鐘奇祺 黎力之 幸清鳳 郭冬生 張海波* 關(guān)瑋琨*

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜春336000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430000)

納米氧化鋅是通過化學(xué)或者物理的方法使氧化鋅顆粒直徑達(dá)到1～100 nm，由于其量子效應(yīng)、物質(zhì)的局域性、巨大表面積及界面效應(yīng)，其與上皮細(xì)胞接觸位點(diǎn)及與腸絨毛接觸面積也隨之增加，有效增強(qiáng)小腸對(duì)納米氧化鋅吸收利用能力[1]。飼糧添加凹凸棒土負(fù)載納米氧化鋅可提高斷奶仔豬空腸和回腸微生物α多樣性，顯著增加回腸擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等益生菌的豐度，改善腸道環(huán)境[2]。李洪民等[3]研究證實(shí)，斷乳仔豬飼糧中添加凹土納米氧化鋅后，其抗氧化酶活性、抗炎因子含量升高，即仔豬抗氧化能力和免疫功能得到強(qiáng)化。Ramiah等[4]研究表明，在熱應(yīng)激肉雞飼糧添加40和60 mg/kg納米氧化鋅，肉雞血清中皮質(zhì)醇含量下降，緩解其應(yīng)激反應(yīng)的同時(shí)肌肉丙二醛含量下降，抗氧化能力增強(qiáng)，肉品質(zhì)也得到改善。上述研究表明，納米氧化鋅不但具有改善機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高腸道黏膜免疫功能的作用，而且具有改善肉品質(zhì)的功能。

肌內(nèi)脂肪(IMF)是衡量牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其對(duì)肉的風(fēng)味、多汁性及大理石花紋形成存在至關(guān)重要的作用[5]。動(dòng)物IMF沉積是脂肪合成與脂肪分解動(dòng)態(tài)博弈的結(jié)果，受到過氧化物酶增殖激活受體γ(PPARγ)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)等脂肪合成基因，以及脂蛋白脂肪酶(LPL)、激素敏感脂肪酶(HSL)和肉堿轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)等脂肪分解基因的共同影響[6]。目前關(guān)于納米氧化鋅的研究多集中于改善單胃動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高腸道黏膜免疫功能等方面[2-3]，而鮮見關(guān)于納米氧化鋅影響育肥牛背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究納米氧化鋅對(duì)育肥牛生長性能、屠宰性能、血清指標(biāo)及背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為在育肥牛飼糧中合理添加納米氧化鋅提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選擇健康無病、年齡(12～15月齡)相近和體重相近的西雜閹公牛(西門塔爾?！帘镜攸S牛)16頭，隨機(jī)分2組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為1頭牛。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加鋅)，納米氧化鋅組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加80 mg/kg鋅(納米氧化鋅形式)，該添加量在反芻動(dòng)物鋅需要量的最高限量(120 mg/kg)以內(nèi)，符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2625號(hào)規(guī)定《飼料添加劑安全使用規(guī)范》。試驗(yàn)期為60 d。參考我國《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)[7]中400 kg體重、日增重1 kg肉牛營養(yǎng)推薦值設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼糧配方，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。每天清潔欄舍，保持欄內(nèi)衛(wèi)生，日常管理、消毒與防疫按照常規(guī)程序進(jìn)行。每頭試驗(yàn)牛單欄拴養(yǎng)飼喂，喂料時(shí)間為08:00和16:00，自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 生長性能和屠宰性能測(cè)定

記錄試驗(yàn)開始和試驗(yàn)終末測(cè)定全部試驗(yàn)牛體重，根據(jù)測(cè)定的體重計(jì)算出每組試驗(yàn)牛的平均日增重(ADG)，ADG=(末重-初重)/試驗(yàn)天數(shù)。試驗(yàn)期間記錄每頭試驗(yàn)牛每天的精料、粗料實(shí)際飼喂量和剩余量，并收集剩余飼糧于-20 ℃低溫保存，每15 d測(cè)定1次投入飼糧和剩余飼糧中干物質(zhì)含量，用于試驗(yàn)期內(nèi)平均日采食量(ADFI)的測(cè)定。根據(jù)ADFI和ADG計(jì)算出料重比(F/G)，F(xiàn)/G=ADFI/ADG。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定試驗(yàn)牛體重，選擇每組中與平均體重接近的5頭牛進(jìn)行屠宰，參照周光宏等[8]的方法測(cè)定胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度。

1.2.2 血清生化指標(biāo)和激素測(cè)定

于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別采集5頭肉牛的頸靜脈血10 mL，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心15 min，取血清-20 ℃凍存待測(cè)。采用南京建成生物工程研究所試劑盒用Hitachi 7020全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi公司，日本)測(cè)定血清總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、游離脂肪酸含量。血清瘦素、胰島素和胰島樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 背最長肌IMF含量和脂肪代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定

每組選擇接近組內(nèi)平均體重的5頭牛屠宰，采集牛第12～13肋骨背最長肌樣品，于-20 ℃保存，用以IMF含量和脂肪代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定。采用索氏脂肪抽提法測(cè)定背最長肌IMF含量。脂肪代謝關(guān)鍵酶(FAS、ACC、HSL、CPT-1和LPL)活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)分析

采集試驗(yàn)屠宰牛背最長肌肌肉樣品，立即放入液氮罐凍存，隨即保存于-80 ℃超低溫冰箱中。采用Trizol法提取背最長肌樣品總RNA，通過Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考Zhang等[9]和Livak等[10]的方法合成β-肌動(dòng)蛋白、FAS、ACC、HSL、CPT-1、SREBP-1和PPARγ基因的特定引物序列，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法定量計(jì)算目的基因表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢(shì)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能和屠宰性能

納米氧化鋅對(duì)育肥牛生長性能和屠宰性能的影響見表2。與對(duì)照組相比，添加納米氧化鋅對(duì)初重、末重、ADG、ADFI、宰前活重、胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，但顯著提高了ADG(P<0.05)，顯著降低了F/G(P<0.05)。

表2 納米氧化鋅對(duì)育肥牛生長性能和屠宰性能的影響

2.2 血清生化指標(biāo)和激素含量

納米氧化鋅對(duì)育肥牛血清生化指標(biāo)和激素含量的影響見表3。與對(duì)照組相比，添加納米氧化鋅極顯著提高了血清游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖和IGF-Ⅰ含量(P<0.01)，顯著提高了胰島素含量(P<0.05)，極顯著降低了葡萄糖/胰島素比值(P<0.01)，對(duì)瘦素含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 納米氧化鋅對(duì)育肥牛血清生化指標(biāo)和激素含量的影響

2.3 背最長肌IMF含量和脂肪代謝關(guān)鍵酶活性

納米氧化鋅對(duì)育肥牛背最長肌IMF含量和脂肪代謝關(guān)鍵酶活性的影響見表4。與對(duì)照組相比，添加納米氧化鋅顯著提高了背最長肌IMF含量和ACC活性(P<0.05)，極顯著降低了HSL活性(P<0.01)，顯著降低了CPT-1和LPL活性(P<0.05)。

表4 納米氧化鋅對(duì)育肥牛背最長肌IMF含量及脂肪代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4 背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)

納米氧化鋅對(duì)育肥牛背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖1。與對(duì)照組相比，添加納米氧化鋅顯著提高了育肥牛背最長肌SREBP-1、PPARγ、ACC和FAS基因表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了HSL和CPT-1基因表達(dá)量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 納米氧化鋅對(duì)育肥牛生長性能和屠宰性能的影響

在本試驗(yàn)中，飼糧添加納米氧化鋅后，育肥牛ADG升高，與Xia等[11]的研究結(jié)果不同。Xia等[11]研究表明，斷奶仔豬飼糧分別添加600 mg/kg納米氧化鋅和3 000 mg/kg氧化鋅后，ADG均未產(chǎn)生顯著變化。不同研究結(jié)果的差異可能原因有二：一是試驗(yàn)動(dòng)物的體況差異，仔豬早期斷奶仍處于營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率低，腹瀉等疾病頻發(fā)的狀態(tài)，體況更佳的育肥牛ADG呈現(xiàn)上升水平；二是試驗(yàn)動(dòng)物的主要消化吸收方式不同，納米氧化鋅對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物具有改善作用，直接提高了瘤胃對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，同時(shí)強(qiáng)化機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)備功能，而單胃動(dòng)物在攝入納米氧化鋅后在胃酸作用下分解為納米顆粒和Zn2+，經(jīng)腸絨毛進(jìn)入上皮細(xì)胞后間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，本試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)飼糧中添加納米氧化鋅后育肥牛的F/G降低，而對(duì)末重、ADFI和屠宰性能(胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度)均無顯著影響，這與Sun等[12]和Hussan等[13]的研究結(jié)果類似。Sun等[12]研究表明，斷奶仔豬飼糧添加納米氧化鋅28 d后，仔豬F/G降低，且末重和ADFI均無顯著變化。Hussan等[13]試驗(yàn)表明，在肉雞飼糧分別添加2.5、5.0、10.0和20.0 mg/kg納米氧化鋅后，其飼糧轉(zhuǎn)化率顯著提高，而胴體參數(shù)(屠宰率、產(chǎn)肉率及腹脂率等)均未產(chǎn)生顯著變化。這可能是因?yàn)轱暭Z添加納米氧化鋅在不影響動(dòng)物采食量的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)胃腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。綜上所述，達(dá)到同等屠宰水平時(shí)，飼糧添加納米氧化鋅提高育肥牛的ADG，同時(shí)降低其F/G，說明納米氧化鋅能夠提高飼糧轉(zhuǎn)化效率，改善動(dòng)物生長性能。

SREBP-1：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1 sterol regulator element binding protein-1；PPARγ:過氧化物酶增殖激活受體γ proliferator-activated receptor gamma；FAS：脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase；ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl coenzyme A carboxylase；HSL:激素敏感脂肪酶 hormone sensitive lipase；CPT-1：肉堿轉(zhuǎn)移酶-1 carnitine transferase-1。

3.2 納米氧化鋅對(duì)育肥牛血清指標(biāo)的影響

血液(清)游離脂肪酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的含量可直接反映機(jī)體脂肪代謝的活躍程度，在一定范圍內(nèi)上述數(shù)值越大即脂肪合成活動(dòng)愈發(fā)頻繁[14]。本試驗(yàn)中，添加納米氧化鋅后提高育肥牛血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖含量。Fathi等[15]試驗(yàn)表明，肉雞飼糧添加20和40 mg/kg納米氧化鋅后，血清總膽固醇和高密度脂蛋白含量顯著上升，甘油三酯含量呈上升趨勢(shì)；毛俊舟等[16]研究顯示，斷乳仔豬飼糧添加1 000 mg/kg凹土納米氧化鋅后，血清總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量均未產(chǎn)生顯著影響。上述研究與本試驗(yàn)產(chǎn)生差異的原因可能是由于凹土本身對(duì)血液總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白含量無影響，納米氧化鋅分解產(chǎn)生Zn2+形成脂代謝酶類活性中心，促使高密度脂蛋白和低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活躍，增強(qiáng)膽固醇合成酶與甘油三酯合成酶的活性。

胰島素是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要激素之一，具有促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪合成、抑制脂肪組織脂肪酶活性及降低血糖水平的作用[17]。IGF-Ⅰ為生長介素，糖脂代謝過程中可調(diào)控瘦素蛋白表達(dá)，抑制糖原、脂肪分解，促使脂肪沉積[18]。在本試驗(yàn)中，育肥牛飼糧添加納米氧化鋅后，其血清葡萄糖、胰島素和IGF-Ⅰ含量升高，這與Sethy等[19]的研究結(jié)果相一致。這可能是納米氧化鋅改善反芻動(dòng)物瘤胃微生物群后，提高了飼糧轉(zhuǎn)化效率，使血液中游離脂肪酸含量上升，增強(qiáng)了動(dòng)物體內(nèi)糖異生活動(dòng)，升高了血糖水平，刺激胰島素分泌同時(shí)降低脂肪動(dòng)員，促進(jìn)脂肪沉積。綜上可知，飼糧添加納米氧化鋅對(duì)于育肥牛脂質(zhì)代謝具有積極影響。

3.3 納米氧化鋅對(duì)育肥牛背最長肌IMF沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

脂肪酸合成與分解相互平衡制約對(duì)IMF沉積具有決定作用，當(dāng)合成效果強(qiáng)于分解效果時(shí)脂肪酸表現(xiàn)累積，此過程受脂肪合成及分解相關(guān)酶和基因共同調(diào)節(jié)。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加納米氧化鋅提高了育肥牛背最長肌IMF含量。IMF沉積程度直接表現(xiàn)為肉牛大理石紋形成，肉牛飼糧中添加80 mg/kg鋅(蛋氨酸鋅)提高了大理石紋評(píng)分[20]；日本黑牛(閹牛)添加蛋氨酸鋅(400 mg/d，以鋅計(jì))或碳酸鋅(800 mg/d，以鋅計(jì))提高了大理石紋評(píng)分[21]；育肥小公牛飼喂60 mg/kg硫酸鋅或60 mg/kg硫酸鋅+240 mg/kg氧化鋅，有提高大理石紋的趨勢(shì)[22]。這可能是因?yàn)殇\進(jìn)入瘤胃后改善菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)飼糧中脂肪酸的釋放，后經(jīng)消化作用分解為游離脂肪酸，隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟形成甘油三酯沉積，提高IMF合成速率。

首先，脂肪酸合成酶調(diào)控IMF沉積，合成酶活性越強(qiáng)脂肪酸合成代謝越旺盛，即IMF含量提高。FAS是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，結(jié)構(gòu)域分別執(zhí)行縮合、脫水和轉(zhuǎn)移功能，催化脂酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A反應(yīng)合成棕櫚酸酯[23]。ACC為脂肪酸合成的限速酶，催化乙酰輔酶A縮合為丙二酸單酰輔酶A，轉(zhuǎn)變?yōu)殚L鏈脂肪酸合成的必要原料[24]。本研究結(jié)果顯示，育肥牛飼糧添加納米氧化鋅后背最長肌中ACC活性升高，F(xiàn)AS活性表現(xiàn)出升高跡象，說明脂肪合成能力正在被強(qiáng)化。這可能是因?yàn)榧{米氧化鋅有效成分經(jīng)瘤胃微生物作用后，進(jìn)入機(jī)體激活硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)活性，協(xié)同提高FAS和ACC的活性[25]。因此，我們進(jìn)一步對(duì)脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。PPARγ基因正向調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)基因，發(fā)揮其對(duì)脂肪酸合成與釋放的調(diào)控功能[26]。SREBP-1基因密切參與機(jī)體脂代謝，是脂肪酸合成基因ACC和FAS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[27]。本研究中，飼糧添加納米氧化鋅上調(diào)了育肥牛脂肪酸合成相關(guān)基因(SREBP-1、PPARγ、ACC和FAS)的表達(dá)。飼糧中添加2 000 mg/kg包被氧化鋅，可以顯著提高仔豬背最長肌中IMF含量以及ACC、FAS基因表達(dá)量[28]。產(chǎn)生本試驗(yàn)結(jié)果的原因可能是納米氧化鋅中Zn2+由血液循環(huán)進(jìn)入組織器官后，上調(diào)了SCD基因的表達(dá)，導(dǎo)致SREBP-1基因表達(dá)的幾率增加，隨后協(xié)同促進(jìn)PPARγ、ACC和FAS基因的表達(dá)[26]。

其次，IMF沉積與脂肪酸分解酶活性密切相關(guān)。HSL在脂肪動(dòng)員中起決定性作用，是脂肪分解的限速酶，可將甘油三酯分解為游離脂肪酸、甘油二酯和甘油[29]。CPT-1為脂酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體的限速酶，轉(zhuǎn)運(yùn)速率決定了脂肪酸β氧化進(jìn)程[30]。LPL是IMF形成與沉積的標(biāo)志性蛋白，主要催化甘油三酯分解為游離脂肪酸和甘油，從而決定脂肪代謝方向[31]。本研究結(jié)果顯示，添加納米氧化鋅于育肥牛飼糧后，背最長肌HSL、CPT-1和LPL活性下降，說明脂肪酸的分解能力下降，且對(duì)比納米氧化鋅進(jìn)入機(jī)體后脂肪酸合成與分解酶活性，發(fā)現(xiàn)脂肪酸分解酶被抑制的效果強(qiáng)于合成酶被激動(dòng)的效果，這可能是育肥牛背最長肌IMF沉積的主要原因。因此，我們進(jìn)一步對(duì)脂肪酸分解相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。本試驗(yàn)中，飼糧添加納米氧化鋅下調(diào)了脂肪酸分解相關(guān)基因(CPT-1和HSL)的表達(dá)量。飼糧中添加鋅能夠顯著降低斷奶仔豬背最長肌中HSL和CPT-1等脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)[32]。其原因可能是納米氧化鋅在胃腸微生物及消化液作用后對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生作用，上調(diào)SCD基因的表達(dá)，抑制CPT-1和HSL基因的表達(dá)，促進(jìn)IMF沉積[33]。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可增加育肥牛的ADG，降低F/G，提高生長性能。

② 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可提高育肥牛血清中游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖和IGF-Ⅰ含量，增加胰島素含量，降低葡萄糖/胰島素比值，加快膽固醇等類脂物質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)脂肪沉積。

③ 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可提高育肥牛背最長肌IMF含量，上調(diào)SREBP-1、PPARγ、FAS和ACC基因的表達(dá)，下調(diào)HSL和CPT-1基因的表達(dá)，提高ACC活性，降低HSL、CPT-1和LPL活性，促進(jìn)IMF沉積。