彭 凱 陳 冰 莫文艷 吳 漢 黃 文

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣州510640)

縮合單寧是廣泛存在于自然界的一類由黃烷-3-醇單體組成的多酚類聚合物，分子質量介于1 000～20 000 u，具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性[1]。長期以來，單寧被視為“抗營養(yǎng)因子”，從而限制了其在畜禽以及水產(chǎn)動物飼料中的研究和應用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，低劑量縮合單寧不僅不影響動物的生長性能和養(yǎng)分表觀消化率，還能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，提高動物健康水平[2]。當前，“替抗”成為動物營養(yǎng)學研究的熱點，縮合單寧為天然植物提取物，具有無污染、無殘留、安全性高的特點，是理想的抗生素替代品，在食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理等方面已得到廣泛的應用。

縮合單寧對動物生長性能和機體健康的作用效果取決于縮合單寧的來源、濃度、化學結構及動物品種等因素[1]。例如，Becker等[3]研究表明，飼料中添加2%白堅樹縮合單寧抑制了草食性和雜食性魚類生長。相似地，飼料中縮合單寧添加量超過10 g/kg則降低了歐洲鱸魚的生長性能[4]。Li等[5]研究表明，飼料中添加30～50 g/kg縮合單寧顯著降低了草魚的生長性能。然而，盧俊姣[6]報道，飼料中添加0.8 g/kg縮合單寧可促進吉富羅非魚生長。Peng等[7-8]研究表明，飼料中添加0.1～1.0 g/kg葡萄籽縮合單寧不影響花鱸的存活率(survival rate，SR)和生長性能。相關文獻就縮合單寧對水產(chǎn)動物體成分的影響的報道也不一致，一部分研究表明縮合單寧不影響魚類體成分[7-8]，另一部分研究表明縮合單寧顯著抑制了脂肪在魚體內(nèi)的沉積[4,9]。盡管縮合單寧對水產(chǎn)動物生長和體成分的作用效果存在差異，但其對水產(chǎn)動物的抗氧化作用效果幾乎一致?？s合單寧具有良好的抗氧化活性，可提高魚類血清和肝臟抗氧化酶活性及基因表達水平[7,10]。

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，俗稱南美白對蝦，是世界三大養(yǎng)殖蝦類之一。凡納濱對蝦在我國蝦類養(yǎng)殖品種中的產(chǎn)量位居第一，2020年我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量突破120萬t，在促進水產(chǎn)養(yǎng)殖提質增效中發(fā)揮巨大作用。當前，僅有極少數(shù)文獻[11-12]報道了單寧對凡納濱對蝦生長和健康的影響，且都集中在水解單寧，還未見縮合單寧對凡納濱對蝦的應用效果研究?？s合單寧與水解單寧屬于不同的單寧種類，其化學結構、分子質量、生物活性及其對動物的作用效果截然不同。本文就縮合單寧對凡納濱對蝦生長性能、體成分、血清生化及抗氧化指標的影響進行研究，旨為縮合單寧的飼料資源開發(fā)及其在凡納濱對蝦等甲殼類水產(chǎn)動物中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕、花生麩、蝦殼粉為蛋白質源，面粉為糖源，魚油和大豆卵磷脂為脂肪源，配制5種等氮等脂飼料，試驗飼料組成及營養(yǎng)水平如表1所示。CT0組為對照組(基礎飼料配方)，在基礎飼料配方基礎上分別添加0.5(CT0.5組)、1.0(CT1組)、2.0(CT2組)和4.0 g/kg DM(CT4組)縮合單寧替代等量纖維素制成試驗組飼料。縮合單寧來源于葡萄籽，其提取和純化步驟參照彭凱[13]的方法，縮合單寧溶于水后添加到飼料中。所有飼料原料過60目標準篩，混合均勻后通過SLX-80型雙螺桿擠壓機制成2.0 mm顆粒飼料，55 ℃烘干后冷卻至室溫，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料中縮合單寧含量的測定步驟參照Terrill等[14]的方法，以葡萄籽純化縮合單寧作為標準品，CT0、CT0.5、CT1、CT2和CT4組飼料中縮合單寧含量實測值分別為0、0.46、1.05、1.93、3.94 g/kg DM。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

續(xù)表1項目 Items組別 GroupsCT0CT0.5CT1CT2CT4縮合單寧 Condensed tannins0.5 1.0 2.0 4.0 合計 Total1 000.0 1 000.0 1 000.0 1 000.0 1 000.0 營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)干物質 Dry matter927923928923922粗蛋白質 Crude protein408407404406408粗脂肪 Crude lipid107105102104108粗灰分 Ash9091929291

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗于廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所水產(chǎn)研究中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。選擇初始體重約為1.38 g的凡納濱對蝦幼苗600尾，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復40尾，以重復為單位隨機分配到15個直徑80 cm、高70 cm、容積為350 L的圓柱形玻璃纖維缸中，分別投喂5種試驗飼料。采取飽食投喂方式，每天投喂3次(08:00、14:00和20:00)，每天記錄飼料投喂量、死亡情況及水質情況，試驗期為56 d。試驗期間采取自然光照，鹽度5‰～6‰，水溫23～26 ℃，溶解氧濃度>5.0 mg/L，氨氮濃度<0.02 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.1 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 樣品采集與分析

試驗結束后，凡納濱對蝦禁食24 h后采樣。統(tǒng)計每缸中對蝦的數(shù)量和總重量，計算存活率、增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長率(specific growth rate，SGR)和飼料系數(shù)(feed coefficient，F(xiàn)C)。每缸隨機取25尾蝦進行采樣，取其中5尾蝦測定體重和體長，解剖取內(nèi)臟，分離肝胰腺并稱重，計算肥滿度(condition factor，CF)和肝體比(hepatosomatic index，HSI)；取其中5尾蝦用于全蝦體成分分析，即水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量測定；取其中5尾蝦測定肌肉氨基酸含量；取其中10尾蝦，從圍心腔采血，室溫下靜置4 h，然后經(jīng)3 500 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃保存，用于血清生化和抗氧化指標測定。

飼料和全蝦營養(yǎng)成分含量參照國標方法檢測，其中水分含量采用105 ℃常壓干燥法(參照GB/T 6435—2014)測定，粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(參照GB/T 6432—2018)測定，粗脂肪含量采用乙醚抽提法(參照GB/T 6432—2006)測定，粗灰分含量采用550 ℃灼燒法(參照GB/T 6438—1992)測定，氨基酸含量采用鹽酸水解法(參照GB/T 18246—2019)測定。血清白蛋白、球蛋白、尿酸、葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇含量以及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性采用日立7600型全自動生化分析儀測定。血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用商業(yè)試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)依照說明書步驟測定。

1.4 指標計算

存活率(%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；
攝食量(g/尾)=攝食飼料總量(g)/
[(初始尾數(shù)+終末尾數(shù))/2]；
增重率(%)=100×[終末體重(g)-
初始體重(g)]/初始體重(g)；
特定生長率(%/d)=100×[ln終末體重(g)-
ln初始體重(g)]/飼養(yǎng)天數(shù)；
飼料系數(shù)=攝食飼料總量(g)/[終末體重(g)-
初始體重(g)]；
肥滿度(g/cm3)=100×體重(g)/體長(cm)3；
肝體比(%)=100×肝臟重(g)/體重(g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序對試驗數(shù)據(jù)進行處理。先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若滿足方差齊性，采用Duncan氏法進行多重比較；若不滿足方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗法進行多重比較。采用多項式比較分析均值的線性和二次方效應，顯著性水平為P<0.05，顯著性趨勢為0.05

2 結 果

2.1 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表2可知，隨著飼料中縮合單寧添加量的增加，凡納濱對蝦的終末體重(P=0.080)、增重率(P=0.075)和特定生長率(P=0.070)線性增加，飼料系數(shù)線性降低(P=0.069)。飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦成活率、攝食量、肥滿度和肝體比無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.2 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦體成分的影響

由表3可知，飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦全蝦水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦體成分的影響(濕重基礎)

2.3 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦肌肉氨基酸含量的影響

由表4可知，飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦肌肉各氨基酸及總氨基酸含量均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦肌肉氨基酸含量的影響(占總氨基酸比例)

2.4 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

由表5可知，飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦血清生化指標無顯著影響(P>0.05)。

2.5 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦血清抗氧化指標的影響

由圖1可知，與CT0組相比，CT0.5～CT2組凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶活性顯著增加(P<0.05)，CT4組凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶活性無顯著變化(P>0.05)；CT0.5組凡納濱對蝦血清過氧化氫酶活性無顯著變化(P>0.05)，CT1和CT2組凡納濱對蝦血清過氧化氫酶活性顯著增加(P<0.05)，CT4組凡納濱對蝦血清過氧化氫酶活性顯著降低(P<0.05)；CT0.5組凡納濱對蝦血清丙二醛含量無顯著變化(P>0.05)，CT1～CT4組凡納濱對蝦血清丙二醛含量顯著下降(P<0.05)。

表5 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

續(xù)表5項目 Items組別 GroupsCT0CT0.5CT1CT2CT4SEMP值 P-value方差分析 ANOVA線性效應Linear effect二次方效應Quadratic effect低密度脂蛋白膽固醇 LDL-C/(mmol/L)0.020.020.030.020.020.000.3690.5410.996高密度脂蛋白膽固醇 HDL-C/(mmol/L)0.530.540.550.510.490.080.9700.6090.684尿素 UN/(mmol/L)1.431.301.271.201.430.120.2820.7200.054葡萄糖 GLU/(mmol/L)4.524.254.595.054.540.330.3840.3430.716

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

以凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶活性為評價指標，得到縮合單寧添加量(x)與凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶活性(y)的一元二次回歸方程為：y=-0.663x2+2.575x+6.495 4，R2=0.989 8(圖2)。經(jīng)計算，飼料中縮合單寧的最適添加量為1.94 g/kg DM。

3 討 論

3.1 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦生長性能的影響

本試驗研究了縮合單寧對凡納濱對蝦生長性能的影響，結果表明，凡納濱對蝦的成活率各組之間無顯著差異，表明飼料中添加0.5～4.0 g/kg DM縮合單寧不影響對蝦的正常生長。飼料中添加縮合單寧趨向于提高凡納濱對蝦的增重率和特定生長率，降低飼料系數(shù)，表明縮合單寧對凡納濱對蝦具有一定的促生長作用。單寧長期以來被視為“抗營養(yǎng)因子”，近年來研究發(fā)現(xiàn)，低劑量單寧能夠促進動物生長，增強機體健康水平，提高生產(chǎn)性能[1]。盧俊姣[6]報道，飼料中添加0.8 g/kg縮合單寧可促進吉富羅非魚生長。郭慧等[11]研究表明，飼料中添加1～3 g/kg水解單寧顯著增加了凡納濱對蝦增重率和特定生長率，從而促進對蝦生長性能。本試驗結果與前人研究結果相似，表明低劑量縮合單寧對對蝦生長更有利，可能歸因于縮合單寧對腸道菌群的有益作用，如縮合單寧可抑制海鱸腸道致病菌鯨桿菌屬(Cetobacterium)生長，減少腸道炎癥。Biagia等[16]報道，飼糧中添加4.5 g/kg栗樹縮合單寧能夠顯著提高斷奶仔豬的飼料效率，提高生長性能，歸因于縮合單寧增加了空腸中乳酸桿菌的數(shù)量。郭慧等[11]報道，飼料中添加1～3 g/kg水解單寧顯著增加了凡納濱對蝦腸道變形菌門、軟壁菌門和厚壁菌門的比例，降低了藍細菌門、放線菌門和擬桿菌門的比例，有利于促進對蝦腸道健康和有益菌群定植。Peng等[17]報道，飼料中添加0.1～0.4 g/kg縮合單寧降低了鱸魚腸道革蘭氏陰性菌Cetobacterium和氣單胞菌屬(Aeromonas)豐度，增加了梭菌屬(Clostridium)和短螺旋體屬(Brevinema)豐度，改善了腸道通透性，有益于鱸魚生長和腸道健康。縮合單寧對凡納濱對蝦的促生長作用及其與腸道菌群的關系有待進一步研究。

圖2 飼料中縮合單寧添加量與凡納濱對蝦血清SOD活性的回歸關系

3.2 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦體成分和肌肉氨基酸含量的影響

體成分是魚類營養(yǎng)學研究的主要內(nèi)容之一，是評價魚類營養(yǎng)及生長狀況的重要指標。本試驗中不同組別之間相似的對蝦體成分和肌肉氨基酸含量說明飼料中添加0.5～4.0 g/kg DM縮合單寧不影響對蝦的全蝦和肌肉營養(yǎng)組成。Peng等[7-8]報道，飼料中添加0.1～1.0 g/kg縮合單寧不會顯著影響花鱸全魚中水分、粗蛋白質、粗脂肪等體成分含量。Przywitowski等[18]報道，飼糧中添加2.35 g/kg蠶豆縮合單寧不會顯著影響火雞的生長性能和肌肉營養(yǎng)成分含量。朱旭楓等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5～2.0 g/kg水解單寧不顯著影響珍珠龍膽石斑魚全魚體成分。Omnes等[4]報道，飼料中添加高達30 g/kg的單寧酸不會顯著影響歐洲鱸魚全魚水分、粗蛋白質和粗灰分含量，但卻顯著降低了全魚粗脂肪含量。相似地，Buyukcapar等[9]研究表明，飼料中添加5～25 g/kg水解單寧顯著抑制了羅非魚的體脂沉積，這歸因于飼料中脂肪表觀消化率的下降。相反，姚靜婷等[19]報道，飼料中添加7.5和12.5 g/kg水解單寧均顯著增加了暗紋東方鲀肌肉粗脂肪含量，降低了肌肉總氨基酸和總必需氨基酸含量。以上研究結果不一致的原因可能歸因于動物品種、單寧類別及其添加量的不同。

3.3 飼料中添加縮合單寧對凡納濱對蝦血清生化和抗氧化指標的影響

血清生化指標通常反映動物的新陳代謝狀況、健康程度及其對營養(yǎng)與環(huán)境因素的適應狀況[20]。本試驗中各組間凡納濱對蝦相似的血清生化指標表明飼料中添加0.5～4.0 g/kg DM縮合單寧不影響對蝦的血液新陳代謝。Peng等[7]報道，飼料中添加0.1～0.4 g/kg縮合單寧不會顯著影響花鱸的血清生化指標，但卻顯著增加了血清總抗氧化能力及過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，提高了花鱸的抗氧化能力。朱旭楓等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1～2 g/kg水解單寧顯著提高了珍珠龍膽石斑魚血清和肝臟中超氧化物歧化酶活性以及肝臟中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶基因表達量。本試驗結果表明，飼料中添加1.0～2.0 g/kg DM縮合單寧顯著增加了對蝦血清過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性，顯著降低了血清丙二醛含量，表明縮合單寧可提高對蝦的抗氧化能力。過氧化氫酶和超氧化物歧化酶是機體抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，如過氧化氫酶通過催化機體內(nèi)過氧化氫分解，在維持過氧化氫體內(nèi)平衡中起著關鍵作用，因此是保護細胞免受氧化損傷的一種非常重要的酶[21]；超氧化物歧化酶存在于有氧呼吸生物體中，將超氧化物轉化為過氧化氫，去除多余的生物活性氧中間體，從而避免氧化損傷等不利條件[22]；丙二醛是機體內(nèi)多不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物，直接反映脂質過氧化水平和內(nèi)源性氧化損傷程度[23]。體內(nèi)和體外研究表明，縮合單寧具有較強的抗氧化活性[21,24]?？s合單寧通過向自由基提供電子而產(chǎn)生更加穩(wěn)定的且危害更小的自由基結構物質，從而達到清除自由基、過氧化氫和一氧化氮的作用效果[25]。值得一提的是，本試驗中當縮合單寧的添加量為4.0 g/kg DM時，對蝦血清過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性顯著下降，可能是因為對蝦機體應對縮合單寧或某種變化的生理反應，值得進一步深入研究。

4 結 論

① 飼料中添加0.5～4.0 g/kg DM縮合單寧不影響凡納濱對蝦的成活率和體成分，但趨向于提高對蝦的增重率和特定生長率，降低飼料系數(shù)，表明縮合單寧對凡納濱對蝦具有一定的促生長作用。

② 飼料中添加0.5～4.0 g/kg DM縮合單寧不影響凡納濱對蝦的血清生化指標，但能夠提高血清過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性，降低血清丙二醛含量，表明飼料中添加縮合單寧可提高凡納濱對蝦的抗氧化能力。

③ 以血清超氧化物歧化酶活性為評價指標，凡納濱對蝦飼料中縮合單寧的最適添加量為1.94 g/kg DM。