史啟今， 姜 丹， 周 娜， 王瀟晗， 劉春生

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488)

細(xì)辛為馬兜鈴科細(xì)辛屬植物，主要包括北細(xì)辛[AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.](以下簡(jiǎn)稱為A.heterotropoldes)、漢城細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai)和華細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq.)，其干燥根和根莖具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲等功效[1]。其中北細(xì)辛質(zhì)量最優(yōu)，為市場(chǎng)的主流品種[2]。藥用植物的大部分次生代謝產(chǎn)物具有藥用價(jià)值，是衡量中藥品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[3]，因此關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物含量高的品種在中藥材栽培中備受關(guān)注。植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)生活在健康植物各組織器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)部，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[4]，在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中與宿主植物形成了互惠共生關(guān)系。國(guó)內(nèi)外研究表明，藥用植物內(nèi)生真菌具有提高藥用植物脅迫抗性[5-6]、促進(jìn)宿主對(duì)有機(jī)養(yǎng)分的吸收[7]、促進(jìn)宿主對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收[8]、促進(jìn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累[9-10]等生物學(xué)功能。1996年，Strobel等[11]從西藏紅豆杉中分離出第一株產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌小孢擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)，這一發(fā)現(xiàn)突破了紫杉醇提取受植物資源限制的瓶頸。由于能夠產(chǎn)生有效成分相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生放線菌和內(nèi)生細(xì)菌較少，使得越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注藥用植物內(nèi)生真菌的研究[12]。因此，中藥來(lái)源的內(nèi)生真菌在活性天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)和獲取方面具有重要價(jià)值[13]。藥用植物不同部位內(nèi)生真菌的相關(guān)研究較多。李弘琨[14]對(duì)東北紅豆杉紫杉烷類化合物與內(nèi)生真菌之間的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明內(nèi)生真菌在不同部位紫杉烷差異代謝形成中具有一定作用。竺俊鑫等[15]研究了紅豆杉不同部位在內(nèi)生真菌分離效率以及產(chǎn)紫杉醇菌株篩選率方面的規(guī)律性，結(jié)果表明與莖、葉分離的內(nèi)生真菌相比，根部分離產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，無(wú)論菌株數(shù)量還是紫杉醇含量均具有明顯優(yōu)勢(shì)?？梢?jiàn)內(nèi)生真菌與中藥植物次生代謝產(chǎn)物的分布有著密切聯(lián)系，而北細(xì)辛內(nèi)生真菌的研究相對(duì)較少，主要集中在化學(xué)成分[16-17]、藥理作用[16-17]、品質(zhì)鑒別[18]、栽培管理[19-20]、組織培養(yǎng)等方面[21]，對(duì)其分離菌種多樣性的研究更是鮮有報(bào)道。細(xì)辛提取液對(duì)大腸埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均有明顯的抑制作用[22]，而細(xì)辛內(nèi)生真菌的抑菌活性研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)北細(xì)辛不同部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離、鑒定，分析其群落多樣性，并評(píng)估抑菌活性。以期為北細(xì)辛內(nèi)生真菌的資源利用和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)細(xì)辛藥材質(zhì)量的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 5年生北細(xì)辛于2020年4月采自遼寧省撫順市清原滿族自治縣高家溝，挖取后移栽至實(shí)驗(yàn)專用花盆中進(jìn)行常規(guī)培育，選取未傷及根部植株作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授依據(jù)其外部形態(tài)鑒定為北細(xì)辛(Asarumheterotropoldes)。

1.1.2 抗菌活性供試菌株 大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)均為北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院分子生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：取200 g去皮的土豆切成約1 cm3小塊，加入去離子水煮沸30 min；8層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入瓊脂18 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。②LB液體培養(yǎng)基：在450 mL去離子水中分別加入氯化鈉5 g、酵母提取物2.5 g和胰蛋白胨5 g，去離子水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器(LS-B35，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D，江蘇蘇州蘇潔凈化設(shè)備廠)；立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司)；混合冷凍球磨儀(MM400，RETSCH，德國(guó))；水平電泳槽(JY-SP3，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc 2000，BIO-RAD，美國(guó))；光學(xué)顯微鏡(XSP-44X.9，上海光學(xué)儀器一廠)；梯度PCR儀(Veriti 96，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 先去除新鮮北細(xì)辛植株根部的大塊泥沙，再用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗植物材料1 h以上，然后用手術(shù)剪將處理后的北細(xì)辛不同部位分離，最后用濾紙吸干水分，備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌分離純化與保存 在超凈工作臺(tái)中，用0.1%升汞和75%乙醇對(duì)北細(xì)辛地下部分進(jìn)行表面消毒。表面消毒方法：先用0.1%升汞消毒12 min，無(wú)菌水漂洗3～5次(約2 min)；再用75%乙醇消毒45 ～ 60 s，無(wú)菌水漂洗5 min；最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。將根切成長(zhǎng)約0.5 cm的組織塊，根狀莖切成約0.3 cm3的組織塊，越冬芽切成約0.2 cm3的組織塊，并將組織塊表面輕輕劃傷，置于PDA培養(yǎng)基平皿中，每皿3～ 5塊。采用組織印跡法和漂洗液檢測(cè)法作為對(duì)照處理[23]，以驗(yàn)證表面消毒是否徹底。將接種組織塊的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)3～7 d。采用菌絲尖端純化法，挑取組織塊表面新生的菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基中，反復(fù)分離純化直至形成單一菌落。采用PDA斜面試管和甘油凍存法進(jìn)行內(nèi)生真菌保存[24]。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)和顯微學(xué)鑒定 形態(tài)鑒定：觀察并記錄PDA平皿中菌落的直徑、顏色、形態(tài)等宏觀特征。顯微鑒定：在無(wú)菌載玻片中央滴加1滴乳酸酚棉藍(lán)染色液，用解剖針挑取少量菌絲，混勻染色30 s，加入一滴甘油，蓋上蓋玻片并輕輕壓片，光學(xué)顯微鏡下觀察真菌的孢子結(jié)構(gòu)、菌絲特征、有無(wú)橫隔并進(jìn)行拍照。參考《真菌鑒定手冊(cè)》[25]、《中國(guó)真菌志》[26]等，初步鑒定內(nèi)生真菌。

1.2.4 內(nèi)生真菌的分子鑒定 利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取內(nèi)生真菌基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR擴(kuò)增體系：2×EasyTaq? PCR SuperMix (+dye ) 15 μL，DNA模板1 μL，ITS1和ITS4各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(30個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收產(chǎn)物送至擎科生物股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用ContigExpress9.10軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，將拼接序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用軟件MEGA5.0進(jìn)行聚類分析，應(yīng)用鄰接法(Neighbor- joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，kimura 2- parameter model計(jì)算進(jìn)化距離，1 000次重復(fù)檢驗(yàn)發(fā)育樹(shù)的可靠性。

1.2.6 抑菌活性初篩 采用菌餅法進(jìn)行初篩，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)各試驗(yàn)用細(xì)菌菌株菌懸液至OD600 nm=0.6 ～ 0.8，均勻涂布于平板培養(yǎng)基上，并切去直徑大小為6 mm的圓形瓊脂塊，然后在被測(cè)試真菌培養(yǎng)物上切取直徑大小為6 mm的圓形菌餅，填補(bǔ)在已涂布好細(xì)菌菌株的平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 北細(xì)辛內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

統(tǒng)計(jì)每株內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征和菌絲體顯微特征，其中菌株G 3-7-12、G 1-8-1、G 1-97-2、G 4-10-1、G 3-3、G 3-8、G 3-7-3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖1、表1，分離所得菌株在顏色、表面紋飾、菌絲粗細(xì)、孢子形態(tài)等方面差異顯著。

2.2 北細(xì)辛內(nèi)生真菌的分子鑒定

利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)rDNA ITS的測(cè)序拼接結(jié)果，下載相似度最高的菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析親緣和進(jìn)化關(guān)系，部分菌株的分子鑒定結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。G 3-7-3與Ilyonectriarobusta在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為99.81%，G 1-8-1與Aspergillusterreus在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為100%，G 3-17-2與Talaromycesstollii在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為99.32%，G 4-10-1與Aspergillusfumigatus在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為99.83%，G 3-3與Aspergillustransmontanensis在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為99.49%，G 1-97-2與Cladosporiumverrucocladosporioides在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為100%，G 3-8與Sistotremabrinkmannii在同一個(gè)分支內(nèi)，序列相似性為99.84%。

圖1 北細(xì)辛部分內(nèi)生真菌菌落形態(tài)特征及顯微學(xué)觀察Fig.1 Morphological characteristics and microscopic observation of some endophytic fungi in A. heterotropoldesa：菌落正面；b：菌落背面；c：分生孢子梗的顯微特征；d：分生孢子的顯微特征a：Front of colony；b：Back of colony；c：Microscopic characteristics of conidiophores；d:Microcopic chaacteristic of conidia

表1 北細(xì)辛部分內(nèi)生真菌菌落形態(tài)特征及顯微學(xué)觀察結(jié)果

圖2 北細(xì)辛部分內(nèi)生真菌與同源菌株的聚類分析Fig.2 Cluster Analysis of some endophytic fungi and homologous strains of A. heterotropoldes黑色加粗字體表示本研究中分離的內(nèi)生真菌編號(hào)The black bold indicates the number of endophytic fungi isolated in this study

表2 北細(xì)辛部分內(nèi)生真菌的同源菌株信息

2.3 北細(xì)辛不同部位內(nèi)生真菌的多樣性分析

本研究從北細(xì)辛的3種不同部位分別取50個(gè)(根)、50個(gè)(根狀莖)、20個(gè)(越冬芽)組織塊，分別分離得到54株、59株和4株內(nèi)生真菌，共計(jì)117株，其中97株歸屬為6綱6目8科9屬17種(表3)。從北細(xì)辛根中分離得到54株內(nèi)生真菌，分別歸屬為9個(gè)屬，其中土赤殼屬(Ilyonectria,31.48%)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次是青霉屬(Penicillium,7.41%)；從根狀莖中分離得到59株內(nèi)生真菌，歸屬為2個(gè)屬，分別是刺盤(pán)孢屬(Colletotrichum,57.63%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma,37.29%)；從越冬芽中分離得到4株內(nèi)生真菌，均歸屬為莖點(diǎn)霉屬。綜合本研究結(jié)果可以得出，刺盤(pán)孢屬(32.48%)為北細(xì)辛內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，其次是莖點(diǎn)霉屬(23.93%)、土赤殼屬(14.53%)；曲霉屬(Aspergillus,2.58%)、Sistotrema(0.85%)、木霉屬(Trichoderma,0.85%)、枝孢屬(Gladaxporism,0.85%)和鐮孢屬(Fusarium,0.85%)內(nèi)生真菌均為稀有菌屬，結(jié)果分別見(jiàn)表4、圖3。

表3 北細(xì)辛不同部位內(nèi)生真菌的分類結(jié)果

表4 北細(xì)辛不同部位內(nèi)生真菌的相對(duì)頻率

圖3 北細(xì)辛不同部位內(nèi)生真菌(屬)的比例Fig.3 The proportion of endophytic fungi (genera) in different parts of A. heterotropoldes

在北細(xì)辛根部分離9種特有菌株Sistotremabrinkmannii、Trichodermascalesiae、Talaromycesfuniculosus、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、Cladosporiumverrucocladosporioides、強(qiáng)壯土赤殼(Ilyonectriarobusta)、土曲霉(Aspergillusterreus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、Aspergillustransmontanensis；在根狀莖中分離3種特有菌株P(guān)araboeremiaselaginellae、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)；在越冬芽中分離1種特有菌株P(guān)araboeremiaputaminum(圖4)。多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表5，IR用于衡量3個(gè)不同部位北細(xì)辛內(nèi)生真菌的豐富度和每個(gè)組織塊受多重侵染的頻率，3個(gè)不同部位北細(xì)辛內(nèi)生真菌的分離率為108%(根)、118%(根狀莖)和20%(越冬芽)；多樣性指數(shù)H′用于比較3種不同部位北細(xì)辛內(nèi)生真菌的物種多樣性程度，其中根部?jī)?nèi)生真菌的多樣性指數(shù)最高，多樣性指數(shù)為1.80，根狀莖次之，多樣性指數(shù)為1.54，越冬芽最低，多樣性指數(shù)為0.56；Cs用于比較3種不同部位北細(xì)辛內(nèi)生真菌種類的相似程度，其中根和根狀莖內(nèi)生真菌的種類相似度最高，Cs為0.31，根和越冬芽?jī)?nèi)生真菌的Cs為0.14，根狀莖和越冬芽?jī)?nèi)生真菌的Cs為0.22。

圖4 北細(xì)辛不同部位內(nèi)生真菌菌種的Venn圖Fig.4 Venn diagram of endophytic fungi in different parts of A. heterotropoldes

表5 北細(xì)辛不同部位中內(nèi)生真菌的多樣性

2.4 抑菌活性初篩

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)6株真菌均有一定的潛在抑菌活性。其中G 3-3、G 4-10-1、G 2-2-1、GZJ 2-12-2均對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，GZJ 2-12-2對(duì)大腸埃希菌有抑制作用，G 3-3、G 2-2-1、GZJ 2-12-2、GZJ 1-6、G 3-8對(duì)枯草芽胞桿菌有抑制作用。GZJ 2-12-2對(duì)三種細(xì)菌均有抑制作用(表6、圖5)。

表6 北細(xì)辛內(nèi)生真菌對(duì)三種指示菌的抑菌圈直徑

圖5 部分內(nèi)生真菌對(duì)三種細(xì)菌的抑制作用Fig.5 The inhibiting effects of partial endophytic fungi on three types of bacteriaA～C:對(duì)枯草芽胞桿菌的抑制作用；D、E:對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；F:對(duì)大腸埃希菌的抑制作用；a:G 2-2-1；b:G 3-3；c:GZJ 1-6；d:GZJ 2-12-2；e:G 3-8；f:G 4-10-1A-C: the inhibiting effects on Bacillus subtilis；D,E: the inhibiting effects on Staphylococcus aureus；F: the inhibiting effects on Escherichia coli；a:G 2-2-1；b:G 3-3；c:GZJ 1-6；d:GZJ 2-12-2；e:G 3-8；f:G 4-10-1

3 討 論

本研究共獲得117株北細(xì)辛內(nèi)生真菌，其中97株歸屬于6綱6目8科9屬17種，莖點(diǎn)霉屬為3個(gè)部位內(nèi)生真菌共有屬。北細(xì)辛不同部位可培養(yǎng)內(nèi)生真菌具有多樣性，根、根狀莖、越冬芽三個(gè)部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、組成及種群間存在差異，其刺盤(pán)孢屬是北細(xì)辛內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，在根狀莖和根中均有分布。包麗霞等[27]曾對(duì)四川和陜西產(chǎn)地的北細(xì)辛內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行研究，分離出的內(nèi)生真菌歸屬于小叢殼屬2株、鐮孢屬2株、刺盤(pán)孢屬1株，這與本研究結(jié)果相似。本研究在北細(xì)辛中分離出的Sistotrema、木霉屬、青霉屬、土赤殼屬、莖點(diǎn)霉屬、曲霉屬內(nèi)生真菌均為首次在中國(guó)地區(qū)北細(xì)辛中分離得到。這可能是藥用植物內(nèi)生真菌具有地域分布差異性導(dǎo)致的[28]，本研究試驗(yàn)材料采自北細(xì)辛道地產(chǎn)區(qū)遼寧省撫順市，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)細(xì)辛藥材質(zhì)量的影響提供新的思路，也為藥用植物內(nèi)生微生物的資源利用和開(kāi)發(fā)提供參考。

目前，抗菌活性是內(nèi)生真菌及其活性代謝物研究中被挖掘較多的一個(gè)方面，研究人員通過(guò)大量的體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，約30%的內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物具有抗菌活性[29]。近年來(lái)，化學(xué)類抗菌藥物的過(guò)度使用和環(huán)境污染等因素導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而影響植物的正常發(fā)育和生長(zhǎng)。從微生物中尋找更綠色、環(huán)保的抗菌藥物和生防菌劑可以有效應(yīng)對(duì)此類問(wèn)題。本研究以三種常見(jiàn)細(xì)菌為供試菌，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)辛提取液的相關(guān)研究結(jié)果[22]與本研究中GZJ 2-12-2的抑菌作用一致，該菌株分離自北細(xì)辛根狀莖，經(jīng)鑒定為莖點(diǎn)霉屬(Paraboeremialitseae)，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌均有抑制作用，由此可見(jiàn)，莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌可能是北細(xì)辛抑制這三種菌的關(guān)鍵內(nèi)生真菌。此外，G 3-3、G 2-2-1、GZJ 2-12-2對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌有抑制作用，G 4-10-1對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，GZJ 1-6、G 3-8對(duì)枯草芽胞桿菌有抑制作用。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為人體的常見(jiàn)致病菌?？莶菅堪麠U菌在植物病害防治等方面展現(xiàn)了優(yōu)良的特性[30]，一般被認(rèn)為是非致病菌，但也有少數(shù)報(bào)道表明對(duì)于惡性腫瘤、艾滋病、免疫功能抑制、粒細(xì)胞減少癥等病癥的患者來(lái)說(shuō)，枯草芽胞桿菌依然具有致病性[31]。對(duì)具有抑菌活性的菌株還有待進(jìn)一步深入研究，以拓寬藥用和生防資源。