孫靖雅 馬玉超

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

砷（As）是廣泛存在于土壤、礦物質(zhì)、水和生物圈中的一種劇毒、具有致癌作用的類金屬元素［1-2］，在地殼中的含量排名居于第20位。砷在自然界中主要呈現(xiàn) As3-、As0、As3+和 As5+四種價(jià)態(tài)［3-4］，其中以As3+和As5+這兩種價(jià)態(tài)最為常見，且前者的毒性為后者的60-100倍甚至更多［5］。我國(guó)是砷污染問題最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，自然和人為因素導(dǎo)致大量的砷被釋放到環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的砷污染現(xiàn)象，使我國(guó)土壤平均砷含量約為世界平均值兩倍［6-7］。

自然界中As的生物化學(xué)循環(huán)依賴于微生物的轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)期在砷環(huán)境中生存的各種微生物也進(jìn)化出了多種抗砷機(jī)制，其中較常見的4種機(jī)制為：As3+氧化，細(xì)胞質(zhì)As5+還原，呼吸性As5+還原，As3+甲基化［8］，4種抗砷機(jī)理皆由各種操縱子或基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)As5+還原是微生物實(shí)現(xiàn)自身砷解毒的一種重要機(jī)制，在有氧條件下，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的五價(jià)砷被砷還原酶還原為三價(jià)砷后通過As3+通道蛋白排出胞外。ars operon調(diào)控是一種負(fù)調(diào)控機(jī)制，三基因操縱子（arsRBC）和五基因操縱子（arsRDABC）在原核生物中被大量發(fā)現(xiàn)，目前研究較為詳盡。在該操縱子結(jié)構(gòu)中，arsR編碼阻遏蛋白ArsR，主要調(diào)控該操縱子中其他基因的表達(dá)；arsB編碼的通道蛋白ArsB使As3+排出細(xì)胞；arsC編碼的還原酶ArsC可以將As5+還原成As3+；arsA編碼一種As3+激活的ATPase，與As3+分子伴侶ArsD一起增強(qiáng)ArsB對(duì)As3+的外排能力［9］；在近期的研究中，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與砷代謝相關(guān)的功能不明確基因arsH，近年來有多項(xiàng)研究試圖探討驗(yàn)證其作用機(jī)制［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)室前期從湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)的土壤中分離獲得一批高抗砷菌株，經(jīng)砷MIC值及氧化還原性測(cè)定得到砷耐受性優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)seudomonas sp.Tw224［12］。本研究對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行深入抗重金屬性能分析，通過測(cè)序基因組框架圖分析該菌抗砷和其他重金屬基因；并利用代謝工程法驗(yàn)證ars基因簇與砷耐受性的相關(guān)性，旨在豐富假單胞菌中ars基因簇資源，揭示不同基因簇的抗砷功能差異，為砷污染環(huán)境的生物修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)中用到的全部菌株及質(zhì)粒詳見表1。菌株P(guān)seudomonas sp. Tw224為本實(shí)驗(yàn)室前期分離自湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)土壤的高抗砷菌株。E. coli S17-1、質(zhì)粒pK18mobsacB和pSET152由實(shí)驗(yàn)室保存，其他菌株和質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Plasmids and strains in this study

1.1.2 分子生物學(xué)試劑和引物 本文分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用引物（表2）均由北京擎科生物科技有限公司合成，測(cè)序工作由北京睿博興科生物科技有限公司完成。膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒、Marker、高保真PCR酶，限制性內(nèi)切內(nèi)EcoR I、BamH I和Hind III均購于寶日醫(yī)生物科技有限公司，基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司，無縫克隆試劑盒購于碧云天生物科技有限公司，Na2HAsO4·7H2O、安普霉素、卡那霉素均購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

表2 實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 2 Primers in this study

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，無菌水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.2，固體培養(yǎng)基加Agar 16 g。LBS培養(yǎng)基：每升LB培養(yǎng)基中加蔗糖20 g。如需要培養(yǎng)基中添加抗生素，安普霉素（Apr）和卡那霉素（Kn）終濃度均為50 μg/mL。鉬藍(lán)試劑：取67.3 mL濃硫酸緩慢加入200 mL蒸餾水，至冷卻后定容至1 L，加入6 g鉬酸銨，10.8 g抗壞血酸，0.136 g酒石酸銻鉀至完全溶解。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌全基因組提取、測(cè)序及分析 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Pseudomonas sp. Tw224的全基因組，檢測(cè)合格后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。用7個(gè)數(shù)據(jù)庫（GO/KEGG/COG/NR/TCDB/Swiss-Prot/TrEMBL）對(duì)基因進(jìn)行功能注釋，在此基礎(chǔ)上對(duì)全基因組進(jìn)行了Blast比對(duì)。用SignalP數(shù)據(jù)庫對(duì)分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 砷及重金屬M(fèi)IC值測(cè)定 將目的菌株在含不同濃度砷/重金屬的LB培養(yǎng)基固體平板上劃線接種，28℃倒置培養(yǎng)3 d觀查結(jié)果。液體砷MIC值測(cè)定使用含不同濃度砷液體LB培養(yǎng)基，接種后28℃，180 r/min培養(yǎng)72 h檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將目的菌株活化后，挑單菌落接種至10 mL液體LB培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)14 h左右，至OD600為1.0作為種子液，取1 mL種子液接種至100 mL培養(yǎng)基中（1%），28℃，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)。選擇不同時(shí)間點(diǎn)，吸取200 μL菌液至96孔板，使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在600 nm處吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.4 pK18mobsacB質(zhì)粒的改造 利用位于卡那霉素抗性基因（KanR）內(nèi)部的EcoRI和HindIII酶切pK18mobsacB質(zhì)粒，并純化獲得KanR基因缺失的線性化質(zhì)粒片段。以質(zhì)粒pSET152為模板，利用引物對(duì)Apr-U/D，在高保真酶體系中PCR擴(kuò)增安普霉素抗性基因片段。利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物末端同源臂序列，對(duì)上述pK18mobsacB線性片段和安普霉素抗性基因片段進(jìn)行無縫克隆操作，轉(zhuǎn)化dH5α感受態(tài)細(xì)胞，并利用引物對(duì)YZ UP/DOWN進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和卡那霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)驗(yàn)證。

1.2.5 基因簇敲除載體pA18QCA1和pA18QCA2的構(gòu)建 質(zhì)粒pA18mobsacB經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切、純化后獲得線性化片段。以Pseudomonas sp.Tw224基因組DNA為模板，利用引物對(duì)MQa1U S/A和MQa1D S/A分別PCR擴(kuò)增ars1基因簇的上游（a1 up-1 092 bp）和下游（a1 down-822 bp）DNA片段；利用引物對(duì)MQa2U S/A和MQa2D S/A分別擴(kuò)增Pseudomonas sp. Tw224基因組中ars2基因簇的上游（a2 up-728 bp）和下游（a2 down-585 bp）DNA片段。純化后的ars1基因簇的上下游片段（a1 up和a1 down），ars2基因簇的上下游片段（a2 up 和a2 down），分別與線性化的pA18mobsacB進(jìn)行無縫克隆操作，分別構(gòu)建基因簇敲除載體pA18QCA1和pA18QCA2。

1.2.6 抗砷基因簇突變株的構(gòu)建 將基因簇敲除載體pA18QCA1和pA18QCA2分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E. coli S17-1，獲得雙親接合供體菌E. coli S17-1-QCA1和E. coli S17-1-QCA2（后簡(jiǎn)稱為QCA1/QCA2）。將液體培養(yǎng)24 h的供體菌（QCA1/QCA2）分別與受體菌（Tw224）進(jìn)行雙親接合。利用氨芐青霉素和安普霉素篩選同源單交換突變株，利用LBS培養(yǎng)基篩選同源雙交換突變株。利用引物對(duì)YZA1 Y S/A和YZA2 Y S/A進(jìn)行菌落PCR，分別同源單交換和雙交換突變株，并將雙交換突變株分別命名為Pseudomonas sp. QSA1和Pseudomonas sp. QSA2（后簡(jiǎn)稱為QSA1/QSA2）。以構(gòu)建成功的ars1缺失突變株QSA1為受體菌，與供體菌（QCA2）進(jìn)行雙親接合，利用抗生素和蔗糖篩選分別篩選同源單交換和雙交換突變株，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證獲得ars1-ars2雙基因簇缺失突變株P(guān)seudomonas sp. QSARS（后簡(jiǎn)稱為QSARS）。

1.2.7 砷還原能力測(cè)定 使用砷鉬藍(lán)法定量測(cè)量菌株對(duì)五價(jià)砷的還原能力。將保藏菌種活化后取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600為1.0。將種子液8 000 r/min離心10 min，使用PIPES緩沖液兩次洗滌菌體后，將菌體懸浮于含1 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的 PIPES 中，調(diào)整菌懸液的OD600為1.0，并于28℃，180 r/min持續(xù)培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL測(cè)定菌株對(duì)砷的還原能力，樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min后用不含砷的PIPES將上清稀釋10倍，取稀釋后上清液各300 μL，一份加入 100 μL KIO3溶液（5 mmol/L KIO3溶于 50 mmol/L HCl）；另一份加入 100 μL 25 mmol/L HCl。將全部樣品25℃水浴10 min，統(tǒng)一加入600 μL鉬藍(lán)試劑，然后立即轉(zhuǎn)移至78℃水浴10 min，結(jié)束后放至冰上。取處理后樣品200 μL加入96孔板，測(cè)定其OD865吸光度。以Na2HAsO4·7H2O濃度0、200、400、600、800和1 000 μmol/L為橫坐標(biāo)，吸光度 OD865為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。處理二為樣本中As5+濃度，處理一與處理二差值為As3+濃度，依此計(jì)算菌株對(duì)As5+還原率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 Pseudomonas sp. Tw224的抗重金屬譜

菌株Tw224在固體LB平板上As5+和As3+的最低抑菌濃度分別為600 mmol/L和20 mmom/L。為評(píng)估該菌的抗重金屬性能，我們檢測(cè)了除砷以外的8種重金屬的耐受性，結(jié)果表明，該菌對(duì)這8種重金屬均具有不同程度的耐受性（表3）具有廣譜的抗重金屬能力。其中，Cu、Zn和Ni的最低抑菌濃度分別達(dá)到20 mmol/L、12 mmol/L和12 mmol/L。

表3 Pseudomonas sp. Tw224對(duì)8種重金屬的MIC值Table 3 MIC to 8 heavy metals of Pseudomonas sp. Tw224

2.2 Pseudomonas sp. Tw224抗砷性能分析

為深入分析Tw224的抗砷性能，將該菌培養(yǎng)于含不同濃度砷的液體LB，不同時(shí)間取樣測(cè)定菌濃，并繪制生長(zhǎng)曲線。自0-275 mmol/L，共設(shè)置15個(gè)As5+濃度梯度，結(jié)果表明，隨著As5+濃度增加，Tw224進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間明顯延后，最高OD600值明顯降低（圖1）。Tw224在不含砷的LB培養(yǎng)中，約6 h就進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在30 h時(shí)最高OD600達(dá)到約1.7；而在50 mmol/L，180 mmol/L As5+存在的條件下，分別約8 h和36 h才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在約38 h和60 h最高OD600才達(dá)到約1.3和1.0；且在275 mmol/L As5+存在的條件下，該菌幾乎不能生長(zhǎng)。該結(jié)果充分體現(xiàn)了As5+對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)也證明了Tw224的強(qiáng)抗砷能力。

圖1 Pseudomonas sp. Tw224在不同濃度砷培養(yǎng)下的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of Pseudomonas sp. Tw224 in different concentrations of arsenic

2.3 Pseudomonas sp. Tw224的抗砷基因分析

鑒于Pseudomonas sp. Tw224的抗砷能力強(qiáng)，抗重金屬譜廣，我們對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。該菌基因組中共包含了20個(gè)與抗砷相關(guān)的基因，包括1個(gè)arsH，4個(gè)arsC，arsB和ACR（3）各2個(gè)，11個(gè)arsR。這20個(gè)基因中，arsH-arsC2-arsB-arsR和arsR-arsB-arsC2分別以基因簇的形式存在（圖2），長(zhǎng)度分別為2.8 kb和2.2 kb，分別將其命名為基因簇ars1和ars2，其他基因分散在基因組中。其中arsB-arsC-arsR是與砷抗性相關(guān)的最基本的基因構(gòu)成，主要介導(dǎo)As5+的還原外排。除了存在兩個(gè)抗砷基因簇外，在基因位置GM_1097和GM_5883上還單獨(dú)存在還原酶基因arsC1，編碼外排泵的基因ACR（3）（GM_1626和GM_2250）也單獨(dú)存在。位于ars基因簇上和散布在基因組上的arsH基因同源性均在97%以上。雖然該菌具有砷氧化能力，但未發(fā)現(xiàn)砷氧化、砷甲基化相關(guān)基因。同時(shí)，在該菌基因組中發(fā)現(xiàn)了多種重金屬（銅、鎳、鋅、鎘、鉻、銀、汞等）抗性相關(guān)基因基因簇（圖2），這與該菌抗廣譜重金屬結(jié)果相一致（表3）。

圖2 Pseudomonas sp. Tw224中與砷與其他重金屬抗性相關(guān)的基因和基因簇Fig. 2 Genes and gene clusters related to resistances to arsenic and other heavy metals in Pseudomonas sp. Tw224

2.4 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及基因簇敲除突變株的篩選

2.4.1 pA18mobsacB質(zhì)粒的構(gòu)建 在前期實(shí)驗(yàn)過程中，我們了解到Tw224具有卡那霉素抗性，但是對(duì)安普霉素敏感。為了在雙親接合后能夠利用抗生素篩選同源重組突變株，我們需要將pK18mobsacB載體中卡那霉素抗性基因替換為安普霉素抗性基因。采用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建載體pA18mobsacB。含有該載體的E. coli DH5α，不能生長(zhǎng)于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，能夠生長(zhǎng)于含有50 μg/mL安普霉素LB培養(yǎng)基中。在插入位置的上下游設(shè)計(jì)引物對(duì)YZ UP/YZ DOWN以用于菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，若以重組質(zhì)粒pA18mobsacB為模板，擴(kuò)增片段大小應(yīng)為1 176 bp；若以原質(zhì)粒pK18mobsacB為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為579 bp。利用該引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果表明該質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3-A）。

2.4.2 突變株構(gòu)建及篩選 采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建基因簇敲除載體pA18QCA1和pA18QCA2。為驗(yàn)證敲除載體構(gòu)建成功，在修改片段的上下游設(shè)計(jì)了引物對(duì)YZ UP/DOWN，以pA18QCA1和pA18QCA2為模板，擴(kuò)增片段分別為1 510 bp和1 067 bp。以此引物對(duì)進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，上述兩個(gè)基因簇敲除載體均構(gòu)建成功（圖3-B）。

2.4.3 抗砷基因簇敲除突變株的構(gòu)建與篩選 通過雙親接合分別將基因簇敲除載體pA18QCA1和pA18QCA2導(dǎo)入Pseudomonas sp. Tw224，經(jīng)抗生素和蔗糖篩選分別獲得ars1和ars2的同源單交換和雙交換突變株。以QSA1為受體，繼續(xù)敲除ars2基因簇，以獲得ars1-ars2雙缺失突變株。在ars1和ars2基因簇上下游同源臂上設(shè)計(jì)引物對(duì)YZA1Y S/A和YZA2Y S/A用于突變株P(guān)CR驗(yàn)證。對(duì)突變株和野生株進(jìn)行PCR驗(yàn)證。兩對(duì)引物的位置均位于敲除片段上下游同源臂上，若敲除成功，擴(kuò)增條帶應(yīng)為689 bp（ars1）和628 bp（ars2），若未敲除成功，擴(kuò)增條帶應(yīng)為3 060 bp（ars1）和2 692 bp（ars2）。以野生菌和抗生素篩選獲得的突變株為模板，利用上述兩對(duì)引物進(jìn)行突變株驗(yàn)證，結(jié)果表明ars1、ars2和ars1-ars2基因簇缺失突變株均構(gòu)建成功（圖3-C），分別命名為Pseudomonas sp. QSA1（簡(jiǎn)稱QSA1），Pseudomonas sp. QSA2（簡(jiǎn)稱QSA2）和Pseudomonas sp. QSARS（簡(jiǎn)稱 QSARS）。

圖3 各重組質(zhì)粒及突變株的驗(yàn)證Fig. 3 Verification of recombinant plasmids and mutants

2.5 突變株的生長(zhǎng)和抗砷能力分析

無論單基因簇敲除還是雙基因簇敲除均未影響菌體的生長(zhǎng)（圖4-A）。但基因簇敲除后，菌株的抗砷能力明顯減弱。圖4-B縱坐標(biāo)表示菌體可耐受的As5+濃度。野生菌的As5+MIC值為250 mmol/L；ars2缺失突變株QSA2為野生株的80%，下降幅度較?。籥rs1缺失突變株QSA1的As5+MIC值為10 mmol/L，僅為野生株的4%；而ars1-ars2雙基因簇缺失突變株QSARS在含有5 mmol/L As5+培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)僅能在2 mmol/L As5+濃度下極微弱生長(zhǎng)，幾乎完全失去As5+耐受性（圖4-B），3組平行實(shí)驗(yàn)的菌體耐受性結(jié)果相同。上述結(jié)果表明，在Pseudomonas sp.Tw224中，ars1基因簇其主要的抗砷作用，ars2基因簇起輔助作用。

圖4 抗砷基因簇缺失突變株生長(zhǎng)曲線（A）及砷耐受性（B）Fig. 4 Growth curve and arsenic resistance of the gene cluster-inactivated mutants

2.6 突變株的砷還原能力

在突變株還原As5+的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，利用砷鉬藍(lán)法測(cè)定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得As5+和As3+的濃度，計(jì)算得出As5+還原率。結(jié)果表明，Tw224在48 h對(duì)As5+的還原率達(dá)到最高值52%；QSA1、QSA2的還原率隨培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)增長(zhǎng)，在48 h分別僅為5%和28%，僅是野生菌的9.8%和53.8%，QSA1在120 h的還原率達(dá)到最高值7%，QSA2在120 h的還原率達(dá)到最高值35%（圖5）；QSARS在含砷培養(yǎng)基中無法正常生長(zhǎng)，在還原試驗(yàn)中也未檢測(cè)出還原反應(yīng)。ars基因簇主要介導(dǎo)砷還原外排機(jī)制，ars1基因簇的缺失，菌株的砷還原能力明顯減弱，且ars1-ars2雙基因簇缺失，菌株幾乎喪失了砷耐受性和還原性，這一結(jié)果從還原能力角度證明了ars1基因簇在抗砷功能方面起主要作用。

圖5 各菌株As5+還原率差異Fig. 5 Arsenic reduction difference of the mutants

3 討論

本文所研究的砷耐受性優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)seudomonas sp. Tw224同時(shí)具有砷氧化性和還原性［12］，檢測(cè)到其基因組中含有砷還原性相關(guān)基因，在不同濃度的砷酸鹽培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)速度與砷還原性出現(xiàn)了一定相關(guān)性，該菌的生物量隨著砷濃度的升高而明顯降低。

在許多抗砷細(xì)菌中，可能不只存在單一的基因簇，而是含有多個(gè)抗砷基因或基因簇的拷貝。ars operon調(diào)控機(jī)制以三基因操縱子（arsRBC）和五基因操縱子（arsRDABC）最為常見，在多種不同微生物中已被大量發(fā)現(xiàn)和研究，且不同基因型的ars operon在砷代謝上的優(yōu)勢(shì)及其相互之間作用和影響當(dāng)前未見報(bào)道［13］。本研究中Pseudomonas sp. Tw224存在兩個(gè)抗砷基因簇，為arsHCBR和arsCBR。其中arsC、arsB和arsR基因分別負(fù)責(zé)As5+還原、As3+外排和調(diào)節(jié)過程，這個(gè)過程主要體現(xiàn)的是As5+還原機(jī)制，細(xì)菌細(xì)胞吸收As5+后，在還原酶ArsC作用下被還原成As3+，然后再由外排蛋白ArsB排出，從而達(dá)到自身解毒的目的。而且在菌株P(guān)seudomonas putida S13.1.2［14］和 Pseudomonas putida KT2440［15］的一些研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的基因簇，均由抗砷基因arsH、arsC、arsB和arsR組成，但在Pseudomonas putida W619、Pseudomonas sp. TS44等菌株中，抗砷基因簇中的基因ACR3代替了arsB發(fā)揮As3+外排作用。除此之外，在 Pseudomonas xanthomarina S11［16］和Bacillus cereusstrain SJ1［17］中還存在 arsD、arsA 等基因，其中arsD編碼一種阻遏蛋白，arsA編碼與ATP酶相關(guān)的蛋白，而Pseudomonas sp. Tw224菌株中缺少這些基因，但是在一些砷代謝機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)arsA的存在與否對(duì)砷的抗性水平影響不是很大［18］。在抗砷細(xì)菌Achromobacter sp. SY8、Agrobacterium tumefaciens 5A和Rhizobium sp. NT-26等細(xì)菌中，通過As3+氧化機(jī)制來實(shí)現(xiàn)砷解毒的過程也是廣泛存在的，其次還存在一種As3+甲基化機(jī)制，可以將As3+經(jīng)過一系列的甲基化過程，最終轉(zhuǎn)變成氣態(tài)的砷化合物揮發(fā)出去，從而達(dá)到解毒效果。通過抗砷基因分析，在Pseudomonas sp. Tw224中沒有發(fā)現(xiàn)As3+甲基化酶基因arsM和相關(guān)的氧化酶基因，初步推測(cè)在該菌株中可能存在其他的氧化基因或氧化途徑。

在Pseudomonas sp. Tw224中不僅存在抗砷相關(guān)的基因，還發(fā)現(xiàn)了抗其他重金屬的基因，如鋅、鎳、銅、汞、鎘等。其中含有最多的基因是抗銅基因，是通過cop系統(tǒng)介導(dǎo)的，抗其他重金屬的系 統(tǒng)還有 Nik［19］、Znu［20］、Mer等， 其中 czc家族［21-22］的基因與多種重金屬氧離子的抗性相關(guān)，包括鈷、鋅、鎘等。在同一菌株中存在多種抗重金屬的基因和機(jī)制，這在Pseudomonas putida S13.1.2［14］、Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123和 Agrobacterium tumefaciens CCNWGS0286［20］等 菌株的研究中均有報(bào)道。在該菌株中，與鉻（Cr）抗性相關(guān)的基因較少，只有chrA和chrB，這與鉻對(duì)Pseudomonas sp.Tw224的最低抑菌濃度低相符。

本實(shí)驗(yàn)利用代謝工程法，通過構(gòu)建ars基因簇缺失突變株來探究ars基因簇的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，失去ars2基因簇（arsC-arsB-arsR）并不會(huì)極大影響菌株的砷耐受性，而失去ars1基因簇（arsH-arsC-arsB-arsR）則使菌株幾乎完全失去砷抗性。其中，功能尚不明確的arsH基因可能起到重要作用。在關(guān)于微生物抗砷機(jī)制的歷年研究中，對(duì)于基因arsH的功能始終沒有明確驗(yàn)證。在陳倩等［10］的研究中，闡述了arsH編碼NADPH依賴的黃素單核苷酸還原酶，具有O2還原性，可將其還原為H2O2，目前已發(fā)現(xiàn)其晶體結(jié)構(gòu)，但是對(duì)其具體作用始終不能明確。Páez-Espino等［11］的最新研究發(fā)現(xiàn) P.putida KT2440的arsH1和arsH2基因在較小程度上增強(qiáng)了其對(duì)無機(jī)砷（V）和As（III）的耐受性，并減輕了暴露于任一氧陰離子的細(xì)胞所經(jīng)歷的氧化應(yīng)激。arsH1、arsH2在大腸桿菌中異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，除了對(duì)有機(jī)砷有直接作用外，arsH還通過介導(dǎo)暴露于氧陰離子時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS的減少，例如通過產(chǎn)生FMNH2來促進(jìn)ROS猝滅活性，從而有助于減輕As對(duì)物種的毒性。此外，Serrato-Gami?o等［23］也在Burkholderia xenovorans LB400中發(fā)現(xiàn)了含有arsH的ars基因簇（arsR3，ACR3，arsC1和 arsH），Cai等［24］在Pseudomonas sp. TS44中發(fā)現(xiàn)了含有arsH的ars基因簇（arsC1-arsR-arsC2-ACR3-arsH），但均未對(duì)基因功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。在Pseudomonas sp. Tw224中，兩基因簇arsHCBR和arsCBR高度重復(fù)，為精確對(duì)比arsH的功能及其對(duì)砷抗性的影響研究有極大優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

本文深入研究了Pseudomonas sp. Tw224的抗重金屬譜和抗砷性能，通過基因組測(cè)序和分析預(yù)測(cè)到兩個(gè)抗砷基因簇，通過同源重組法構(gòu)建了ars1、ars2和ars1-ars2缺失突變株，基因簇缺失未對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，但突變株的抗砷和As5+還原能力明顯減弱?；虼豠rs1、ars2缺失突變株的抗砷能力（As5+MIC值）分別為10 mmol/L和200 mmol/L，分別是野生株的4%和80%；48 h時(shí)的砷還原能力分別為野生菌的9.8%和53.8%；ars1-ars2雙基因簇缺失突變株幾乎完全喪失了抗砷能力和砷還原能力。上述結(jié)果充分表明在Pseudomonas sp. Tw224，ars1起主要的抗砷作用，ars2起輔助功能。