楊佳鵬 謝梁震 王宇 常雪巖 劉靜丹 韓德錄 李寶華 周凌

慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉（CRSsNP）系耳鼻喉科臨床常見病，鼻黏膜是上呼吸道抵御各種病原體入侵的第一關，當鼻腔黏膜的屏障功能受損，會使得各種致病因子更容易入侵出現(xiàn)黏膜炎癥，進而導致CRSsNP。該病屬中醫(yī)“鼻淵”病范疇，以肺脾氣虛型居多，以其復雜的發(fā)病機制和中醫(yī)辨證時虛實夾雜的病變特點，一直是學者研究的熱點。故本研究以肺脾氣虛型CRSsNP為研究載體，尋找肺脾氣虛型患者鼻黏膜特異性代謝產(chǎn)物的變化，進一步揭示“益氣通竅飲”可能的療效機制。

資料與方法

1 臨床資料

研究對象來源于2019年4月～2021年10月黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，年齡18～65歲之間。辨證為肺脾氣虛型CRSsNP者40例為觀察組（脫落8例），男性11例、女21例，平均年齡（39.56±14.33）歲；對照組20例，來自于體檢中心的健康志愿者，男性9例、女性11例，平均年齡（38.30±12.96）歲。兩組性別、年齡相均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。納入研究對象期間，須清淡飲食，減少不良刺激，如疲勞、熬夜、情緒激動，該研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會評議通過（HZYLLBA201807），所有志愿者均簽署知情同意書。

2 CRSsNP診斷標準

2.1 西醫(yī)診斷標準

參照《中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）》[1]診斷為不伴鼻息肉慢性鼻-鼻竇炎（CRSsNP），患者出現(xiàn)鼻塞、流濁涕、頭面部脹痛、嗅覺減退等癥狀6個月～5年；檢查見中鼻道、嗅裂有粘性或粘膿性分泌物，鼻腔黏膜充血腫脹或肥厚，中鼻甲腫大或肥大；鼻竇CT 掃描見竇腔密度增高影或液平。

2.2 中醫(yī)診斷標準

參照《中醫(yī)耳鼻咽喉科常見病診療指南》[2]鼻淵?。ㄖ袊嗅t(yī)藥出版社，2012）及《中醫(yī)耳鼻咽喉科學》[（3]人民衛(wèi)生出版社，2021）制定中醫(yī)證候診斷標準。

肺脾氣虛型：鼻塞，流白黏涕，嗅覺減退，頭昏脹痛，氣短乏力，自汗畏風，食少納呆，脘腹脹滿，舌質淡，苔薄白，脈細弱。鼻黏膜色淡紅腫脹，中鼻甲肥大，中鼻道可見粘性分泌物。

2.3 CRSsNP納入標準

①符合西醫(yī)慢性鼻-鼻竇炎疾病診斷標準者；

②符合中醫(yī)鼻淵肺脾氣虛證候診斷標準者；

③年齡在18～65歲之間，男女不限。

2.4 CRSsNP排除標準

具備以下任何一項者均不能納入。

①患有較嚴重的系統(tǒng)性疾病如肝腎功能不全、風濕病及孕婦；

②1個月內使用過抗生素、激素、微生態(tài)制劑；3個月內使用過免疫制劑者；

③哮喘、過敏性疾病、真菌性鼻竇炎；

④不遵醫(yī)囑或研究過程記錄不完整。

2.5 對照組納入標準

①年齡在18～65歲之間，男女不限；

②經(jīng)體檢中心檢查無代謝性疾病。

2.6 對照組排除標準

近1月服用抗生素、激素、微生態(tài)制劑，3個月內使用過免疫制劑者。

3 材料與方法

3.1 儀器與試劑

儀器設備：Thermo U3000液相色譜儀，Thermo QE-HF-X質譜儀，湘儀H1850-R冷凍離心機，IKA Vortex 2渦旋混勻儀。

試劑：Thermo色譜乙腈，Dikma色譜甲酸，Dikma色譜甲醇，超純水（屈臣氏）。

益氣通竅飲：黨參12.5g、蜜炙黃芪12.5g、土炒白術12.5g、防風7.5g、辛夷10g、川芎10g、白芷10g、桔梗7.5g、炒蒼耳子10g、桂枝7.5g、細辛2.5g、炙甘草5g，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一制劑，制成100ml藥液，滅菌后濃縮裝入藥品瓶。日1劑，每日早晚餐后30min溫服，共計8周。

3.2 樣本采集與制備

3.2.1 樣本采集

對照組于入組時采集樣本，觀察組于入組治療前、后分別采集樣；

鼻腔黏膜鉗取方法：以1%地卡因加少許腎上腺素棉片填塞患側鼻腔，行鼻腔局部表面麻醉，在鼻內鏡下，以麥粒鉗于患側中鼻甲根部鉗取約0.5cm×0.5cm×0.5cm黏膜組織，隨后以可溶性手術止血紗布敷于創(chuàng)面，檢查無出血后術畢。

3.2.2 代謝組學樣品制備

樣本在4℃下融化，每個黏膜組織稱重，加入9倍質量-20℃預凍色譜甲醇，冰浴研磨；以12000r/min速度，4℃離心15min，取全部上清液，每個樣本各取20μL混合成QC樣本用以校正，剩余裝入液相小瓶。

3.2.4 色譜條件

采用ACQUITY UPLCRHSS T3 1.8μm（2.1mm×150mm）色譜柱，自動進樣器溫度設為4℃，以0.4 ml/min的流速，40℃的柱溫，進樣10μL進行梯度洗脫，流動相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯 度 洗 脫：0min，1%A；0~3min，1%~20%A；3~5 min，20%~60%A；5~9min，60%~100%A。

3.2.5 質譜條件

儀器使用電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50kV，負離子噴霧電壓為2.50kV，鞘氣45arb，輔助氣15arb。毛細管溫度325℃，以分辨率60000進行全掃描，掃描范圍50~1000，并采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為15 V/30 V/45 V（多級模式），同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

3.3 樣本數(shù)據(jù)預處理

a.通過Progenesis QI軟件（v2.3）導入樣本原始下機數(shù)據(jù)，進行峰識別、峰過濾、峰對齊。

b.得到包括質核比、保留時間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣，導出數(shù)據(jù)至excel進行分析。

c.為使不同量級的數(shù)據(jù)能夠進行比較，對數(shù)據(jù)進行峰面積的批次歸一化。

3.4 差異代謝物篩選將得到的數(shù)據(jù)矩陣導入EZinfo 3.0軟件，進行多元統(tǒng)計分析，根據(jù)OPLS-DA分析確定每個離子的貢獻值（VIP），結合組間T檢驗，對代謝物進行篩選。

3.5 差異代謝物鑒定

利用離子的母離子及碎片離子信息，通過HDMB代謝物信息庫（20211024）利用Progenesis QI軟件進行差異代謝物鑒定。

3.6 差異代謝物代謝通路分析

將鑒定的差異代謝組信息導入MetaboAnalyst5.0數(shù)據(jù)庫，進行差異代謝物參與KEGG代謝通路分析。

圖2 負離子下各組色譜圖

結果

1 代謝指紋圖譜宏觀分析

比較空白對照組、肺脾氣虛組樣本治療前、后的典型離子色譜圖，宏觀上代謝指紋圖譜有所差異，峰強度有一定差異，保留時間集中在0～15min（圖1，2）。

圖1 正離子下各組色譜圖

2 鼻黏膜代謝組學分析

圖4 鼻黏膜代謝組學PCA得分圖-負離子模式

采用非監(jiān)督主成分分析，正離子模型：R2=0.5184，Q2=0.4835，負離子模型：R2=0.7735，Q2=0.7326。如圖3，4所示，肺脾氣虛組治療前與對照組可顯著區(qū)分，無交叉重疊。

圖3 鼻黏膜代謝組學PCA得分圖-正離子模式（C-對照組；M-觀察組治療前；8Weeks-觀察組治療后）

3 差異代謝物的鑒定

圖6 OPLS-DA負離子圖（R2=0.7735，Q2=0.7326）

圖7 正離子S-Plot圖

圖8 負離子S-Plot圖

為進一步篩選組間差異性代謝產(chǎn)物，依據(jù)數(shù)據(jù)建立OPLS-DA模型，依據(jù)權重系數(shù)VIP＞1以及P＜0.05，肺脾氣虛組治療后與對照組未發(fā)現(xiàn)明顯差異性代謝產(chǎn)物，肺脾氣虛組治療前與對照組代謝變化進行比較，共鑒定得到差異代謝物離子20個，見表1、圖5-9。

圖5 OPLS-DA正離子圖（R2=0.7735，Q2=0.6138）

表1 主要差異代謝物

圖9 差異性代謝產(chǎn)物組間差異

4 差異代謝物KEGG代謝通路

圖10 ，通過MetaboAnalyst 5.0對差異表達代謝物進行KEGG富集分析，結果顯示影響較大的代謝途徑為：Arginine biosynthesis;Neomycin,kanamycin and gentamicin biosynthesis;Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis;D-Glutamine and Dglutamate metabolism;Nitrogen metabolism。

圖10 KEGG代謝通路氣泡圖

討論

基于UPLC-MS檢測到肺脾氣虛型CRSsNP存在代謝異常，而益氣通竅飲治療有著明顯改善趨勢，現(xiàn)對其調控機制作如下分析：

觀察組中L-Arginine代謝水平的由低轉高，LArginine介導淋巴細胞代謝途徑，參與機體免疫調節(jié)、黏膜功能保護過程[3]，“益氣通竅飲”可能通過提升L-Arginine代謝水平，上調免疫抑制來降低炎癥反應。

L-Glutamine、Pyroglutamic acid、Phenylpyruvic acid、Glucose 6-phosphate、Hypoxanthine代謝水平均出現(xiàn)下調說明炎癥導致機體抗氧化能力下降，而氧化應激和炎癥是緊密相連的[4]，慢性炎癥遷延不愈與炎性細胞產(chǎn)生活性氧有關，活性氧是許多細胞信號轉導通路中的第二信使，與細胞增生、分化和凋亡有關[5]。機體抗氧化能力下降，隨著過氧化物自由基生成的增多，也會加重慢性炎癥反應[6]，而“益氣通竅飲”通過抗氧化途徑來減少炎性細胞因子。

Undecanedioic acid、L-Glutamine經(jīng)過治療后代謝水平由低轉高，二者均與能量代謝相關，LGlutamine是免疫細胞重要的能量來源，代謝水平的減低會導致出現(xiàn)免疫抑制[7]；Undecanedioic acid是調控能量代謝的關鍵性膜蛋白，可將檸檬酸、琥珀酸等物質轉運到胞內參與能量的合成[8]，而“益氣通竅飲”通過加強體內的能量代謝，為免疫細胞的增殖、復制提供能量進而減輕炎癥反應。

SM、PE的代謝水平相較于空白組，出現(xiàn)了降低，但SM在代謝過程中會生成神經(jīng)酰胺（Cer），可增加活性氧自由基（ROS）促進炎癥反應[9]；Cer經(jīng)過分解生成PE的過程中產(chǎn)生的鞘氨醇，也可促進炎癥[10]，故筆者分析可能是由于慢性炎癥過程中，ROS的累積會攻擊細胞膜脂質,破壞了鞘磷脂結構的完整性[11]，進而導致檢測出的代謝水平減低。

PC、LysoPC、LysoPE，PS為甘油磷脂相關的代謝產(chǎn)物，代謝水平整體呈下降趨勢，同樣Arachidic acid作為廣泛存在于磷脂中的不飽和脂肪酸，與其代謝產(chǎn)物20-Hydroxyeicosatetraenoic acid的水平也出現(xiàn)降低。但是在治療組中，雖然PC的代謝前體PS出現(xiàn)了降低，但PC的代謝水平卻出現(xiàn)了兩種趨勢，含有飽和碳鏈的磷脂酰膽堿（PC(18:2(9Z,12Z)/16:0）、PC（16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)）出現(xiàn)升高趨勢，含有不飽和碳鏈的磷脂酰膽堿（PC(P-18:1(11Z)/18:3(9Z,12Z,15Z))）出現(xiàn)了下調趨勢。由于含膽堿脂質的相對不穩(wěn)定性和復雜性，故推測碳鏈與慢性鼻-鼻竇炎之間存在潛在聯(lián)系。而經(jīng)治療后，代謝水平的回調推測“益氣通竅飲”可以糾正脂質代謝紊亂，以增加抗炎介質釋放。

本研究首次通過代謝組學表征了肺脾氣虛型CRsNP的內源性代謝物組的差異情況，表明“益氣通竅飲”通過多種代謝途徑對鼻腔黏膜炎癥進行調節(jié)。