葉子蘭，吳生亮，姜立春，阮期平

(1.綿陽師范學(xué)院 資源環(huán)境工程學(xué)院，四川 綿陽 621000； 2.綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621000)

引 言

苯酚，又名石炭酸，最早是由德國化學(xué)家龍格在煤焦油中發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)已成為一種重要的有機(jī)化工原料，廣泛應(yīng)用于皮革生產(chǎn)、塑料制造、石油煉制和醫(yī)藥合成等工業(yè)。苯酚及其衍生物是一類芳香族化合物，釋放到環(huán)境中對人類健康和動(dòng)植物的生長均會(huì)造成不利影響[1]。隨著我國工業(yè)化進(jìn)程的加快，苯酚的需求和消耗也隨之增加，大量酚類物質(zhì)及其衍生物在土壤和水體中的排放和積累導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境的日趨惡化，許多國家已將其列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的黑名單中[2]。因此，如何去除苯酚及其衍生物，成為了污水處理不可忽視的重要課題。

目前，清除工業(yè)廢水中苯酚的方法有很多[3-4]，微生物降解因其成本低、效率高、無二次污染以及生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]而得到更廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外眾多學(xué)者已經(jīng)分離鑒定了許多不同種類的苯酚降解菌，包括紅球菌屬(Rhodococcussp.)[6]、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)[7]、絲孢酵母菌屬(Trichosporonsp.)[8]、假絲酵母菌屬(Candidasp.)[9]、布魯氏桿菌屬(Brucellasp.)[10]、黏質(zhì)沙雷氏菌屬(Serratiamarcescens)[11]、泛菌屬(Pantoeasp.)[12]、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)[13]、腸桿菌屬(Enterobacter)[14]、沼澤考克氏菌(Kocuriapalustris)[15]、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)[16]、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)[17]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[18～21]和假單胞菌(Pseudomon-assp.)[22～24]等。這些已報(bào)道的苯酚降解菌中，有的菌種對苯酚濃度的耐受度低，有的菌種降解苯酚所需的周期過長，若將這些菌種用于生物法降解苯酚，還需對其做進(jìn)一步的研究，改良特性以提高對苯酚的降解能力。因此，從特殊污染環(huán)境中分離降解能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、應(yīng)用潛力大的菌株，仍然十分必要[25]。本實(shí)驗(yàn)室從綿陽某絕緣材料廠的活性污泥中分離、篩選出菌種Y_1，利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析對其進(jìn)行分類鑒定，考察了該菌株降解苯酚的能力。旨在找到能高效降解苯酚的優(yōu)勢菌株，為今后研究含酚廢水的處理方法奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

菌種來自綿陽某絕緣材料廠的活性污泥中。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、光學(xué)顯微鏡、pH計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及電泳槽、凝膠成像儀、紫外可見分光光度計(jì)。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[26]：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，上述組分溶解后加蒸餾水定容至1L，將pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2。固體培養(yǎng)基則在其原有配方中加入2%的瓊脂。

馴化篩選培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按實(shí)驗(yàn)需要加入相應(yīng)濃度的苯酚。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基[27]：K2HPO40.5g、KH2PO40.5g、NaCl 0.2g、NH4NO31g、MgSO40.2g、CaCl20.2g、FeSO4·7H2O 0.01g、MnSO4·H2O微量，苯酚(按實(shí)驗(yàn)需要加入)，加蒸餾水定容至1 L，將pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚降解菌的馴化、篩選與分離

取10g活性污泥加入100 mL蒸餾水，于30℃、200 r/min的條件下在搖床中充分振蕩半小時(shí)，靜置后取上清液10 mL，加入到100 mL苯酚濃度為100 mg/L的馴化篩選培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)三天[28]。12 000 rpm/min離心10 min,棄上清。用生理鹽水將菌體沉淀洗滌兩次，再加入10 mL無菌水制成菌懸液。按2%的接種量接入苯酚初始濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按200 mg/L的梯度依次提高苯酚濃度，直到最高濃度為1 500 mg/L。淘汰不能利用苯酚的菌株，從而篩選出能降解苯酚且對其耐受能力較強(qiáng)的菌株。經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，將培養(yǎng)液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7七個(gè)梯度稀釋，分別取100 μL涂布于苯酚濃度為500 mg/L的馴化篩選培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)20 h。挑取不同形態(tài)的單菌落接種到富集培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18h。用接種環(huán)取一環(huán)菌液，接種到富集培養(yǎng)基平板上，通過平板劃線法分離得到純菌株。

1.2.2 菌株的初步鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種到固體培養(yǎng)基上，放置在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，肉眼觀察菌落的形狀、大小、隆起度、邊緣透明度與顏色等培養(yǎng)特征。在普通光學(xué)顯微鏡下難以看清細(xì)菌的形狀和結(jié)構(gòu)，因此，需要通過革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色等方法，將菌體染上顏色，從而借助顏色的反差作用觀察菌體形態(tài)。經(jīng)染色后利用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色、形狀、莢膜、芽孢以及鞭毛等菌體形態(tài)。

1.2.2.2 生理生化鑒定

主要選擇了糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖)、溫度生長范圍、pH生長范圍、需氧性試驗(yàn)、硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、明膠水解、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、耐鹽性試驗(yàn)、過氧化氫酶的測定、卵磷脂酶的測定、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、石蕊牛奶反應(yīng)、溶菌酶抗性試驗(yàn)以及在pH 5.7的營養(yǎng)肉湯上的生長等19項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行檢測，具體試驗(yàn)方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》[29]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[30]。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA鑒定

參照文獻(xiàn)[31]提取細(xì)菌總DNA。將細(xì)菌16S rDNA鑒定的通用引物作為上下游引物，以提取的菌株總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13.7 μL，10×Ex Taq buffer 2.0 μL，5u Ex Taq 0.2 μL，2.5mM dNTP Mix 1.6 μL，上游引物(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)1 μL，下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1 μL，DNA模板0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，該步驟循環(huán)25次，最后72℃延伸10 min，于4℃冰箱保存。在進(jìn)行DNA測序之前，檢測PCR是否擴(kuò)增成功。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，用凝膠成像儀檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。利用BLAST軟件，將測得的序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對，通過MEGA6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[32-33]。

1.2.4 生長曲線的測定

細(xì)菌的生長要經(jīng)過遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期四個(gè)階段。在對數(shù)生長期，細(xì)菌生長速率最快，對碳源的利用率也最高。因此，測定菌株的生長曲線，將對數(shù)生長期內(nèi)的菌種制備成種子液，用于苯酚降解實(shí)驗(yàn)。挑取兩個(gè)單菌落接種到富集培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)30 h。以未接種的富集培養(yǎng)基做空白對照，在600 nm波長下，每四小時(shí)測定OD值，以檢測細(xì)菌濃度。為減少誤差，取兩組平行實(shí)驗(yàn)的平均值繪制生長曲線。

1.2.5 菌株的降酚特性

將平板上的單個(gè)菌落接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制成菌懸液。篩選菌株Y_1時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌在苯酚濃度1 100 mg/L時(shí)能良好生長。因此，將菌株在苯酚濃度1 100 mg/L、pH 7.0～7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，以不含苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對照，采用4-氨基安替吡啉直接分光光度法[34]測定苯酚濃度。在相同條件下進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，取三組讀數(shù)的平均值。依據(jù)苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出苯酚的降解率。

苯酚降解率計(jì)算公式：苯酚降解率=(接種前的苯酚濃度-生長消耗剩余的苯酚濃度)/接種前的苯酚濃度×100%

2 結(jié) 果

2.1 苯酚降解菌的馴化、篩選與分離

篩選出4株能以苯酚為唯一碳源生長的菌株，且對苯酚的耐受濃度均能達(dá)到1 500mg/L，分別命名為Y_1、Y_2、Y_3和Y_4。將4株菌在同一條件下培養(yǎng)：苯酚濃度800 mg/L、pH 7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)30 h取樣測定培養(yǎng)基苯酚濃度。4株菌對苯酚的降解情況見圖1。由此可見，菌株Y_1的生長情況和降酚能力優(yōu)于其他菌株。

圖1 4株菌降酚情況Fig.1 Phenol reduction of 4 strains

2.2 菌株的初步鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，菌株Y_1形成的菌落呈圓形，不透明，表面隆起、濕潤、光滑，邊緣整齊，顏色為乳白色，不可在平板上滑動(dòng)。菌株革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞呈桿狀，有莢膜，有芽孢，有鞭毛。

圖2 在平板上的生長情況Fig.2 Strain Y_1 on medium

2.2.2 生理生化鑒定

對菌株Y_1進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，結(jié)果見下表。菌株可以分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P反應(yīng)結(jié)果為陽性，甲基紅和吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。對比《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[35]關(guān)于細(xì)菌的描述，菌株Y_1生理生化鑒定的結(jié)果基本符合芽孢桿菌的特征，再結(jié)合其形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果，可以初步將該菌株確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表 菌株Y_1的生理生化特征Tab. Physiological and biochemical characteristics of strain Y_1

2.3 16S rDNA分析

2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以菌株Y_1基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到一條約為1.5 Kb的DNA片段。電泳檢測結(jié)果如圖3所示，在約1 500 bp處有一清晰的條帶，符合預(yù)期結(jié)果。

圖3 電泳檢測結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

測序后發(fā)現(xiàn)菌株Y_1的核苷酸序列共有1434 bp，符合預(yù)期。通過同源性比對可以發(fā)現(xiàn)，菌株Y_1與芽孢桿菌屬相似度最高，選擇了在種屬水平最接近的19株菌，通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。由圖可知，菌株Y_1與蠟樣芽孢桿菌(登錄號(hào)：CP011153.1)的同源性高達(dá)99%，與蘇云金芽孢桿菌(登錄號(hào)：CP021061.1、CP015250.1、CP015176.1、CM000747.1、017208.1)也具有99%的同源性。結(jié)合其形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定的結(jié)果，可以將菌株Y_1確認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。

2.4 生長曲線的測定

對菌株Y_1的生長情況做了測定，由圖5可知，當(dāng)菌株培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在20h以后處于穩(wěn)定生長階段。在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h，當(dāng)OD≈0.8時(shí)，菌種處于對數(shù)生長期初期，離心分離菌體制成種子液，用于后續(xù)苯酚降解實(shí)驗(yàn)。

圖5 菌株Y_1生長曲線Fig.5 Growth curve of strain Y_1

2.5 菌株的降酚特性

2.5.1 苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以苯酚濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度(λ=510)為縱坐標(biāo)，繪制苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6所示。該苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，當(dāng)波長等于510 nm時(shí)，苯酚濃度范圍在2～20 mg/L之間，吸光度值Y和苯酚濃度X，滿足線性方程Y=0.1456X+0.0089，R2=0.9996，表明二者呈良好的線性關(guān)系。

圖6 苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of phenol concentration

2.5.2 苯酚降解曲線

每6個(gè)小時(shí)取樣培養(yǎng)液，測定剩余的苯酚濃度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，剩余苯酚濃度為縱坐標(biāo)，繪制苯酚降解曲線。如圖7所示，結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間越長，苯酚濃度越低，降解率隨之升高。培養(yǎng)到42h時(shí)，剩余苯酚濃度為104mg/L，苯酚降解率高達(dá)90.5%，說明菌株Y_1具有較強(qiáng)的降酚能力，達(dá)到高效降酚菌的標(biāo)準(zhǔn)。

圖7 苯酚降解曲線Fig.7 Phenol degradation curve

3 結(jié) 論

3.1 從綿陽某絕緣材料廠的活性污泥中分離得到4株苯酚降解菌。其中菌株Y_1的降酚能力最強(qiáng)，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，初步確定該菌為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。

3.2 生理生化特性表明，當(dāng)溫度在15～40℃、pH值在4.4～10.0以及NaCl濃度在2%～10%時(shí)該菌均能良好生長。

3.3 降酚特性研究表明，當(dāng)苯酚初始濃度為1 100 mg/L時(shí)，在36 h內(nèi)，菌株Y_1對苯酚的降解率達(dá)到了90%，屬于高效降酚菌。

本文分離篩選出一株能高效降解苯酚的菌株Y_1，能在以苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長，其生長與降酚同步進(jìn)行。該菌屬主要在害蟲防治中發(fā)揮作用，用于降解苯酚的蘇云金芽孢桿菌鮮見報(bào)道。菌株Y_1降解苯酚的能力較強(qiáng)，且能很好地適應(yīng)環(huán)境，是一株理想的苯酚降解出發(fā)菌株，具有重要的研究價(jià)值。