接近4，下四分位在1～2，最小值為0；即6個(gè)樣品的基因表達(dá)量趨于一致(圖1-A)。此外，通過(guò)計(jì)算2組樣品內(nèi)或樣品間R2，組內(nèi)樣品R2均在0.90以上(圖1-B)，說(shuō)明2組間表達(dá)模式的相似度較好，證明試驗(yàn)樣品選擇較合理，增加了后續(xù)試驗(yàn)的可靠性。

2.4 差異表達(dá)基因的分析

本研究以|log2(差異倍數(shù))|>0且P<0.05為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到2 006個(gè)差異表達(dá)基因，其中，1 275個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，731個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖2-A)，前20個(gè)差異表達(dá)基的因如表6所示。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，繪制聚類熱圖(圖2-B)，從圖中看出組內(nèi)兩兩樣品基因的表達(dá)量基本趨于一致，說(shuō)明生物學(xué)重復(fù)性較好；2組間樣品則存在差異基因表達(dá)變化，此外，顏色越紅代表基因的表達(dá)量越高，顏色越藍(lán)代表基因的表達(dá)量越低。

FPKM：每千個(gè)堿基的片段每百萬(wàn)片段映射的轉(zhuǎn)錄本 fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped；R2：皮爾遜相關(guān)系數(shù) Pearson correlation coefficient。

圖2 差異表達(dá)基因分析

表6 前20個(gè)差異表達(dá)的基因

續(xù)表6基因IDGene ID基因名稱Gene nameslog2差異倍數(shù)log2FCP值P-valueENSGALG00000005733WNT8B-2.640<0.001ENSGALG00000003193CRABP-Ⅰ-1.902<0.001ENSGALG00000043234HBA1-1.085<0.001ENSGALG00000032452GAS71.765<0.001ENSGALG00000036587LHX4-3.810<0.001ENSGALG00000015141GDA2.721<0.001ENSGALG00000041459DDIT4-1.227<0.001ENSGALG00000033517VSX2-3.630<0.001ENSGALG00000006648SPECC1L1.266<0.001

2.5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋及分類

利用GOseq對(duì)b組與d組的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，由圖3可知，在GO功能注釋中分子功能(molecular function，MF)有27個(gè)，占21%；細(xì)胞組成(cellular component，CC)有38個(gè)，占32%；生物過(guò)程(biological process，BP)有55個(gè)，占47%。差異表達(dá)基因主要在調(diào)節(jié)神經(jīng)過(guò)程、投射神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、負(fù)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程極顯著富集，上述注釋到GO功能中可能與采食行為相關(guān)的有可卡因和安非他明調(diào)控轉(zhuǎn)錄前肽(carcinine transporter prepropeptide，CARTPT)、前阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein，AgRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)4個(gè)候選基因。

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG功能分析

通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析，共富集到139條信號(hào)通路，選取了富集最顯著的前20個(gè)通路，以散點(diǎn)圖形式展示(圖4)。其中，顯著富集的KEGG通路有19條通路，共篩選到磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O，F(xiàn)oxO)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路6條通路可能影響雞的采食量，涉及到166個(gè)差異表達(dá)基因(表7)。其中，KEGG通路富集到神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路上的差異表達(dá)基因最多，共有43個(gè)差異表達(dá)基因。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證篩選RNA-Seq結(jié)果

選取食欲素神經(jīng)肽前體(hypocretin neuropeptide precursor，HCRT)、AgRP、NPY、豬鏈球菌2型(strictosidine synthase 2，SS2)、膽囊收縮素A受體(cholecystokinin A receptor，CCKAR)、CARTPT6個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq表達(dá)量變化模式一致(圖5)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

3 討 論

家禽采食量是控制生產(chǎn)效率的重要因素之一，食物的攝入與動(dòng)物的健康和生產(chǎn)效率密切相關(guān)。下丘腦是家禽采食最重要的部位，可通過(guò)感應(yīng)、整合不同外周組織來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)家禽采食的控制，從而調(diào)節(jié)采食的分子機(jī)制[18]。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多抑制和促進(jìn)采食的食欲神經(jīng)肽，類似的功能也在家禽中得到驗(yàn)證。研究表明，飼糧中適宜賴氨酸水平可顯著提高家禽的生長(zhǎng)速度和采食量[19]。相對(duì)于雛雞，強(qiáng)烈的攝食行為是提高雛雞采食量的前提[20]。在本研究中，飼糧賴氨酸水平由0.7%增加到1.3%，貴州黃雞4個(gè)組的1～6周齡平均日采食量均呈先升后降的趨勢(shì)，尤其是0.9%賴氨酸水平組極顯著高于1.3%賴氨酸水平組，這種差異可能是由于不同賴氨酸水平導(dǎo)致采食量的變化，或者受遺傳因素的影響，說(shuō)明賴氨酸水平過(guò)高或缺乏均會(huì)影響家禽采食量。基于此，本文選取采食量差異極顯著的0.9%賴氨酸水平組(b組)和1.3%賴氨酸水平組(d組)的6周齡貴州黃雞進(jìn)行研究。

regulation of neurogenesis：調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生；neuron projection morphogenesis：投射神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生；positive regulation of synaptic transmission：突觸傳遞正調(diào)控；plasma membrane bounded cell projection morphogenesis：質(zhì)膜的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生投影；cell projection morphogenesis：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生投影；negative regulation of cell development：細(xì)胞發(fā)育的負(fù)調(diào)控；glutamate receptor signaling pathway：谷氨酸受體信號(hào)通路；negative regulation of neurogenesis：負(fù)調(diào)控的神經(jīng)發(fā)生；cell part morphogenesis：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生部分；negative regulation of nervous system development：神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控；postsynaptic specialization：突觸后特化；receptor complex：受體復(fù)合物；inner mitochondrial membrane protein complex：線粒體膜內(nèi)蛋白復(fù)合物；postsynaptic density：突觸后致密物；asymmetric synapse ：不對(duì)稱突觸；neuron to neuron synapse：神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)元突觸；synapse part：突觸部分；respiratory chain complex：呼吸鏈復(fù)合物；plasma membrane receptor complex：質(zhì)膜受體復(fù)合物；respiratory chain：呼吸鏈；GTPase binding：GTP酶結(jié)合區(qū)；small GTPase binding：小GTP酶結(jié)合；Ras GTPase binding：RAS GTP酶的結(jié)合；guanyl-nucleotide exchange factor activity：鳥嘌呤核苷酸交換因子；cation transmembrane transporter activity：陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性；Rab GTPase binding：Rab GTP酶的結(jié)合；Rho guanyl-nucleotide exchange factor activity：RHO鳥嘌呤核苷酸交換因子；dynein intermediate chain binding：動(dòng)力蛋白中間鏈結(jié)合；glutamate receptor activity：谷氨酸受體活性；NADH dehydrogenase activity：NADH脫氫酶活性；MF：分子功能molecular function；BP：生物過(guò)程 biological process；CC：細(xì)胞組成 cellular component。

通過(guò)GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的基因主要富集在投射神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、負(fù)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)肽信號(hào)傳導(dǎo)途徑等生物學(xué)過(guò)程，如AgRP、NPY、POMC、CART等神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)軸突投射得更廣，說(shuō)明差異表達(dá)基因影響著家禽下丘腦對(duì)采食量的控制。有研究表明，下丘腦弓狀核(ARC)中的NPY/AgRP神經(jīng)元共同調(diào)控γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)，這些神經(jīng)元在促進(jìn)采食方面起著重要作用[21]。通過(guò)KEGG通路分析，富集到神經(jīng)活性配體-受體相互作用這條通路的差異表達(dá)基因最多，而脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路是AgRP的關(guān)鍵通路；在這2條通路中篩選到NPY、AgRP、CARTPT、POMC4個(gè)基因可能與不同賴氨酸水平調(diào)控雞的采食量有關(guān)。Li等[22]對(duì)注射外源性脂肪素雛雞的下丘腦進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與采食相關(guān)的差異表達(dá)基因顯著富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，且脂肪素可能通過(guò)POMC/促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)和NPY/AgRP通路來(lái)增加或者抑制采食量。這說(shuō)明該通路對(duì)家禽采食調(diào)控極其重要。Bahry等[23]研究表明，下丘腦注射NPY可降低熱應(yīng)激對(duì)雛雞采食量的影響，從而提高雛雞的采食量。激活A(yù)gRP神經(jīng)元可以快速地誘導(dǎo)小鼠采食和減少能量消耗，最終增加脂肪儲(chǔ)存；反之，抑制饑餓小鼠的AgRP神經(jīng)元活性會(huì)減少采食量[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與d組相比，b組NPY和AgRP基因表達(dá)量顯著表達(dá)上調(diào)，采食量也隨之提高。NPY參與GO功能注釋到神經(jīng)肽信號(hào)途徑和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，AgRP富集到脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路；說(shuō)明適宜賴氨酸水平組可能通過(guò)上調(diào)NPY/AgRP表達(dá)來(lái)促進(jìn)雛雞的攝食量，從而通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路和脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路來(lái)調(diào)控雛雞的采食。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析散點(diǎn)圖(前20個(gè))

表7 可能與采食量相關(guān)差異表達(dá)基因的富集通路

NPY：神經(jīng)肽Y neuropeptide Y；HCRT：食欲素神經(jīng)肽前體 hypocretin neuropeptide precursor；AgRP：刺鼠相關(guān)蛋白 agouti-related protein；CCKAR：膽囊收縮素A受體 cholecystokinin A receptor；CARTPT：可卡因和安非他明調(diào)控轉(zhuǎn)錄前肽 carcinine transporter prepropeptide；SS2：豬鏈球菌2型 strictosidine synthase 2。

CARTPT是CART前肽，CART和POMC屬于一種厭食性神經(jīng)肽，在動(dòng)物的采食和能量平衡調(diào)節(jié)中起著重要的作用[25]。CART可作用于下丘腦和胃腸道來(lái)降低食欲和飼料消化率，抑制采食量[26-27]。CART與POMC神經(jīng)元起相互協(xié)調(diào)作用，其主要在下丘腦ARC中表達(dá)，在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和能量消耗方面發(fā)揮作用[28]。Alamshah等[29]給大鼠灌胃L-苯丙氨酸(L-Phe)后，在1 h內(nèi)大鼠采食量顯著下降，表明氨基酸對(duì)采食量的影響可能與胃腸道飽感激素有關(guān)。在肉雞中，飼糧中賴氨酸水平過(guò)高會(huì)使肉雞的采食量、生長(zhǎng)發(fā)育、腹脂沉積等下降[30]。在本研究中，b組的CARTPT和POMC基因表達(dá)量顯著高于d組，被富集到GO功能中進(jìn)食行為和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，但b組采食量低于d組，表明雛雞食欲的下降可能與CARTPT、POMC基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

mTOR是一種絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶，可參與營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程[31]。陳盼盼[32]發(fā)現(xiàn)FoxO信號(hào)傳導(dǎo)途徑和mTOR信號(hào)通路與蛋白質(zhì)代謝和調(diào)控采食量有關(guān)；且mTOR基因表達(dá)量在飼糧賴氨酸缺乏時(shí)明顯受到抑制，反之，mTOR基因表達(dá)量提高，肌肉發(fā)育不良，說(shuō)明mTOR信號(hào)通路與不同賴氨酸水平有一定關(guān)系。在MAPK信號(hào)通路中，脂聯(lián)素可通過(guò)該通路來(lái)促進(jìn)脂肪酸氧化和葡萄糖的吸收，對(duì)胰島素抑制有改善功能。磷脂酰肌醇信號(hào)通路是一種細(xì)胞跨膜信號(hào)系統(tǒng)，如促食因子是通過(guò)磷脂酰肌醇信號(hào)通路完成對(duì)采食的調(diào)節(jié)[33]。有研究報(bào)道，饑餓素對(duì)采食的調(diào)控是通過(guò)激活磷脂酰肌醇信號(hào)途徑后鈣離子(Ca2+)濃度的升高，從而啟動(dòng)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(rapamycin target protein complex 1，mTORC1)/核糖體S6激酶1(ribosomal S6 kinase 1，S6K1)通路完成[34]。在本試驗(yàn)中，磷脂酰肌醇信號(hào)途徑、FoxO信號(hào)傳導(dǎo)途徑、mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路4條通路都顯著富集，說(shuō)明這些通路可能共同調(diào)控貴州黃雞采食量。

4 結(jié) 論

① 0.7%、0.9%、1.1%賴氨酸水平組1～6周齡平均日采食量極顯著高于1.3%賴氨酸水平組。

② 不同水平賴氨酸可能通過(guò)下丘腦組織NPY、AgRP、CARTPT和POMC等相關(guān)基因的表達(dá)，作用于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路和脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路，以此來(lái)調(diào)控貴州黃雞的采食量。