劉筱雪 王 一 曾澤彬 李冬兵 周 麗 王洪江 蘭鳳杰 劉學鋒

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學院，四川宜賓 644000)

桑椹菌核病(mulberry fruit sclerotiniosis)，俗稱白果病，是果桑種植區(qū)普遍發(fā)生的一類真菌病害，具有毀滅性危害，嚴重威脅果桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根據(jù)感染桑椹的病原菌不同，又將桑椹菌核病分為桑椹肥大性菌核病(hypertrophy sorosis scleroteniosis)、桑椹縮小性菌核病(reduced sorosis scleroteniosis)和桑椹小粒性菌核病(small particles sorosis scleroteniosis)3種類型[1-3]。其中，桑椹肥大性菌核病的發(fā)病率最高，危害也最為嚴重，發(fā)病率占桑椹菌核病總量的80%以上[2]。目前，已報道的桑椹菌核病病原菌有4種[1-4]，但是較常見的有3種，即引起桑椹肥大性菌核病的桑實杯盤菌(Ciboriashiraiana)，引起桑椹縮小性菌核病的白井地杖菌(Mitrulashiraiana)以及引起桑椹小粒性菌核病的肉阜狀杯盤菌(Ciboriacarunculoides)。

桑椹菌核病的防控方法包括化學、物理、農(nóng)業(yè)等手段。其中，化學防控是目前控制桑椹菌核病的主要手段，生產(chǎn)上常用70%甲基硫菌靈或50%多菌靈進行防控[1]，呂蕊花等[5]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對桑椹菌核病也有良好的防控效果。合理地使用這些藥劑可以有效控制桑椹菌核病的發(fā)生及減輕危害程度。然而，這些藥劑屬于低毒或有毒藥物，對環(huán)境、食品以及人體存在潛在危害，長期使用還會導致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，急需篩選出綠色無污染的高效殺菌劑。近年來，植物精油、脂肪酸、二氧化氯、水楊酸、殼聚糖、草酸鈉、氯化鈣、海藻酸鈉等新型綠色殺(抑)菌劑和植物誘抗劑在食品業(yè)和農(nóng)業(yè)得到廣泛研究和應用[6-13]。由此，本研究選擇了10種綠色低毒藥劑開展桑椹菌核病的防治試驗，旨在篩選出安全、高效的防控藥劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

圖1 DGF1的菌落形態(tài)(A)和子實體(B)

1.1.1 供試菌株 桑椹肥大性菌核病菌株編號DGF1(圖1)，由宜賓市農(nóng)業(yè)科學院蠶桑和食用菌研究實驗室從患病桑椹分離所得。將菌株ITS序列提交到NCBI進行BLAST分析，結(jié)果顯示菌株DGF1與Genbank中Ciboriashiraiana(JF816240.1)的同源相似性高達99%，結(jié)合菌落形態(tài)與分子鑒定，將其鑒定為Ciboriashiraiana。

1.1.2 供試藥劑 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，農(nóng)藥登記證號PD20085037，江蘇龍燈化學有限公司產(chǎn)品；50%多菌靈可濕性粉劑，農(nóng)藥登記證號PD85150-35，四川國光農(nóng)化股份有限公司產(chǎn)品；99%香芹酚、98%百里香酚、99.5%水楊酸，均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；肉桂酸、草酸鈉、氯化鈣、海藻酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；11%脂肪酸乳油，海厄滋生物科技有限公司產(chǎn)品；18%二氧化氯消毒劑(粉劑)，昆明雙玖消毒藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；殼聚糖，生物純，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 E.Z.N.A. Fungal DNA Kit 試劑盒(D3390)，美國OMEGA生物公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑室內(nèi)篩選試驗 藥劑室內(nèi)篩選試驗采用菌絲生長速率法和最小抑制濃度法(minimal inhibitory concentration, MIC)[14]進行。(1)藥劑初篩試驗：分別將脂肪酸等10種綠色低毒藥劑用含0.5%吐溫-80的無菌水配制成終濃度為稀釋1 000倍的藥物平板，以同樣處理的甲基硫菌靈和多菌靈2種傳統(tǒng)化學藥劑為藥物對照，以不加藥物的PDA平板為空白對照，每個培養(yǎng)皿接入培養(yǎng)至對數(shù)期、直徑為8 mm的病原菌菌塊，置于25 ℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3個重復。(2)藥劑梯度試驗：采用同樣的方法進行梯度試驗,分別將藥劑初篩試驗篩選出的脂肪酸等6種綠色低毒藥劑用含0.5%吐溫-80的無菌水配制成終濃度為稀釋500倍、750倍、1 000倍、1 250倍、1 500倍的藥物平板，以同樣處理的甲基硫菌靈和多菌靈2種傳統(tǒng)化學藥劑為藥物對照，以不加藥物的PDA平板為空白對照。根據(jù)公式計算藥劑的相對抑制生長率：菌落凈直徑=菌落直徑-菌絲塊直徑；相對抑制率(%)=[(對照菌落凈直徑-處理菌落凈直徑)/對照菌落凈直徑]×100。

1.2.2 藥劑大田試驗 藥劑大田試驗于2021年2—5月份，在宜賓市農(nóng)業(yè)科學院大觀科研基地開展，果桑品種為粵椹大十，樹齡6年。試驗分別設置脂肪酸、香芹酚以及二氧化氯等的500倍稀釋藥液3個綠色低毒藥劑處理，以70%甲基硫菌靈500倍稀釋藥液(甲基硫菌靈安全性比多菌靈高，且多菌靈正在逐漸被禁用，因此，大田試驗未選用多菌靈)為藥物對照，以噴施清水作空白對照(CK)，每處理設3個重復，每小區(qū)面積60 m2。每小區(qū)選擇有代表性的3株桑樹，每株定點調(diào)查3個枝條，統(tǒng)計每個枝條上桑椹的總數(shù)和病椹數(shù)，計算每株桑樹的發(fā)病率。用危害嚴重度分級法統(tǒng)計病情指數(shù)，共分為0～4級：0級為桑椹全果健康，代表分值為0；1級為桑椹的病小核果占全果面積1/4以下，代表分值為1；2級為桑椹的病小核果占全果面積1/4～1/2，代表分值為3；3級為桑椹的病小核果占全果面積1/2～3/4，代表分值為5；4級為桑椹的病小核果占全果面積3/4以上，代表分值為10。

第1次施藥從?；ǔ蹰_時開始，之后每隔7 d噴藥1次，每次噴霧以滴水為度，直到部分桑椹由青變紅時停止施藥。施藥停止后，每7 d調(diào)查1次，直至病果不再增加即調(diào)查結(jié)束。根據(jù)公式計算發(fā)病率和相對防效：發(fā)病率(%)=(發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查植株總數(shù))×100；病情指數(shù)(%)=[∑(各級病椹數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查病椹總數(shù)×最高級別代表值)]×100；相對防效(%)=[(對照區(qū)發(fā)病率-防治區(qū)發(fā)病率)/對照區(qū)發(fā)病率]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用ANOVA法進行方差分析，并用Duncan’s新復極差法比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性。通過SPSS 22.0軟件分析，取藥劑質(zhì)量濃度為X，抑制率值為Y，得到毒力回歸方程并計算藥物抑制中濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對Ciboria shiraiana的抑制效果

藥劑初篩試驗比較了10種綠色低毒藥劑與2種傳統(tǒng)化學藥劑的1 000倍稀釋藥液對Ciboriashiraiana菌絲生長的作用情況。從表1可以看出，脂肪酸對Ciboriashiraiana的抑制效果最好，相對抑制率達99.21%，與傳統(tǒng)化學藥劑甲基硫菌靈和多菌靈的效果相當。其次為香芹酚，相對抑制率為96.38%。二氧化氯、水楊酸和百里香酚的抑制效果較好，相對抑制率分別為93.23%、90.55%、89.76%。肉桂酸和殼聚糖的抑制效果較差，相對抑制率分別為67.32%和23.15%。草酸鈉、氯化鈣和海藻酸鈉對Ciboriashiraiana沒有抑制效果。

表1 不同藥劑對Ciboria shiraiana的抑制效果

表中不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同藥劑對Ciboria shiraiana的藥物抑制中濃度(EC50)

從表2可以看出，藥劑的抑菌效果與藥物濃度呈正相關(guān)。其中，香芹酚的EC50最低，僅為62 mg/L，說明Ciboriashiraiana對香芹酚表現(xiàn)出較高的敏感性，在較低的濃度下即有較強的抑制效果。里香酚與香芹酚是同分異構(gòu)體，但百里香酚的EC50為382 mg/L，兩者的EC50相差近6倍，說明兩者分子結(jié)構(gòu)的差異(酚羥基位置不同)導致了抑菌效果的不同，而香芹酚的構(gòu)型更有利于對Ciboriashiraiana的抑制作用。肉桂酸的EC50最高，達902 mg/L，說明Ciboriashiraiana對肉桂酸敏感性較低。水楊酸是肉桂酸的衍生物，EC50為475 mg/L，說明Ciboriashiraiana對其敏感性也較低。脂肪酸和二氧化氯的EC50分別為311 mg/L和322 mg/L，與傳統(tǒng)化學藥劑的效果相當。綜上所述，香芹酚、脂肪酸和二氧化氯具有防控桑椹肥大性菌核病的潛力。

表2 不同藥劑對Ciboria shiraiana的藥物抑制中濃度(EC50)

2.3 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控效果

從表3和圖2可以看出，粵椹大十在宜賓的桑椹菌核病發(fā)病高峰期在4月初。大田試驗結(jié)果表明，香芹酚處理的發(fā)病率為3.19%～18.59%，病情指數(shù)為0.95～13.01；二氧化氯處理的發(fā)病率為0.32%～19.29%，病情指數(shù)為0.10～13.09；脂肪酸處理的發(fā)病率為1.41%～12.18%，病情指數(shù)為1.13～8.17；甲基硫菌靈處理的發(fā)病率為0.42%～8.26%，病情指數(shù)為0.12～4.97；空白對照的發(fā)病率為1.47%～19.35%，病情指數(shù)為1.45～13.61。由此可知，在田間環(huán)境下，香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病沒有明顯的防治效果；甲基硫菌靈對桑椹菌核病的防控效果最好，相對防效為41.10%～83.60%；脂肪酸相對于香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病的防控效果較好，相對防效為4.08%～46.93%。

表3 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控情況

圖2 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控效果折線圖

3 討論

桑椹菌核病是果桑產(chǎn)業(yè)面臨的一大難題，該病只能防不能治，具有來勢猛、發(fā)病快的特點，其危害往往是毀滅性的，因此必須加強對桑椹菌核病的防控力度。多菌靈和甲基硫菌靈是桑椹菌核病最常用的防治藥物，其中，多菌靈的殘效期比較長，對哺乳動物有一定的毒害性[15]。目前，多菌靈已在美國禁用，中國及歐盟等多個國家(地區(qū))也在逐步限制其使用；相對于多菌靈，甲基硫菌靈的安全性更高，但其在植物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為多菌靈，其潛在毒性也值得進一步研究[16]。因此，急需篩選出針對桑椹菌核病的安全、高效防控藥物。

植物精油是一類植物源次生代謝物質(zhì)，具有抗菌、防腐、高效、低毒、易降解和對環(huán)境污染小等特點。研究利用植物精油作為化學殺菌劑的替代品用于防治植物病蟲害已成為國內(nèi)外的研究熱點[6,17]。國外已經(jīng)開發(fā)出幾種精油類農(nóng)藥，并被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)認證為一般公認安全(generally recognized as safe，GRAS)。例如，Mycotech公司以肉桂油為原料，以其主要成分肉桂醛為有效成分研制出30%的乳油產(chǎn)品，用作殺蟲、殺螨、殺菌劑。EcoSMART公司推出用于防治植物病蟲害的氣霧劑和粉劑產(chǎn)品，不同產(chǎn)品包含肉桂、百里香、丁香、迷迭香、薄荷油以及2-苯乙基丙酸酯等活性成分。國內(nèi)也逐漸開始重視對植物精油的研究和應用。植物精油作為一種新型的植物源農(nóng)藥，相較于傳統(tǒng)化學藥劑，其對人類和環(huán)境的風險更小，具有潛在的價值和廣闊的市場。

二氧化氯是目前國際上公認的一種安全高效的殺菌劑，被聯(lián)合國衛(wèi)生組織(WHO)列為A1級安全消毒劑，具有無毒、無害、無殘留的特點[18]。國外發(fā)達國家已廣泛將其應用于環(huán)境殺菌消毒、食品行業(yè)、果蔬保鮮以及水質(zhì)凈化等方面，并頒布了相應的法令和法規(guī)[19]。近年來，我國也出臺了關(guān)于二氧化氯在各行業(yè)使用的相關(guān)標準，并大力推廣應用。二氧化氯作為消毒劑也逐步應用于蠶桑產(chǎn)業(yè)，黃旭華等[20]將二氧化氯應用于桑葉表面消毒并取得良好效果。

脂肪酸及其部分衍生物天然存在于許多動植物體內(nèi)，因此天然脂肪酸及其部分衍生物在小劑量下一般無毒無害，也不會對環(huán)境產(chǎn)生任何污染，大部分脂肪酸被美國FDA認證為GRAS。國外對脂肪酸及其衍生物的抑菌作用研究較早，已廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域[21-22]。

隨著社會的發(fā)展，人們越來越關(guān)注食品健康和環(huán)境安全問題。逐步淘汰高毒、高風險的農(nóng)藥，開發(fā)綠色高效的替代產(chǎn)品將成為農(nóng)業(yè)未來的發(fā)展方向。本研究選擇了10種綠色藥劑開展桑椹菌核病的防治試驗，結(jié)果表明，在田間環(huán)境下，香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病沒有防治效果，而脂肪酸對桑椹菌核病的相對防治效果僅為4.08%～46.93%。由此說明，這些新型綠色防控藥劑比傳統(tǒng)化學藥劑相對安全，但尚未達到理想的防效。因此，如何提高新型綠色藥物的防效還有待進一步研究。當前，對桑椹菌核病的防控重點是圍繞病害的發(fā)生規(guī)律采取措施，除了通過藥物殺滅病原菌外，還可從切斷其傳播途徑以及控制環(huán)境等方面入手，通過多種手段協(xié)同控制桑椹菌核病的發(fā)生和減輕危害。