李玉琴 李 義 黃 新 趙小博 高鵬翔 王 慧 蔣林樹

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京102206)

解淀粉芽孢桿菌隸屬于芽孢桿菌屬，其作為益生菌使用已有60余年，具有優(yōu)良的抑菌、產(chǎn)酶能力，且使用安全沒有毒副作用，在畜牧業(yè)應(yīng)用中具有提高動物生產(chǎn)性能、改善腸道菌群、增強免疫力等重要作用，作為飼用微生物制劑具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。解淀粉芽孢桿菌可分泌多種抑菌物質(zhì)，如表面活性素、伊枯草菌素等抗菌脂肽類物質(zhì)，抗菌脂肽類物質(zhì)具有顯著的廣譜抑菌活性，對細菌、真菌、病毒、支原體等都具有很好的抑制作用[2]。由解淀粉芽孢桿菌合成的活性較強的蛋白酶、淀粉酶、水解酶、脂肪酶等消化酶，能夠降解木聚糖、果膠等植物性碳水化合物，從而提高飼料的利用率，促進畜禽生長[2]。除了良好的抑菌性，解淀粉芽孢桿菌還具有提高動物生產(chǎn)性能、增強免疫力、降低養(yǎng)殖污染[3]等功能。

研究表明，每2 d灌服1 mL濃度為1×109CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌fsznc-06凍干菌劑可提高金堂黑山羊育肥羊的生長性能、屠宰性能、血清生化和免疫指標以及肌肉發(fā)育基因的相對表達量[4]；每2 d灌服1 mL濃度為1×109CFU/mL的液體益生菌解淀粉芽孢桿菌fsznc-06能促進斷奶金堂黑山羊瘤胃和小腸的發(fā)育，并通過增加有益細菌的豐富度來調(diào)節(jié)微生物群落，減少瘤胃和盲腸中致病菌的數(shù)量，促進營養(yǎng)代謝和提高健康狀況[5]。飼糧中添加1×108CFU/kg的解淀粉芽孢桿菌BaSC06，可通過提高育肥豬腸道消化酶活性、鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT1)和小肽轉(zhuǎn)運蛋白1(PepT1)的表達，顯著改善育肥豬的生長性能、腸道消化吸收功能和黏膜結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、免疫功能和腸道微生物群組成[6]。飼喂肉雞4×106CFU/g解淀粉芽孢桿菌TL，可減少回腸組織中的炎癥反應(yīng)，改善肉雞免疫功能和減少腸道損傷，從而減少由免疫刺激引起的病原體負擔(dān)和能量消耗，提高肉雞對養(yǎng)分的吸收和利用，改善生長性能，實現(xiàn)高生產(chǎn)率[7]。解淀粉芽孢桿菌把飼養(yǎng)環(huán)境中的有機污染物當(dāng)作碳源，能夠有效降解飼養(yǎng)環(huán)境中的污染物質(zhì)，抑制畜舍環(huán)境中某些有害微生物的生長，改善畜禽的飼養(yǎng)環(huán)境，從而降低養(yǎng)殖污染[8]。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌在畜禽生產(chǎn)中表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用效果，具有增強畜禽免疫能力、提高飼料利用率、改善腸道微生態(tài)環(huán)境、降低養(yǎng)殖污染等多種優(yōu)良特性。目前，解淀粉芽孢桿菌在奶牛生產(chǎn)上的研究還未見報道，本研究擬通過研究解淀粉芽孢桿菌對奶牛泌乳性能、乳成分、免疫能力、抗氧化能力的影響，為解淀粉芽孢桿菌在奶牛養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用解淀粉芽孢桿菌粉劑由某公司提供，該菌劑含解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為1×1011CFU/g。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選用30頭胎次(2.5±0.3)、初始體重[(559.2±37.4) kg]、產(chǎn)奶量[(35.16±1.50) kg/d]、泌乳天數(shù)[(99±2) d]相近的中國荷斯坦奶牛，采用隨機分組試驗設(shè)計分成3組，每組10頭。3組奶牛在晨飼前分別口腔投喂0(對照組)、5×109、5×1010CFU/d的解淀粉芽孢桿菌，于2019年5月21日至2019年8月1日進行為期52 d的飼養(yǎng)試驗，其中預(yù)試期10 d，正試期42 d。試驗期間采用全混合日糧(TMR)飼喂，每天3次，分別在07:00、13:00和19:00飼喂，散欄飼養(yǎng)，自由采食，飲水充足。試驗期間使用阿菲金自動擠奶設(shè)備(90°并排平行畜欄結(jié)構(gòu)，阿菲金公司，以色列)對試驗牛每天早、中、晚擠奶3次并記錄每天的產(chǎn)奶量。

1.3 試驗飼糧

動物飼養(yǎng)試驗在奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室延慶基地進行。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 樣品采集與檢測指標

1.4.1 TMR的采集及分析

在整個試驗階段，每周采集1次TMR，-20 ℃保存。在試驗結(jié)束后，將所有TMR樣品混合均勻，取樣測定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和磷(P)含量。使用WPL-125BE型電熱恒溫干燥箱(吳江臺德烘箱電爐制造有限公司)將樣品烘至恒重，測定DM含量(方法編號：930.15，AOAC)[9]。使用SER 148/6型脂肪測定儀(香港嘉盛科技有限公司)測定EE含量(方法編號：945.16，AOAC)[9]。使用KDY-9830型凱氏定氮儀(深圳市科拓電子有限公司)測定CP含量(方法編號：945.16，AOAC)[9]。使用2000i型全自動纖維測定儀(安康科技有限公司，美國)測定ADF和NDF含量。使用SX2-2.5-12A型馬弗爐(上海柏欣儀器設(shè)備廠)測定Ash含量(方法編號：942.05，AOAC)[9]。使用UV752N型分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)，采用比色法測定P含量。使用PinAAcle500型原子吸收光譜分析儀(珀金埃爾默有限公司，美國)測定Ca含量。

1.4.2 奶樣的采集與分析

在正試期最后1 d采集每組試驗牛早、中、晚的奶樣，將早、中、晚奶樣按4∶3∶3的比例混合，保存于加入2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇防腐劑的DHI奶樣采集瓶。樣品及時送至北京奶牛中心，使用乳成分分析儀(MilkoScan 605,Foss Electric,丹麥)進行檢測，檢測指標包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳體細胞數(shù)(SCC)以及乳中尿素氮含量。

1.4.3 血樣的采集與處理

在正試期最后1 d于晨飼后3 h采集每組試驗牛的血液，使用事先標記好的含有分離膠的促凝一次性采血管，通過尾靜脈采集試驗牛的血樣10 mL。血樣室溫靜置32 min后3 000×g離心15 min后獲取血清，血清置于2 mL離心管中并做好標記，-80 ℃冷凍保存，用于血清中生化、抗氧化和免疫指標的檢測。

1.4.4 血清生化指標的測定

按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)的說明書，使用酶標儀(Multiskan FC，賽默飛世爾儀器有限公司)對血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、尿素氮(UN)的含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性進行測定。

1.4.5 血清免疫指標的測定

按照ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)的說明書進行，使用酶標儀對血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)的含量進行測定。

1.4.6 血清抗氧化指標的測定

按照ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)的說明書，使用酶標儀對血清總抗氧化能力(T-AOC)以及過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，試驗結(jié)果表示為平均值和均值標準誤(SEM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌對奶牛泌乳性能及乳成分的影響

由表2可知，與對照組相比，補飼解淀粉芽孢桿菌對產(chǎn)奶量、4%乳脂校正乳產(chǎn)量和乳脂率的影響不顯著(P>0.05)；補飼解淀粉芽孢桿菌對乳糖率的影響不顯著(P>0.05)，但隨著飼喂劑量的增加乳糖率有上升的趨勢，補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌相對于對照組乳糖率上升了2%；補飼5×109和5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌均可以顯著提高乳蛋白率(P<0.05)；補飼解淀粉芽孢桿菌對乳中尿素氮含量、SCC無顯著影響(P>0.05)。

2.2 解淀粉芽孢桿菌對中國荷斯坦奶牛血清生化指標的影響

由表3可知，與對照組相比，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著提高奶牛血清中TP、UA的含量以及ALT的活性(P<0.05)；補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著降低血清中UN的含量(P<0.05)；補飼解淀粉芽孢桿菌對血清中ALB的含量和AST的活性無顯著影響(P>0.05)。

2.3 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中免疫球蛋白含量的影響

由表4中可知，與對照組相比，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著提高奶牛血清中IgA、IgM的含量(P<0.05)，其中IgA含量提高50%，IgM含量提高34%；補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量均無顯著影響(P>0.05)。上述結(jié)果說明，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以通過調(diào)節(jié)奶牛機體免疫球蛋白分泌來影響奶牛的免疫能力。

表2 解淀粉芽孢桿菌對奶牛泌乳性能及乳成分的影響

表3 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清生化指標的影響

表4 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中免疫球蛋白含量的影響

2.4 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中炎性因子含量的影響

由表5可知，與對照組相比，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著提高了奶牛血清中IFN-γ的含量(P<0.05)，對血清中其他炎性因子含量的影響不顯著(P>0.05)；補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著降低了奶牛血清中TNF-α的含量(P<0.05)，對血清中其他炎性因子含量的影響不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果說明解淀粉芽孢桿菌通過影響奶牛機體炎性因子的分泌，增強奶牛的免疫能力。

表5 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中炎性因子含量的影響

2.5 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清抗氧化指標的影響

由表6可知，與對照組相比，補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以提高奶牛血清中T-AOC，但效果不顯著(P<0.05)；補飼5×109、5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清中MDA含量的影響不顯著(P>0.05)，但MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢；補飼5×109、5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌均可顯著提高奶牛血清中GSH-Px的活性(P<0.05)；補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌使奶牛血清中CAT的活性顯著升高(P<0.05)，而補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌則使奶牛血清中CAT的活性顯著降低(P<0.05)。

表6 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清抗氧化指標的影響

3 討 論

3.1 解淀粉芽孢桿菌對奶牛泌乳性能及乳成分的影響

研究表明，在飼糧中單獨添加3種益生菌(釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌)和添加混合益生菌均可顯著提高奶山羊的乳蛋白率、乳脂率和乳糖率，有效改善奶山羊的乳品質(zhì)[10]。本研究中，補飼解淀粉芽孢桿菌雖然對奶牛的產(chǎn)奶量無顯著影響，但補飼5×109和5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌均可以顯著提高乳蛋白率，并有提高乳脂率、4%乳脂校正乳產(chǎn)量的趨勢。乳脂富含多種酶、生長因子及免疫物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值，乳脂率是判斷乳品質(zhì)的重要指標之一[11]。乳脂含有多種必需脂肪酸和脂溶性維生素，由甘油三酯(大于95%)和少量其他脂類合成，甘油三酯主要由脂肪酸合成[12]。脂肪酸的來源主要有2種：一種是瘤胃微生物分解脂類物質(zhì)產(chǎn)生的脂肪酸，另一種是瘤胃微生物酵解碳水化合物產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸[13]。劉程等[14]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌能夠影響泌乳中期奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，提高瘤胃微生物蛋白濃度，改善瘤胃發(fā)酵，進而提高瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的生成。在本試驗中，補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著提高牛乳的乳脂率，可能是因為解淀粉芽孢桿菌通過改善瘤胃微生物的豐富度，影響了揮發(fā)性脂肪酸的生成。Ma等[15]研究表明，血清蛋白和免疫球蛋白是牛乳中乳蛋白形成的2種主要物質(zhì)，免疫球蛋白包括IgG、IgM和IgA 3種成分。在本試驗中，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌提高了奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量，其中IgA的含量提高了50%，IgM的含量提高了34%，補飼5×109和5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌均可以顯著提高乳蛋白率，可能是解淀粉芽孢桿菌顯著提高了血清中IgG、IgM和IgA的含量，從而影響了乳蛋白的合成。乳糖的主要前體物質(zhì)是葡萄糖，在反芻動物中，葡萄糖的主要來源是丙酸的肝臟糖異生，丙酸是通過瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的，是反芻動物肝臟糖異生的主要底物[16]。在本試驗中，補飼解淀粉芽孢桿菌對乳糖率的影響不顯著，可能是因為解淀粉芽孢桿菌對瘤胃內(nèi)丙酸含量無顯著影響，進而沒有影響糖異生生成葡萄糖。

3.2 解淀粉芽孢桿菌對奶牛血清生化指標的影響

血清生化指標在直接反映奶牛生理狀態(tài)、器官功能和營養(yǎng)代謝狀況方面起重要作用[17]。血清中TP含量能夠反映動物的營養(yǎng)狀況和機體的免疫情況[18]。Cecchinato等[19]研究表明，奶牛血清中TP的含量較高時，能夠改善奶牛的健康狀況和提高奶牛的免疫功能。本研究表明，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著提高了奶牛血清中TP的含量，從而提高奶牛的免疫功能，促進奶牛健康生長。血清中UN的含量可反映機體對蛋白質(zhì)的吸收、合成以及分解狀況，是衡量蛋白質(zhì)分解代謝和氨基酸平衡以及診斷疾病的重要指標[20]。Zhang等[21]研究表明，奶牛血清中UN的含量較低時，表明機體蛋白質(zhì)代謝良好。在本研究中，補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著降低了奶牛血清中UN的含量，表明解淀粉芽孢桿菌有助于提高奶牛的蛋白質(zhì)代謝。血清UA含量是反映奶牛氮代謝情況的重要指標，血清ALT活性是評價肝臟損害的重要標志。趙淑敏等[22]研究表明，奶牛血清中UA的含量和ALT的活性降低，有利于氮的沉積及氮利用效率的提高，可減輕肝臟損傷，進而減輕奶牛肝臟的代謝壓力。本研究中，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著提高了奶牛血清中UA的含量和ALT的活性，表明解淀粉芽孢桿菌不利于氮的沉積，降低了氮的利用效率，不利于改善肝臟損傷。

3.3 解淀粉芽孢桿菌對奶牛免疫能力的影響

益生菌芽孢桿菌能刺激機體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機體發(fā)生免疫反應(yīng)，提高機體抗體水平，從而提高機體的免疫能力[23]。免疫球蛋白是具有抗體活性的球蛋白，起著免疫調(diào)節(jié)的作用，主要包括IgA、IgG和IgM[24]。動物機體內(nèi)免疫球蛋白含量的提高可以增強機體的免疫功能[25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加一定水平的益生菌丁酸梭菌和糞腸球菌均能顯著提高仔豬血清IgA、IgG和IgM含量，從而提高仔豬的免疫力。肖宏德等[27]研究表明，在仔豬飼糧中添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌制成的益生菌制劑，可顯著提高仔豬血液中IgG、IgA、IgM含量和特異性抗體水平，提高仔豬非特異性和特異性抗病能力，改善機體的免疫能力。在本試驗中，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌提高了奶牛血清中IgA、IgG、IgM的含量，說明解淀粉芽孢桿菌可以通過調(diào)節(jié)機體免疫球蛋白的分泌來增強奶牛的免疫能力。

TNF-α是一種強有力的促炎細胞因子，在自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫抑制作用[28]。IL-1β是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)，具有促炎功能，炎癥小體信號通路活化促使IL-1β過度分泌并導(dǎo)致炎癥疾病的發(fā)生[29]。TNF-α、IL-1β均會對機體免疫應(yīng)答造成負面影響[30]。研究表明，1×109CFU/kg的枯草芽孢桿菌能夠顯著降低TNF-α、IL-1β的表達量，抑制嗜水氣單胞菌引起的炎癥反應(yīng)，提高機體的免疫能力[31]。解淀粉芽孢桿菌TL106能夠減輕大腸桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)，降低促炎因子TNF-α、IL-1β的含量，通過減輕炎癥反應(yīng)來改善機體的免疫能力[32]。本研究結(jié)果表明，補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著降低了奶牛血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的含量，提高了奶牛的免疫能力。IL-2由活化的T細胞產(chǎn)生，參與淋巴細胞的穩(wěn)定過程，IL-2可促進T細胞增殖和發(fā)育，提高機體的免疫耐受能力[33]。IFN-γ是T淋巴細胞亞群CD4+T、CD8+T和NK細胞分泌的細胞因子，通過對巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)的活化作用來調(diào)節(jié)機體的免疫功能[34]。研究表明，飼糧中添加1×109CFU/g枯草芽孢桿菌可顯著提高斷奶仔豬血清中IL-2和IFN-γ的含量，進而提高仔豬的免疫功能[35]。本研究結(jié)果表明，補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌能顯著提高奶牛血清中IL-2和IFN-γ的含量，進而提高奶牛的免疫能力。

3.4 解淀粉芽孢桿菌對奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

機體的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、CAT和GSH-Px，這些抗氧化酶能夠提高機體的抗氧化能力，保護機體免受氧化應(yīng)激[36]。研究表明，益生菌表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，并減輕氧化應(yīng)激造成的損害，改善機體抗氧化系統(tǒng)的能力[37]。Dowarah等[38]在仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加乳酸菌后顯著提高了血清中CAT和SOD的活性，提高了機體的抗氧化能力。Jia等[39]在羔羊基礎(chǔ)飼糧中添加地衣芽孢桿菌后顯著升高了血清中SOD和GSH-Px的活性，提高了羔羊的抗氧化能力。付曉政等[40]在奶牛飼糧中添加復(fù)合益生菌后顯著提高了血清中CAT和GSH-Px的活性，提高了奶牛的抗氧化能力。王陽[41]在仔豬飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌后顯著提高了血清中T-AOC、GSH-Px和SOD的活性，改善了機體的抗氧化功能。在本試驗中，補飼解淀粉芽孢桿菌提高了奶牛血清中GSH-Px和CAT的活性，并且提高了奶牛血清的T-AOC，說明飼喂解淀粉芽孢桿菌能夠提高奶牛的抗氧化能力。

4 結(jié) 論

奶牛補飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著提高牛乳中乳蛋白率，并可提高機體的免疫能力；奶牛補飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以顯著提高4%乳脂校正乳產(chǎn)量以及牛乳中乳脂率、乳蛋白率，并可增強機體的抗氧化能力。