王歡歡 李婉婷 史雅文 吳虹 劉樹森 吳婷 殷敏

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea,OSA）是一種常見的睡眠呼吸障礙疾病，OSA的病理生理變化為慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia,CIH）和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂。研究提示睡眠結(jié)構(gòu)異常會增加OSA患者生物鐘紊亂的風(fēng)險[1，2]，CIH也可以引起生物鐘基因[3]的改變。晝夜節(jié)律是指生命活動以24h左右為周期的生物振蕩現(xiàn)象，人體中幾乎所有的細胞和器官在生理和基因水平上均存在特定的晝夜節(jié)律模式，如睡眠-覺醒周期、血壓、心率、肌肉活動、激素分泌等等。OSA的主要病因是上氣道肌肉的活性下降[4]，舌下神經(jīng)元是調(diào)控上氣道肌肉的主要中樞之一，而舌下神經(jīng)元在覺醒、非快速眼動相睡眠、快速眼動相睡眠的活性逐漸下降[5]，而5-HT神經(jīng)元等活性也遵循著相似的規(guī)律[6，7]。5-HT可能是OSA的生物標志物，我們在CIH條件下大鼠舌下神經(jīng)核[8，9]和OSA患者血清5-HT[10]都觀察到了不同程度的變化，但是OSA/CIH條件下5-HT的節(jié)律變化仍需要進一步研究。褪黑素（melatonin,MT）主要由松果體在夜間合成和分泌，可以穩(wěn)定和加強晝夜節(jié)律的耦合，尤其是睡眠-覺醒節(jié)律。而許多病理生理情況下，MT的分泌會受到干擾。健康人的MT高峰發(fā)生在夜間，而OSA患者夜間MT水平顯著降低，并且沒有出現(xiàn)夜間峰值[11，12]。因此有待通過動物研究了解CIH條件下MT節(jié)律變化。

因此我們的研究試圖探索常氧和CIH條件下大鼠血清5-HT和MT不同時間點含量及節(jié)律變化，為進一步闡述OSA的病理生理機制提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 動物與造模

稱取36只8周齡且重量在180～200g左右的清潔級SD大鼠（均由江蘇省動物試驗中心提供）。把SD大鼠隨機分成兩組:慢性間歇性低氧組（CIH組）和常氧對照組（CON組）。CIH組大鼠每天9∶00～17∶00放置于低氧艙中飼養(yǎng)，循環(huán)交替給予60s氮氣和60s壓縮空氣，每一循環(huán)120s。同時用測氧儀檢測艙內(nèi)氧體積分數(shù)變化，使艙內(nèi)氧體積分數(shù)在 5%～21%之間循環(huán)。CON組在常壓、大氣環(huán)境培養(yǎng)艙中飼養(yǎng)，艙內(nèi)氧體積分數(shù)維持在21%。每日CIH造模結(jié)束后將動物送入常規(guī)飼養(yǎng)箱飼養(yǎng)。兩組大鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動物中心SPF環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境、溫度以及條件均相同。造模持續(xù)21d。光照時間固定，明期為07∶00～19∶00，暗期為19∶00～07∶00。本實驗方案的倫理申請和動物申請由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。倫理編號為IACUC 1901047。

2 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）取材

造模結(jié)束后，第22天開始按照時間段分組取材。兩組動物按9∶00、13∶00、15∶00、21∶00、次日1∶00、5∶00點等量分為6小組，每個時間點CIH組和CON組各取3只。稱取體重，2%戊巴比妥鈉（4mg/100g）腹腔注射麻醉大鼠。待大鼠完全麻醉后，仰臥位放置于實驗動物實驗臺上并固定，手術(shù)剪剪除大鼠胸腹部皮毛，手術(shù)刀片劃開腹部，手術(shù)剪刀順著劍突方向穿過大鼠膈肌，剪開大鼠胸骨柄，打開大鼠胸腔。將注射器對準大鼠心尖，讓血液隨著心臟搏動自動泵入負壓真空采血管。抽取3ml心尖血。靜置20min后3000r/min低溫離心15min，取上層血清，分裝至無菌Ep管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 ELISA實驗

大鼠血清5-HT、MT的檢測步驟嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行。稀釋標準品溶液，標準品孔加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，再加待測樣品10μl，空白孔不加樣；37℃孵育1/h；洗板并充分拍干；加入50μl酶標試劑；37℃孵育半小時；洗板并充分拍干；依次加入50μl顯色劑A、50μl顯色劑B，37℃顯色反應(yīng)10min；加入50μl終止液，觀察到藍色立轉(zhuǎn)黃色時，表示反應(yīng)終止。根據(jù)吸光度和標準品濃度繪制標準曲線，計算樣本濃度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，結(jié)果均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 CIH組和CON組大鼠血清中5-HT的含量及節(jié)律變化（表1、圖1）

與CON組相比，CIH組血清5-HT平均含量明顯增高（P<0.001)，其中9∶00、17∶00的升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01)。經(jīng)方差分析，CON組晝夜不同時間點血清5-HT水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CIH組晝夜不同時間點血清5-HT水平的變化也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。谷值均在21∶00，CON組峰值在1∶00，而CIH組峰值移至9∶00。

2 CIH組和CON組大鼠血清中MT的含量及節(jié)律變化（表1、圖1）

圖1 各組大鼠不同時間點血清5-HT、MT含量概括圖5-HT：五羥色胺；MT：褪黑素

表1 各組大鼠血清5-HT、MT含量表達變化

與CON組相比，CIH組血清平均MT含量明顯下降（P<0.001)，其中5∶00的下降有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)方差分析，CON組晝夜不同時間點血清MT水平的變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而CIH組不同時間點血清MT水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CON組谷值在17∶00，CIH組谷值移至1∶00，CON組峰值在5∶00，而CIH組峰值移至13∶00。

討論

本研究結(jié)果顯示，CIH組血清5-HT平均含量增高，而MT平均含量下降。對照組峰值在1∶00，而CIH組峰值移至9∶00。對照組晝夜不同時間點血清MT水平呈現(xiàn)出晝低夜高的分泌模式，而CIH影響了MT的分泌模式，使得MT的分泌趨向于變化不顯著。

5-HT參與調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，包括神經(jīng)元功能調(diào)控、呼吸控制、心血管功能等。本研究發(fā)現(xiàn)了CIH條件下血清中5-HT的分泌量增加，有學(xué)者推測5-HT可能通過增加呼吸系統(tǒng)對CO2濃度敏感性[12]，進而改善缺氧，增加通氣量。此外，血清5-HT也可以通過結(jié)合5-HT受體（尤其是5-HT2A受體）促進膈、舌下神經(jīng)元的長時程易化[13]，保持上氣道的通暢性，進而對缺氧起到一定的代償作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT幾乎全部由腦干中縫核的神經(jīng)元產(chǎn)生，5-HT能神經(jīng)可以廣泛投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大部分區(qū)域，包括舌下神經(jīng)核，然而多數(shù)5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外來源的[14]，本研究結(jié)果表明CIH條件下血清5-HT和舌下神經(jīng)核的變化方向[8，9]并不一致，提示CIH條件下5-HT在血清和中樞的作用機制可能不一致。此外，本研究觀察到對照組5-HT峰值在暗期，而CIH組移位至明期，白天大鼠處于CIH的環(huán)境中，且大多數(shù)嚙齒類動物如大鼠在黑暗中較為活躍，而在光照期間睡眠水平較高[15]，可能提示白天大鼠的上氣道更易松弛塌陷，而5-HT的升高可能通過上述機制[13，14]改善缺氧狀態(tài)。

MT主要由神經(jīng)內(nèi)分泌器官松果體合成，MT的合成受光照條件的影響，白天較低，夜間明顯增加[16]，與本研究的對照組呈現(xiàn)出晝低夜高的分泌模式基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)CIH組血清MT表達下降，且干擾了其晝夜節(jié)律，而MT在各種生理活動中起著關(guān)鍵作用，包括調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、炎癥過程、氧化過程、凋亡等[17]，因此MT的下調(diào)及節(jié)律紊亂一定程度上反應(yīng)了機體晝夜節(jié)律等等多方面的損傷。有研究提示MT干預(yù)對CIH所致的心肌[18]、海馬[19]等組織損傷有緩解作用，因此對于CIH導(dǎo)致的MT的下降造成的機體損傷是否可以外源性補充MT去改善值得我們進一步研究。

因此，我們對5-HT、MT含量及節(jié)律的分析，有助于進一步闡述OSA的病理生理機制。但是本研究受條件限制，樣本量小，同時采血的間隔時間可以進一步縮短（如3h、2h、1h），另一方面，不同CIH時程會對機體產(chǎn)生何種影響，也有待我們今后研究進一步深入。