胡 婷 張 華 吳 瓊 周 波 盧天航 崔德鳳* 張永紅*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071000；3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京100070)

革蘭氏陰性細(xì)菌主要存在于機(jī)體的腸道內(nèi)，而脂多糖(LPS)則是革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素物質(zhì)。機(jī)體在受到應(yīng)激或者感染時(shí)革蘭氏陰性細(xì)菌大量繁殖，會(huì)破壞腸道屏障，細(xì)菌死亡后，大量LPS進(jìn)入血液，作用于細(xì)胞膜受體[1-2]，激活某些通路，如Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路，通過一系列物質(zhì)的磷酸化，生成核因子-κB (NF-κB)，再誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量促炎因子，導(dǎo)致腸道絨毛脫落，腸道通透性升高，從而使機(jī)體出現(xiàn)代謝紊亂、發(fā)熱等多種炎癥癥狀[3]。研究表明，益生菌通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制TLR4信號(hào)通路的激活，改善腸道屏障功能，降低腸道通透性，進(jìn)而阻止有害物質(zhì)侵入而引起的炎癥反應(yīng)[4-6]。王焱[7]的試驗(yàn)證明，凝結(jié)芽孢桿菌LT3通過調(diào)控炎癥和氧化信號(hào)通路以及腸道菌群對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠盲腸損傷起到保護(hù)作用。凝結(jié)芽孢桿菌作為一種新型益生菌對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸道損傷作用具有一定的改善效果，其具有良好的耐熱性，適合添加在飼糧中[6-7]。而且本課題組同期研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI通過降低腸道黏膜通透性，提高腸道黏膜屏障的保護(hù)作用及吸收功能，降低蛋雛雞料重比，提升其生長性能[8]。因此，本試驗(yàn)使用本實(shí)驗(yàn)室提取并驗(yàn)證后制成的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI菌粉，檢測(cè)其對(duì)30日齡蛋雛雞灌服2 mg/kg LPS 200 μL 6 h后的腸道黏膜通透性及TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，旨在探究凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI調(diào)控LPS損傷腸道的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI菌粉由北京農(nóng)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提取并驗(yàn)證后制備[8]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取1日齡京紅蛋雛雞180只，隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只，重復(fù)之間體重接近?？瞻讓?duì)照組(CON組)和模型組(LPS組)飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平同本課題組同期試驗(yàn)[8])，連續(xù)灌服生理鹽水，3個(gè)益生菌組飼喂基礎(chǔ)飼糧，同時(shí)分別連續(xù)灌服低、中、高劑量的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI(濃度分別為106、107、108CFU/mL)，灌服28 d，28 d后灌服LPS，灌服濃度為2 mg/kg，灌服劑量為200 μL/只，試驗(yàn)周期為6 h，分別記為LOW+LPS、MID+LPS、HIGH+LPS組。蛋雛雞自由采食，充分飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.3 樣品采集

采集蛋雛雞的十二指腸、空腸和回腸腸道組織，每段約5 cm，用于測(cè)定腸道組織結(jié)構(gòu)。用1 mL針管對(duì)蛋雛雞進(jìn)行心臟采血，采血量3～4 mL，室溫放置至少0.5 h，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)移到1.5 mL滅菌的EP管中，用于測(cè)定血清二胺氧化酶(DAO)活性及D-乳酸(D-Lac)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。采集約5 cm的蛋雛雞空腸縱向剖開，用0.9%生理鹽水緩慢沖去食糜，避免將腸絨毛沖掉，用消毒后的無齒鑷沿同一方向輕輕刮取黏膜，裝入EP管中，包上錫箔紙，放入-80 ℃保存，用于測(cè)定空腸黏膜黏液蛋白2(MUC2)和緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量及TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因與蛋白表達(dá)量。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 腸道組織結(jié)構(gòu)

采集的腸道組織用清水稍微清洗一下，放入4%多聚甲醛固定24 h，制備組織切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，用熒光顯微鏡觀察且測(cè)量不同腸道的絨毛長度與隱窩深度，計(jì)算腸道絨隱比。

1.4.2 血清DAO活性及D-Lac、TNF-α含量

用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法測(cè)定血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，試驗(yàn)按照說明書操作。

1.4.3 空腸黏膜MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定空腸黏膜中MUC2、閉合蛋白(Occludin)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)步驟以及引物序列信息等參考本課題組同期研究[8]。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 空腸黏膜SIgA和IL-10含量

采用ELISA的方法測(cè)定空腸黏膜中SIgA和IL-10的含量，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，試驗(yàn)按照說明書操作。

1.4.5 空腸黏膜TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因與蛋白表達(dá)量

分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot的方法測(cè)定蛋雛雞空腸黏膜TLR4信號(hào)通路中TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量。試驗(yàn)步驟以及引物序列信息等參考本課題組同期研究[8]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用t檢驗(yàn)(t-test)分析差異顯著性，P>0.05為無顯著差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞腸道結(jié)構(gòu)的作用

LPS組蛋雛雞灌胃LPS 6 h后出現(xiàn)食欲不振、腹瀉等臨床癥狀，益生菌組未出現(xiàn)明顯腹瀉。

由表1可知，LPS組十二指腸絨毛長度顯著低于CON組(P<0.05)，而回腸的隱窩深度則顯著高于CON組(P<0.05)，與CON組相比，各腸道絨隱比顯著降低(P<0.05)，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著提高十二指腸的絨隱比(P<0.01)；與LPS組相比，飼喂不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均提高腸道的絨毛長度，降低隱窩深度，其中高劑量效果顯著(P<0.05)，中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著提高各腸道的絨隱比(P<0.01)。

表1 蛋雛雞腸道絨毛長度、隱窩深度及絨隱比

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量的影響

由表2可知，與CON組相比，LPS組的血清DAO活性極顯著增加(P<0.01)，D-Lac和TNF-α含量顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，3個(gè)劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均極顯著降低血清DAO活性(P<0.01)，顯著降低血清TNF-α含量(P<0.05)；中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI顯著降低血清D-Lac含量(P<0.05)，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著降低血清D-Lac含量(P<0.01)。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞空腸黏膜MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知，與CON組相比，LPS組的空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，低、高劑量+LPS組的空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，中劑量+LPS組空腸黏膜MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，空腸黏膜ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，低、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表2 蛋雛雞血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量

與CON組相比，“*”為P<0.05；“**”為P<0.01；與LPS組相比，“#”為P<0.05；“##”為P<0.01。下圖同。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞空腸黏膜SIgA和IL-10含量的影響

由表3可知，與CON組相比，LPS能夠極顯著提高空腸黏膜SIgA含量(P<0.01)，顯著提高空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI也能極顯著提高空腸黏膜中SIgA含量(P<0.01)，顯著提高空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)，但與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)蛋雛雞空腸黏膜TLR4/NF-κB信號(hào)通路的作用

由圖2、圖3可知，與CON組相比，LPS組蛋雛雞空腸黏膜中TLR4和NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量和NF-κB的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；不同劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)空腸黏膜TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量會(huì)有不同程度的抑制作用，尤其是中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI抑制作用極顯著(P<0.01)，甚至與CON組也出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞腸道組織形態(tài)的影響

LPS能使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生異常生理行為，且影響其正常的飲食消化。其腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)決定吸收能力，絨毛長度代表吸收面積，隱窩深度反映上皮細(xì)胞的增殖和成熟情況[9-10]，而二者的比值更能體現(xiàn)小腸功能的強(qiáng)弱，比值越大，黏膜功能越強(qiáng)，比值越小，消化吸收功能越受限，黏膜損傷越嚴(yán)重[11]。凝結(jié)芽孢桿菌能改善LPS作用后的腸道損傷。本試驗(yàn)的結(jié)果也表明，LPS作用后，蛋雛雞腸道絨隱比降低，說明蛋雛雞腸道受到損傷，而飼喂凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI的蛋雛雞會(huì)改善這種損傷現(xiàn)象。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞空腸MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

腸黏膜屏障作為機(jī)體抵抗外界刺激的第1道關(guān)卡，其完整性對(duì)于維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)尤為重要[12]，其中黏液蛋白和緊密連接蛋白是維護(hù)上皮細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)腸道屏障完整性的重要物質(zhì)[13]。研究表明，LPS能破壞腸黏膜上皮緊密連接完整性，損傷腸黏膜，增加腸道通透性，導(dǎo)致LPS以細(xì)胞旁作用穿過腸道屏障進(jìn)入腸內(nèi)，引起促炎細(xì)胞因子大量分泌，加劇腸道炎癥[14]。Wu等[12]在細(xì)胞上的研究表明，用LPS刺激IPEC-J2后，Occludin、緊密連接蛋白-1(Claudin-1)和ZO-1基因表達(dá)會(huì)下調(diào)。益生菌對(duì)于腸道屏障功能的改善具有良好效果，它通過增加黏液蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)來加強(qiáng)腸道結(jié)構(gòu)完整性，提高腸道黏膜保護(hù)作用，降低炎癥發(fā)病率。在一項(xiàng)研究中，VSL#3(8種不同的革蘭氏陽性菌組成的凍干粉)能顯著增加Wistar大鼠結(jié)腸炎模型中結(jié)腸黏液蛋白分泌，主要是MUC2 mRNA的表達(dá)，但是對(duì)黏液蛋白1 (MUC1)和黏液蛋白3(MUC3)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用并不明顯[15]。宋曉珍[16]的試驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合益生菌能顯著提高炎癥性腸病小鼠模型下小鼠結(jié)腸組織中Occludin的基因表達(dá)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與CON組相比，LPS組MUC2和緊密連接蛋白(Occludin和ZO-1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低；與LPS組相比，中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能顯著提高空腸黏膜Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能顯著提高空腸黏膜MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均能顯著提高空腸黏膜ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，因此，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能通過提高腸道緊密連接能力來增強(qiáng)腸道通透性，減少LPS的損傷作用。

表3 蛋雛雞空腸黏膜中SIgA和IL-10含量

圖2 蛋雛雞空腸黏膜TLR4、NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞血清中DAO活性和D-Lac含量的影響

腸黏膜受損時(shí)，血液DAO活性會(huì)增加[17]。DAO是腸道黏膜中物質(zhì)，只有當(dāng)腸黏膜細(xì)胞損傷，腸道通透性增加時(shí)，才會(huì)進(jìn)入血液，因此，DAO在血清中活性可作為評(píng)價(jià)腸道黏膜完整性的指標(biāo)[18]。雞血清中D-Lac含量與LPS的含量呈正比例變化，也是LPS導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加的標(biāo)志物之一[19]。益生菌通過降低血清DAO活性和D-Lac含量來修復(fù)損傷的腸黏膜，降低腸道通透性，促進(jìn)腸道屏障功能恢復(fù)，維護(hù)腸道健康[20]。江巧麗等[21]試驗(yàn)證明益生菌制劑(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的聯(lián)用)可降低肝硬化患者血清DAO活性以及LPS含量，降低患者腸道黏膜通透性，改善肝功能。本試驗(yàn)中也得出飼喂不同劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能下調(diào)LPS刺激后血清DAO活性和D-Lac的含量，改善腸道損傷的結(jié)論。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對(duì)LPS誘導(dǎo)的蛋雛雞空腸黏膜免疫的作用

當(dāng)LPS作用腸道時(shí)，易產(chǎn)生大量促炎因子，破壞腸道屏障，進(jìn)入血液，其中TNF-α是主要因子，其具有多種生物學(xué)活性，涉及炎癥反應(yīng)[22]。蘭斌等[23]發(fā)現(xiàn)與空白組相比，給白兔耳緣注射0.3 mL/kg的LPS使血清TNF-α含量顯著升高。在LPS誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生的同時(shí)，也會(huì)激活黏膜免疫系統(tǒng)[24]，分泌抗體與抑炎因子。SIgA是腸道黏膜中最豐富的非炎性免疫球蛋白抗體，IL-10則是主要抗炎因子[25]。劉紹瓊[26]的試驗(yàn)通過飼喂肉雞500 μg/kg BW的LPS激發(fā)免疫應(yīng)激，增加腸道SIgA含量，其中空腸SIgA含量在15 h有顯著增加。也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS作用后腸道SIgA和IL-10含量會(huì)下降，可能的原因是LPS的劑量不同，激發(fā)免疫應(yīng)答的效果也不一樣[27]。益生菌具有加強(qiáng)黏膜免疫作用。石夢(mèng)玄[28]的試驗(yàn)表明，預(yù)先口服雙歧桿菌BAA6能顯著提高結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-10含量，尤其高劑量組(1×1010CFU/mL)效果最佳。本試驗(yàn)LPS灌服后，血清TNF-α、空腸黏膜SIgA和IL-10含量顯著增加，而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能下調(diào)血清TNF-α含量，但對(duì)空腸黏膜SIgA和IL-10的含量增強(qiáng)效果不顯著，從而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI通過增強(qiáng)免疫功能緩解LPS對(duì)腸道的損傷。

圖3 蛋雛雞空腸黏膜TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá)量

3.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI/NF-κB對(duì)LPS誘導(dǎo)蛋雛雞空腸黏膜TLR4信號(hào)通路的作用

LPS是誘導(dǎo)TLR4信號(hào)通路的主要物質(zhì)，其含量的增加能促使TLR4信號(hào)通路活化，產(chǎn)生一系列促炎因子，包括TNF-α、IL-1β等，從而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥。TLR4和NF-κB是LPS作用后發(fā)生變化的主要信號(hào)物質(zhì)，其中NF-κB是主要調(diào)控炎癥因子釋放的一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序后就會(huì)釋放大量炎癥因子，造成炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[29-30]，因此二者表達(dá)的改變能反映TLR4誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路的變化，從而判斷炎癥發(fā)生程度。益生菌會(huì)抑制此通路基因表達(dá)，從而減少促炎因子產(chǎn)生，降低炎癥發(fā)生率。郝雅蓉等[31]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定TLR4和NF-κB的mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS處理的肉雞其肝臟中的TLR4/NF-κB的信號(hào)通路表現(xiàn)出較強(qiáng)活性，從而產(chǎn)生更多如白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎因子，但益生菌處理過則能明顯抑制這條通路，降低炎癥因子產(chǎn)生的數(shù)量，緩解肝臟炎癥的發(fā)生。本試驗(yàn)中，LPS能顯著上調(diào)蛋雛雞空腸黏膜TLR4和NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI則會(huì)抑制此通路中這2種基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，因此，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)來減少促炎因子的生成，避免炎癥發(fā)生。

4 結(jié) 論

① LPS灌服蛋雛雞后會(huì)導(dǎo)致其腸道黏膜受到損害，提高血清DAO活性及D-Lac、TNF-α含量，同時(shí)會(huì)降低空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，啟動(dòng)腸道黏膜免疫應(yīng)答，激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路。

② 連續(xù)飼喂凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路中TLR4和NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，改善LPS灌服后的腸道損傷，提高蛋雛雞腸道健康。

致謝：

感謝北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院童津津博士對(duì)文稿所提的寶貴意見。