盧 猛 胡鳳明 屠 焰 刁其玉

(中國農業(yè)科學院飼料研究所，農業(yè)農村部飼料生物技術重點實驗室，北京100081)

我國是養(yǎng)牛大國，但與養(yǎng)牛強國仍存在一定差距，其中養(yǎng)殖效率低是當前的一大難題。犢牛是后備牛的主力軍，犢牛培育是養(yǎng)牛產業(yè)的關鍵環(huán)節(jié)，這關系到牛群的質量問題和生產水平；犢牛生長發(fā)育和健康狀況的好壞也直接關系到成年牛的優(yōu)劣，進而影響到整個養(yǎng)牛行業(yè)的生產效益[1]。長期以來，抗生素有效保障了動物健康，但因其具有殘留性而備受爭議。隨著生活水平的提高和消費方式的轉變，綠色發(fā)展已深入人心。在全面禁抗的大背景下，植物提取物因具備天然、無殘留、多功能以及無毒副作用等優(yōu)點成為當下研究的熱點。植物提取物中含皂苷、生物堿等多種有效成分，在提高機體的免疫力和保障動物健康方面發(fā)揮著重要作用[2]。皂苷作為一種天然的且有獨特生物學活性的物質，可以顯著提高斷奶仔豬的平均日增重(ADG)，顯著降低料重比(F/G)，同時對斷奶仔豬肝臟和腎臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性具有顯著的提升效果[3]，表明皂苷不僅可以有效提高動物的生長性能，還可以增強機體的抗氧化能力。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在大豆皮飼糧基礎上，飼糧添加三萜皂苷可以提高犢牛干物質采食量(DMI)、ADG和飼料轉化率，表明皂苷在一定程度上可以促進動物生產性能的提高，同時對血清抗氧化和免疫指標沒有不良影響。

中藥白頭翁來源于毛茛科白頭翁屬植物白頭翁的干燥根，具有廣泛的藥理及生物活性，主要表現(xiàn)在抗菌、抗病毒、抗炎、抗瘧疾、抗腫瘤、殺蟲和增強機體免疫力等方面[5]。《傷寒論》記載用白頭翁治熱痢下重，《傷寒蘊要》稱白頭翁為“熱毒下痢紫血鮮血者宜”。前人對白頭翁做了相關的研究，但這些研究都停留在粗提物上，對其中的單體成分研究較少，在犢牛上應用的研究更是鮮有報道。白頭翁皂苷B4是中藥白頭翁中的五環(huán)三萜皂苷類化合物，也是白頭翁中含量最豐富的成分，研究表明，白頭翁皂苷B4具有抗菌、抗炎、抗氧化和增強免疫力等藥理作用[6]。本試驗通過在哺乳期犢牛代乳粉中添加白頭翁皂苷B4，研究其對犢牛生長性能、腹瀉率以及血清激素水平、抗氧化指標和免疫指標的影響，旨在為開發(fā)一種新型的純天然、無毒副作用的飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2020年10月至2021年5月在中國農業(yè)科學院南口中試基地進行。

1.2 試驗設計

白頭翁皂苷B4(含量67.41%)購自南京某生物工程有限公司。本試驗采用單因素試驗設計，按白頭翁皂苷B4不同的添加量分為4個組，4個添加量分別為0(C組)、15(A1組)、30(A2組)和45 mg/d(A3組)。白頭翁皂苷B4在晨飼時加入代乳粉中飼喂。

1.3 試驗動物和飼養(yǎng)管理

試驗選擇60頭健康的新生荷斯坦公犢牛，試驗犢牛在出生后2 h內飼喂足量初乳，隨后運送到試驗基地。試驗期56 d，其中預試期14 d，正試期42 d。犢牛14日齡時按照體重相近的原則隨機分為4個組，每組15頭。試驗期內犢牛單欄飼養(yǎng)，犢牛島定期清理消毒。

將煮沸后冷卻至40～50 ℃的熱水和代乳粉按1∶7比例混合，充分攪拌成乳液，在溫度降為40 ℃左右時飼喂犢牛。代乳粉按犢牛體重的1.2%(干物質基礎)進行飼喂，在30日齡前，每日分為3次(08:00、13:00和18:00)飼喂；30日齡后逐漸轉為每日2次(08:00和17:00)飼喂，隨犢牛體重變化及時調整飼喂量。犢牛在3日齡時開始補飼開食料，每日記錄投喂量和剩料量，自由采食，自由飲水，冬季水溫不低于15 ℃。代乳粉按照國家發(fā)明專利CN 02128844.5進行配制，其營養(yǎng)水平見表1；開食料組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 代乳粉營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4 樣品采集和指標測定

1.4.1 飼糧樣品

每2周采集1次試驗代乳粉和開食料樣品，4 ℃保存。試驗結束后混勻樣品并帶回實驗室，測定樣品中干物質(DM)、粗脂肪(EE)、粗蛋白質(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)和磷(P)含量[7]。

表2 開食料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4.2 生長性能

分別在犢牛14、28、42和56日齡晨飼前進行體重測定，同時測定犢牛體高、體斜長、腰角寬和胸圍指標，并在試驗期結束后分別計算各指標14～56日齡的平均值。每日詳細記錄代乳粉和開食料的飼喂量和剩料量，計算平均日采食量(ADFI)、ADG和F/G。

1.4.3 腹瀉率

每天觀察犢牛的健康狀況并通過四分制法進行糞便評分，糞便評分標準見表3[8]，當糞便評分≥3時計為1個腹瀉日，并根據糞便評分計算腹瀉率。

1.4.4 血清指標

分別于犢牛28和56日齡晨飼后2 h，每組選擇6頭犢牛，頸靜脈采血10 mL，4 000 r/min離心10 min，收集血清分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍保存待測。

采用KHB-1280全自動生化儀測定血清丙二醛(MDA)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、CAT和GSH-Px活性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ST-360酶標儀)測定血清白細胞介素-10(IL-10)、生長激素(GH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)含量。

1.5 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛生長性能的影響

由表4可知，飼糧添加白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛體重和ADFI無顯著影響(P>0.05)，但是A1、A2及A3組犢牛14～56日齡體重的全期增長率在數值上高于C組(P>0.05)，且隨著白頭翁皂苷B4添加量的提高而提高。14～28日齡，A3組的ADG顯著高于C組(P<0.05)，且C、A1、A2和A3組依次遞增；A2和A3組F/G顯著低于C組(P<0.05)，且C、A1、A2和A3組依次遞減。14～56日齡，飼糧添加白頭翁皂苷B4和日齡對F/G有顯著交互作用(P<0.05)。

由表5可知，在試驗全期及各階段，飼糧添加白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛體高、體斜長、腰角寬和胸圍均無顯著影響(P>0.05)。試驗全期，犢牛體高、體斜長和腰角寬隨日齡的增長極顯著增加(P<0.01)，飼糧添加白頭翁皂苷B4和日齡的交互作用對犢牛的體尺指標無顯著影響(P<0.05)。

表3 糞便評分標準

表4 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛生長性能的影響

2.2 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛糞便評分和腹瀉率的影響

由表6可知，與C組相比，A1、A2和A3組哺乳期犢牛糞便評分和腹瀉率顯著降低(P<0.05)，且白頭翁皂苷B4添加量越高，糞便評分和腹瀉率越低；A1、A2和A3組犢牛糞便評分和腹瀉率之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛體尺指標的影響

表6 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛糞便評分和腹瀉率的影響

2.3 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清指標的影響

2.3.1 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清激素水平的影響

從表7可知，28日齡時，A1、A2和A3組哺乳期犢牛血清GH含量顯著高于C組(P<0.05)，A3組顯著高于A1和A2組(P<0.05)，A1和A2組之間差異不顯著(P>0.05)；A3組犢牛血清IGF-Ⅰ含量顯著高于C、A1和A2組(P<0.05)，C、A1和A2組之間差異不顯著(P>0.05)；C、A1、A2和A3組犢牛血清GH和IGF-Ⅰ含量呈依次逐漸升高的趨勢。56日齡時，不同組哺乳期犢牛血清GH含量之間差異不顯著(P>0.05)，A3組犢牛血清IGF-Ⅰ含量有高于C組的趨勢(0.05

表7 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清激素水平的影響

2.3.2 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清抗氧化指標的影響

由表8可知，28日齡時，與C組相比，A1、A2和A3組哺乳期犢牛血清SOD和CAT活性顯著提高(P<0.05)，血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，且隨著白頭翁皂苷B4添加量的提高而提高或降低；A2和A3組犢牛血清GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)。56日齡時，A1、A2和A3組哺乳期犢牛血清SOD活性均高于C組(P>0.05)，其中A3組有顯著高于C組的趨勢(0.050.05)；A3組犢牛血清MDA含量有顯著低于C組的趨勢(0.05

表8 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清抗氧化指標的影響

2.3.3 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清免疫指標的影響

由表9可知，28日齡時，A2、A3組哺乳期犢牛血清IgG和IgM含量顯著高于C組(P<0.05)，A1、A2和A3組依次呈上升趨勢，且A3組血清IgG和IgM含量顯著高于A1組(P<0.05)；A1、A2和A3組血清IgA含量顯著高于C組(P<0.05)，A1、A2和A3組之間差異不顯著(P>0.05)；A1、A2和A3組血清IL-8和TNF-α含量顯著低于C組(P<0.05)，A2和A3組血清IL-6含量顯著低于C組(P<0.05)，且均隨著白頭翁皂苷B4添加量的提高而降低；A1、A2和A3組血清IL-10含量顯著高于C組(P<0.05)，且隨著白頭翁皂苷B4添加量的提高而提高。

56日齡時，各組哺乳期犢牛血清IgG和IgA含量差異不顯著(P>0.05)，C和A3組血清IgM含量顯著高于A1組(P<0.05)；A1、A2組血清IL-6含量有高于A3組的趨勢(0.050.05)；A1、A2和A3組血清IL-8、IL-10和TNF-α含量與C組相比差異不顯著(P>0.05)。

表9 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清免疫指標的影響

3 討 論

3.1 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛生長性能的影響

生長性能是評價動物在某個階段發(fā)育好壞的重要指標，它的高低直接影響動物的發(fā)展?jié)摿Γ仓苯雨P系到養(yǎng)殖者的經濟效益。犢牛體重越大、ADG越高，犢牛的生長潛力越大，帶來的經濟效益也就越多[9]。本試驗結果表明，在整個試驗期內，與對照組(C組)相比，雖然飼糧添加白頭翁皂苷B4對犢牛的平均體重和ADFI在統(tǒng)計學上無顯著影響，然而A2和A3組犢牛的平均體重均高于C組，同時，A1、A2和A3組犢牛14～56日齡的體重增長率也高于C組，且隨著白頭翁皂苷B4添加量的提高而逐漸提高。本試驗結果也表明，飼糧添加白頭翁皂苷B4可以顯著提高14～28日齡犢牛的ADG，顯著降低F/G，表明白頭翁皂苷B4能促進犢牛對營養(yǎng)物質的消化吸收，給機體提供更多的能量，從而促進犢牛生長。Aazami等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊和綿羊飼糧中添加皂苷不能提高DMI、營養(yǎng)物質消化率和生長性能，這與本試驗的結果不一致，這可能與飼糧的組成、皂苷來源以及添加水平有關。張世荃[11]研究表明，在斷奶仔豬飼糧中添加低劑量的白頭翁提取物，在采食量不變的情況下，可以顯著提高ADG和試驗末期體重，顯著提高飼料轉化率，但對ADFI沒有顯著性影響，本試驗結果與之相符。

體尺指標可以準確反映犢牛的生長發(fā)育情況，其中包括體高、體斜長、胸圍和腰角寬等。幼齡階段的犢牛生長發(fā)育以體重和體長為主，其次是胸圍和體高[12]。在本試驗中，與對照組相比，各試驗組犢牛的體高、體斜長、胸圍和腰角寬均無顯著差異，但A1、A2和A3組試驗期的體高、體斜長和胸圍的增長率均高于C組，表明白頭翁皂苷B4未對犢牛的生長發(fā)育產生不良的影響，相反，在一定程度上可以維持犢牛的生長發(fā)育，這為實際生產中提升犢牛生長性能提供了理論參考。

3.2 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛糞便評分和腹瀉率的影響

腹瀉是幼齡動物常見的一種疾病，主要由致病性大腸桿菌引起。體外抑菌試驗表明，白頭翁提取物對大腸桿菌、腸道桿菌和無色桿菌等均具有一定的抑制作用[13]。通過動物試驗也發(fā)現(xiàn)，白頭翁素可以促進小鼠腸黏膜修復因子表皮生長因子受體(EGFR)和轉化生長因子β1(TGFβ1)蛋白的表達[14]，有效降低小鼠腹瀉率。本試驗中，飼糧添加白頭翁皂苷B4顯著降低哺乳期犢牛7～42日齡的糞便評分和腹瀉率，這與上述的結果相一致，其機制可能是白頭翁皂苷B4對致病性大腸桿菌具有較強的抑制作用，提高了機體抗應激能力；也可能是其通過提高犢牛血清免疫球蛋白含量，促進血清抑炎癥因子和抑制促炎癥因子的表達來增強犢牛的免疫力。

3.3 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清指標的影響

3.3.1 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清激素水平的影響

植物提取物中含有多種營養(yǎng)活性物質，其對動物生長發(fā)育的促進作用已被大量研究證實[15-16]。GH由腦垂體腺體分泌的一種蛋白質激素，對動物機體生長發(fā)育具有重要的生理作用[17]；IGF-Ⅰ是一種可以促進動物組織和器官生長發(fā)育的細胞分裂素。GH促進動物的生長發(fā)育主要是通過與肝臟受體結合，誘導肝臟產生IGF-Ⅰ實現(xiàn)。本試驗中，在犢牛代乳粉中添加白頭翁皂苷B4可以顯著提高哺乳期犢牛28日齡血清GH和IGF-Ⅰ含量；56日齡時，白頭翁皂苷B4對犢牛血清GH和IGF-Ⅰ含量無顯著影響，但從數值來看，A1、A2和A3組犢牛血清GH和IGF-Ⅰ含量均高于C組，這與生長性能的表觀指標相一致，表明白頭翁皂苷B4可以刺激垂體分泌IGF-Ⅰ，實現(xiàn)促進犢牛生長發(fā)育的作用。

3.3.2 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清抗氧化指標的影響

動物生長發(fā)育的好壞不僅直接體現(xiàn)在體重、體高和體斜長等表觀指標上，血清指標也可以從側面很好地反映動物的健康狀況，將表觀指標與血清指標結合可以更有利用我們判定植物提取物是否會對動物產生不利的影響。動物體內的自由基的產生與消除處在動態(tài)的平衡中，以此保護機體免受損傷。血清抗氧化系統(tǒng)作為機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在保護機體免受氧化應激造成的損傷具有重要作用。GSH-Px、CAT和SOD是動物體內的主要抗氧化物酶，SOD和GSH-Px在一定程度上可以反映機體消除自由基的能力，CAT在清除自由基的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用；MDA是脂質過氧化物，可以反映機體受自由基攻擊的嚴重程度。白頭翁是一種天然自由基清除劑，在抗氧化方面具有重要的作用。研究表明，飼糧添加25 mg/kg白頭翁皂苷可以顯著提高斷奶仔豬血清總抗氧化能力(T-AOC)，顯著降低血清MDA含量，其原因可能是白頭翁皂苷能夠降低外源刺激對遺傳物質DNA的損傷，中斷自由基的氧化反應，使機體的抗氧化能力增強[18]。He等[19]研究表明，白頭翁皂苷B4可以通過降低順鉑誘導產生的活性氧(ROS)含量，減少8-羥基鳥嘌呤的形成，有效降低對DNA的損傷，提高HEK 293T細胞中谷胱甘肽含量和SOD、CAT活性，增強機體應對氧化應激的能力。以上結果證實白頭翁及其提取物可以通過清除機體內氧自由基，增強機體的抗氧化能力。本試驗結果表明，在哺乳期犢牛代乳粉中添加白頭翁皂苷B4可以極顯著提高28日齡血清SOD、CAT和GSH-Px含量，且與添加量呈正相關；同時，28日齡血清MDA含量也隨白頭翁皂苷B4添加量的提高呈極顯著的降低，這與上述報道一致。56日齡時，飼糧添加白頭翁皂苷B4對犢牛血清抗氧化指標的作用效果低于28日齡，這可能是因為隨著日齡的增長，犢牛的各項機能逐漸發(fā)育成熟，血清中各項指標也趨于穩(wěn)定；還有可能與添加量有關，56日齡時，A3組犢牛血清SOD活性有顯著高于C組的趨勢，血清MDA含量有顯著低于C組的趨勢，血清CAT活性顯著高于C組。從這些指標的變化可以看出，白頭翁皂苷B4在一定程度上可以提高犢牛血清的抗氧化指標水平，增強機體的抗氧化能力，使得機體承受氧化應激刺激的能力增強，從而有效降低腹瀉發(fā)生率。

3.3.3 白頭翁皂苷B4對哺乳期犢牛血清免疫指標的影響

機體在受到外界刺激時，淋巴細胞和巨噬細胞會因刺激而釋放細胞因子，細胞因子和免疫球蛋白以及一些補體蛋白共同組成機體的防御系統(tǒng)。免疫球蛋白、細胞因子和腫瘤壞死因子的含量常常被用作評價動物機體免疫力高低的指標，同時也可以看出植物提取物對動物機體免疫功能的調節(jié)作用[20-21]。血清免疫球蛋白在機體的體液免疫中發(fā)揮著重要作用，可以間接反映動物體抵抗外源刺激和病菌的能力，其主要由IgG、IgA和IgM組成；其中IgG占血清免疫球蛋白總量的75%～80%，是體液免疫主要的抗體來源[22]。本試驗結果表明，在哺乳期犢牛代乳粉中添加白頭翁皂苷B4可以顯著提高28日齡血清IgG、IgA和IgM含量，且血清中免疫球蛋白含量與添加量具有一定的正相關性，這與陳靜等[18]的研究結果相一致，這表明白頭翁皂苷B4可能是通過提高機體內抗體的水平來增強哺乳期犢牛的免疫能力。56日齡時，C組和A3組犢牛血清IgM含量顯著高于A1組，A1、A2和A3組血清IgM含量逐漸升高，C、A1、A2和A3組血清IgA和IgG含量差異不顯著，這與28日齡的結果不完全一致，這可能是因為犢牛隨著日齡的增長機體機能發(fā)育健全的緣故。細胞因子是由多種細胞產生，可以充分反映血清的免疫狀態(tài)[23]，其根據作用的不同，分為促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子，在非特異性免疫調節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，其中IL-6、IL-8和TNF-α為促炎性細胞因子，IL-10為抗炎性細胞因子[24]。白頭翁及其提取物作為一種天然物質，除含有增強機體的抗氧化能力，還可以激活細菌脂多糖刺激巨噬細胞分泌細胞因子，增強機體免疫力，促進生長發(fā)育。Kang等[25]研究了白頭翁皂苷B4對脂多糖誘導的小鼠炎癥反應的治療效果，結果發(fā)現(xiàn)，通過給小鼠腹腔注射50 mg/kg的白頭翁皂苷B4可以有效抑制由脂多糖刺激產生的TNF-α、IL-6和白細胞介素-1β等促炎性細胞因子的表達，成功緩解小鼠的炎癥反應。本試驗結果表明，飼糧添加白頭翁皂苷B4能夠顯著降低哺乳期犢牛28日齡血清IL-6、IL-8和TNF-α含量，顯著提高血清IL-10含量，表明白頭翁皂苷B4具有促進淋巴細胞分泌細胞因子的作用，進而增強犢牛的免疫力。56日齡時，A1和A2組犢牛血清IL-6含量有高于A3組的趨勢，其他各試驗組之間差異不顯著，此結果與生長性能指標、血清激素指標以及血清抗氧化指標的結果具有一致性。機體免疫力顯著增強，抵御外來刺激的能力就增強，機體的腹瀉率也就顯著降低，生長性能即得到顯著提高。綜合以上結果，在犢牛28日齡前，飼糧添加白頭翁皂苷B4可以有效促進犢牛的生長，提高機體的抗氧化能力和免疫能力，降低腹瀉率；但隨著日齡的增長，效果逐漸降低，這可能也與白頭翁皂苷B4的添加量相關，具體的結果還有待進一步的研究。

4 結 論

① 在本試驗條件下，在哺乳期犢牛代乳粉中添加白頭翁皂苷B4可以有效促進機體的生長發(fā)育，增強犢牛的抗氧化和免疫能力，降低腹瀉率。

② 通過對比添加0、15、30和45 mg/d白頭翁皂苷B4對犢牛的影響發(fā)現(xiàn)，作用效果與添加量具有一定的正相關性，以添加量為45 mg/d時效果較佳。