萬曉莉 楊海明 王志躍,2

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009；2.揚州大學農業(yè)科技發(fā)展研究院，揚州225009)

霉菌毒素在農產品生產的各個環(huán)節(jié)普遍存在，嚴重危害食品和飼料安全，威脅人類和動物健康[1]。據聯合國糧農組織資料，每年全世界約有25%的農作物不同程度地受到霉菌毒素污染，由此造成的經濟損失高達數千億美元。黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)屬于二氫呋喃香豆素衍生物，主要是寄生曲霉和黃曲霉的次級代謝產物。AF主要有4種類型，分別為AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1毒性最強，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ級致癌物[2]。周建川等[3]對國內一些省份采集到的1 304個飼料及原料樣品調查發(fā)現，玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類及全價料中AFB1的檢出率在66%以上，最高可達97.53%；超標率平均在30%以上，最高可達81.48%。霉菌毒素很難被消除，盡可能降低其對人類和動物健康的危害，是生產的需要也是研究的熱點。

目前，處理霉變飼料通常采用的方法是霉菌毒素吸附劑，然而吸附劑類產品可能對飼料中營養(yǎng)物質也存在一定的吸附作用，從而影響飼料營養(yǎng)價值[4]。從動物自身對霉菌毒素的代謝和解毒過程入手，從生理調控的角度增強機體抗應激能力來緩解霉菌毒素的危害，也是動物生產中處理霉菌毒素的有效方法[5-6]。AFB1是肝毒性化學物質，在細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶的作用下活化為AFB1環(huán)氧化物而誘發(fā)癌癥、產生血液毒性等；同時，產生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)中間產物，誘導氧化應激和線粒體功能紊亂，也是AFB1發(fā)揮毒性作用的重要途徑[7]。近年來，國內外學者對AFB1誘導的動物氧化損傷以及從抗氧化防御的角度緩解AFB1的毒性作用方面開展了諸多研究。本文對AFB1誘導的氧化損傷及不同生物活性物質的抗氧化防御機制做一綜述，以期為動物生產中AFB1污染的防控提供參考。

1 AFB1誘導動物氧化應激的機制

1.1 AFB1誘導ROS的產生，消耗還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，進而造成機體氧化應激

AFB1的代謝主要在肝臟進行，在微粒體細胞色素 P450(CYP450)酶(主要包括CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4)催化的Ⅰ相反應中形成AFB1-8,9-環(huán)氧化物(AFB1-8,9-epoxides，AFBO)，同時產生ROS中間產物。因此，AFB1能夠誘導ROS的蓄積而造成氧化應激[8-9]，增加組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、4-羥壬烯醛、蛋白質羰基和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)等氧化損傷產物的含量[7]。在Ⅱ相解毒反應中，在谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GST)的作用下，AFB1環(huán)氧化物與GSH結合形成AFB1-GSH結合物，這一過程是主要的解毒途徑，同時減少了細胞內GSH的含量[10]。GSH是衡量機體氧化還原狀態(tài)的重要指標，在谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)的作用下，機體內的GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)保持平衡。Yilmaz等[11]研究發(fā)現，大鼠口服AFB1[0.5 mg/(kg BW·d) 7 d或1.5 mg/(kg BW·d) 3 d]可使腎臟和心臟組織中GSH-Px的活性下降并消耗GSH。因此，AFB1在代謝過程中誘導ROS的產生，在Ⅱ相解毒反應中消耗GSH，進而誘導機體氧化應激。

1.2 AFB1通過影響線粒體ROS穩(wěn)態(tài)誘導線粒體氧化應激

線粒體是細胞內發(fā)生氧化磷酸化、合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)提供能量的細胞器，同時也是細胞內產生ROS的主要場所，當ROS的平衡被擾亂發(fā)生氧化應激時，線粒體首先受到破壞[12]。研究表明，AFB1應激狀態(tài)下ROS穩(wěn)態(tài)和抗氧化防御系統(tǒng)失調，引起氧化應激，造成DNA和線粒體損傷，誘導細胞凋亡[13]。1或2 μmol/L的AFB1可使肉雞原代肝細胞線粒體氧化磷酸化過程解偶聯，線粒體膜電位下降，ROS大量產生，抗氧化酶活性降低，細胞凋亡，抗氧化酶相關基因mRNA表達水平下降[14]。肉雞(0.2 mg/kg BW)和肉鴨(0.1 mg/kg BW)攝入AFB1會造成肝臟線粒體抗氧化酶活性下降、MDA含量升高，線粒體腫脹、嵴結構被破壞、膜通透性增加[15-16]。Huang等[17]報道，0.375～1.500 mg/kg BW的AFB1灌胃降低了小鼠睪丸中ATP水平，降低了線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)復合物Ⅰ～Ⅳ的活性；下調了小鼠睪丸中線粒體生物發(fā)生基因，如過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子1α、核呼吸因子1和線粒體轉錄因子A的mRNA表達水平。因此，AFB1通過在代謝過程中產生ROS中間產物影響線粒體ROS穩(wěn)態(tài)，破壞氧化還原平衡狀態(tài)，誘導線粒體氧化損傷和功能紊亂。

1.3 核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)介導的Ⅱ相解毒和抗氧化系統(tǒng)與AFB1的關系

Nrf2是機體解毒和抗氧化防御系統(tǒng)的重要轉錄因子，通過調控抗氧化酶、抗炎因子、解毒酶等基因的表達而發(fā)揮緩解應激的作用[18-20]。Nrf2靶基因對線粒體結構完整性、ROS的產生、ATP合成等功能發(fā)揮重要的調節(jié)作用[21]。Kovac等[22]研究表明，Kelch樣環(huán)氧氯丙胺相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-Nrf2信號通路通過線粒體和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶調控ROS的產生，從而對細胞內氧化還原平衡起重要的調節(jié)作用。分離線粒體和細胞培養(yǎng)試驗證明，Nrf2缺失導致線粒體脂肪酸氧化、呼吸鏈功能和ATP合成功能障礙[23]。在非誘導狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結合成非活性復合物；Keap1含有5個活性半胱氨酸殘基，在誘導狀態(tài)下，誘導物與其中任何一個半胱氨酸巰基發(fā)生反應即可使Nrf2與Keap1分離，然后Nrf2進入細胞核與抗氧化反應元件結合，進而誘導GST、醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1]、GR、GSH-Px、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達以及GSH的合成[18-19]。Thimmulappa等[24]應用微陣列試驗技術研究發(fā)現，Nrf2選擇性優(yōu)先調控的基因有環(huán)氧化物水解酶、黃曲霉毒素醛還原酶和GST等。Taguchi等[25]研究發(fā)現，Nrf2敲除的大鼠肝臟解毒酶活性下調，對AFB1的敏感性增強。Ilic等[26]研究表明，GSTA3敲除小鼠對AFB1的毒性作用更敏感。由此可見，Nrf2介導的Ⅱ相解毒和抗氧化系統(tǒng)以及對線粒體結構和功能的調控可對AFB1解毒發(fā)揮重要作用。

因此，AFB1在動物體內誘導氧化應激的機制主要是在代謝過程中產生ROS，造成組織形態(tài)結構損傷和功能紊亂，同時破壞機體的酶類和非酶類抗氧化防御系統(tǒng)。

2 生物活性物質對AFB1誘導的氧化應激的抗氧化防御機制

2.1 天然植物及其提取物

天然植物及其提取物因其含有的生物活性物質而具有多種生理調節(jié)作用，在霉菌毒素誘導的氧化應激中也發(fā)揮了良好的抗氧化防御功能。近年來，國內外學者研究發(fā)現，姜黃素、白藜蘆醇、番茄紅素、槲皮素、根皮素、表沒食子兒茶素、沒食子酸酯、葡萄籽原花青素、傘序臭黃荊乙醇提取物等天然植物及其提取物能夠緩解AFB1誘導的動物氧化損傷。天然植物及其提取物的抗氧化活性主要是能夠清除自由基，通過抑制Ⅰ相反應酶的活性提高Nrf2介導的Ⅱ相解毒和抗氧化防御系統(tǒng)的功能緩解AFB1誘導的氧化應激。不同的天然植物及其提取物對AFB1誘導的動物氧化損傷的緩解作用見表1。

表1 天然植物及其提取物對AFB1誘導的動物氧化損傷的緩解作用

續(xù)表1名稱Names動物AnimalsAFB1劑量AFB1 dose作用Functions參考文獻References番茄紅素 Lycopene小鼠0.75 mg/kg BW降低肝臟中AFB1-DNA加合物、H2O2、MDA和GSSG的含量,提高SOD、CAT和GST的活性以及GSH含量和GSH/GSSG比值,提高Nrf2和Nrf2靶向基因(包括GST同工酶、GSH合成相關酶和抗氧化酶)的表達水平[35]番茄紅素 Lycopene人肝細胞33 μg/mL細胞培養(yǎng)液提高肝細胞線粒體活性[36]槲皮素 Quercetin人肝細胞小鼠10 μmol/L細胞培養(yǎng)液0.75 mg/kg BW抑制ROS的產生,降低細胞毒性,提高GSH含量降低血清乳酸脫氫酶活性,提高肝臟GSH含量和SOD活性,降低肝臟和腎臟的脂質過氧化水平[37]槲皮素 Quercetin大鼠5、10 μmol/L細胞培養(yǎng)液增強肝細胞中SOD和GST的活性,提高Nrf2和HO-1基因的表達水平,降低MDA和ROS的含量[38]槲皮素 Quercetin牛375 nmol/L細胞培養(yǎng)液上調牛乳腺上皮細胞GSTA1的mRNA表達水平,提高GSH的含量 [39]根皮素 Phloretin小鼠50 μmol/L細胞培養(yǎng)液提高GST的活性,誘導GST同工酶mRNA的表達,提高GSH的含量[40]表沒食子兒茶素沒食子酸酯 EGCG大鼠2 mg/kg BW降低血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性和MDA含量,提高肝臟組織中GSH含量、CAT和SOD活性[41]葡萄籽原花青素 Grape seed proanthocyanidin肉雞1 mg/kg飼糧降低MDA含量,提高T-SOD、CAT、GSH-Px、GST和GR的活性以及GSH的含量,增加Nrf2及其下游基因HO-1、GSH-Px1、NQO1和GCLC的mRNA和蛋白表達水平,并改善線粒體功能[42-44]傘序臭黃荊葉乙醇提取物 Ethanol extract of Premna integrifolia leaves 小鼠0.1 mg/kg BW提高肝臟中GSH的含量和抗氧化酶CAT和SOD的活性,降低MDA的含量[45]

2.2 微量元素

硒和鋅是2種研究較多的微量元素，有研究表明，硒和鋅對AFB1誘導的氧化應激和其他不良反應具有保護作用[6]。硒和鋅是機體酶類和非酶類抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，可以調節(jié)抗氧化酶基因的表達，是潛在的抗氧化劑，對人和動物的各種生理功能具有調節(jié)作用，能夠有效緩解AFB1誘導的氧化應激。Liao等[46]研究發(fā)現，灌胃0.1 mg/kg BW AFB1通過干擾組織酶活性和促進細胞凋亡而導致雛鴨肝臟功能障礙，但硒能夠保護肝臟組織免受AFB1誘導的氧化損傷。飼糧添加硒能夠降低線粒體膜通透性，提高線粒體抗氧化酶和ETC復合物Ⅰ～Ⅳ的活性，改善線粒體結構，從而提高AFB1(0.1 mg/kg BW)暴露的雛鴨肝臟抗氧化能力和線粒體功能[16,47]。硒對AFB1(0.3 mg/kg飼糧)引起的肉雞脾臟抗氧化酶活性降低和MDA含量升高具有抑制作用[48]。在含有100 μg/kg的AFB1肉雞飼糧中添加硒，提高了GSH-Px、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，Txnrd)和CAT的活性以及GSH的含量，降低了MDA、8-OHdG和AFBO-DNA的含量，對CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4的活性及其mRNA的表達水平有抑制作用，而且提高了6種硒蛋白基因(GSH-Px3、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、碘甲狀腺原氨酸脫碘酶2和硒蛋白N)的表達水平[49]。硒能夠緩解100 μg/kg AFB1污染飼糧誘導的肉雞肝臟細胞壞死和萎縮、膽管增生以及GSH-Px和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活性降低[50]。富硒酵母通過提高GSH-Px1的mRNA表達水平和總抗氧化能力，緩解飼喂含AFB1飼糧(250 μg/kg)誘導的小鼠肝臟損傷[51]。鋅可以上調過氧化物氧化還原酶1、過氧化物氧化還原酶5和過氧化物氧化還原酶6的蛋白表達水平，緩解10 μg/mL AFB1誘導的人肝細胞氧化應激[52]。

2.3 益生菌

枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌等益生菌能夠調節(jié)動物的生理功能，改善動物健康狀態(tài)，起到緩解AFB1毒性損傷的作用。枯草芽孢桿菌能夠提高采食AFB1污染飼糧(用含70 μg/kg AFB1的玉米代替20%、40%和60%的正常玉米)的蛋雞血清抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性[53]。在AFB1污染的肉雞飼糧[AFB1、AFB2、AFG1和AFG2檢測值分別為(70.7±1.3) μg/kg、(11.0±1.5) μg/kg、(6.5±0.8) μg/kg和(2.0±0.3) μg/kg]中添加枯草芽孢桿菌能夠提高肉雞的生長性能、肉品質和抗氧化能力[54-55]。在AF污染的飼糧[AFB1、AFB2、AFG1和AFG2檢測值分別為(22.44±2.46) μg/kg、(6.69±1.32) μg/kg、(1.65±0.65) μg/kg和0.00 μg/kg]中添加枯草芽孢桿菌顯著提高了鴨血清抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低了肝臟中MDA的含量[56]。在AFB1(450 μg/kg BW)誘導的小鼠肝臟損傷模型中，解淀粉芽孢桿菌能夠降低ROS和MDA的含量，提高SOD、GSH-Px和CAT的活性，從而緩解AFB1誘導的肝臟氧化損傷[57]；在AFB1(450 μg/kg BW)誘導的小鼠腎臟損傷模型中，解淀粉芽孢桿菌能夠降低MDA含量，提高SOD、GSH-Px和CAT活性，提高Nrf2和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的蛋白表達水平，降低Keap1的蛋白表達水平，從而緩解AFB1誘導的腎臟氧化損傷[58]。飲水中添加植物乳桿菌能夠提高飼喂AFB1污染飼糧(低劑量組200 μg/kg和高劑量組2 000 μg/kg)的肉雞血清SOD和GSH-Px活性[59]。

除了天然植物及其提取物、微量元素、益生菌以外，國內外學者在維生素、氨基酸、寡糖、有機酸等對AFB1誘導的動物氧化應激的影響也進行了研究。含維生素C、維生素E、酵母硒等成分的抗氧化復合添加劑與含丁酸鈉、乳酸桿菌、黃芪多糖等成分的腸道健康復合添加劑能夠提高飼喂含280 μg/kg AFB1飼糧的生長肥育豬的血漿SOD活性，降低MDA含量，提高機體抗氧化能力，緩解肝臟氧化損傷[60]。被74 μg/kg AFB1污染的肉雞飼糧中添加α-硫辛酸能夠提高肉雞肝臟T-SOD、GR、GSH-Px活性以及GSH含量，降低MDA含量，下調CYP1A1和CYP2H1 mRNA表達水平，有上調GSTαmRNA表達水平的趨勢[61]。胚蛋注射蛋氨酸能夠提高初生雛雞肝臟、腎臟、胸肌和十二指腸SOD、GSH-Px和CAT的活性以及GSH的含量，降低MDA的含量，提高GSH-Px、GST-α和SOD的mRNA表達水平，降低Bcl-2相關X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-7(Caspase-7)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、P53、CYP1A1和CYP2H1的mRNA表達水平，從而緩解AFB1(每枚胚蛋注射20 μL含36 ng/L AFB1的溶液)誘導的胚胎毒性[62]。三萜烯化合物通過誘導Nrf2介導的Ⅱ相抗氧化基因GSTA2和GSTA5等的表達水平緩解AFB1(25 μg/只)引起的大鼠肝臟損傷[63]。在大鼠急性AFB1(2.0 mg/kg BW)肝臟損傷模型中，用富氫水灌胃可降低肝臟組織中MDA含量，提高GSH含量，有效減輕肝臟損傷[64]。殼寡糖能夠降低大鼠肝細胞內ROS和MDA的含量，增強SOD和GST的活性，提高Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的mRNA表達水平，還可能通過調控CYP450對外源物質的代謝作用、藥物代謝CYP450和P53信號通路緩解AFB1(0.4～250.0 μmol/L)引起的大鼠肝臟細胞毒性損傷[65]。?；撬嵬ㄟ^提高SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量，降低MDA含量，提高Nrf2信號通路關鍵因子Nrf2、NQO1、HO-1、谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)、GSH-Px和SOD的mRNA表達水平，對AFB1(250 μg/kg BW)誘導的大鼠肝臟、腎臟和脾臟損傷具有保護作用，并通過提高肝臟線粒體膜電位、線粒體解偶聯蛋白2、肉毒堿棕櫚酰轉移酶1、細胞色素C氧化酶、NADPH細胞色素C還原酶的含量或活性保護線粒體的結構與功能[66]。油酸通過提高HO-1的表達水平、降低ROS含量對AFB1(5～20 μg/mL)引發(fā)的人肝細胞損傷具有保護作用[67]。

3 小 結

綜上所述，AFB1在代謝過程中產生ROS，并通過影響線粒體ROS穩(wěn)態(tài)和氧化還原平衡狀態(tài)，引起線粒體氧化損傷和功能紊亂，進而造成機體氧化應激。外源生物活性物質能夠通過調控Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的活性，改善線粒體功能，緩解AFB1誘導的氧化應激，其作用機制與核轉錄因子Nrf2介導的解毒和抗氧化防御系統(tǒng)有關(圖1)。天然植物及其提取物、微量元素、益生菌等是具有抗氧化作用的生物活性物質，在動物生產中緩解霉菌毒素對動物造成的毒性損傷具有重要的應用價值。但此類研究多集中于單一的生物活性物質，對不同生物活性物質聯合使用的研究較少。另外，結合物理、化學、生物等不同的霉菌毒素脫毒方法，開發(fā)兼具脫毒與解毒的經濟、有效的新產品，有望在飼料霉菌毒素的防控工作中成為新的可行的研究方向。

AFB1：黃曲霉毒素B1 aflatoxin B1；AFBO：AFB1-8,9-環(huán)氧化物 AFB1-8,9-epoxides；CAT：過氧化氫酶 catalase；CYP450：細胞色素P450 cytochrome P450；GCL：谷胱甘肽半胱氨酸連接酶 glutamylcysteine ligase；GSH：還原型谷胱甘肽 reduced glutathione；GST：谷胱甘肽硫轉移酶 glutathione S-transferase；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶 glutathione peroxidase；HO-1：血紅素加氧酶-1 heme oxygenase-1；NQO1：醌氧化還原酶1 NAD(P)H quinone oxidoreductase 1；ROS：活性氧自由基 reactive oxygen species；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase。