王睿 韓烈保

（北京林業(yè)大學草業(yè)與草原學院，北京 100083）

植物在自然環(huán)境下的生長過程中一直受到數量眾多的病原菌的攻擊。植物為了生存進化出了一套獨特的先天免疫系統(tǒng)，從而識別并清除病原菌入侵者［1］。植物先天免疫系統(tǒng)通?？梢苑譃閮蓚€層面，分別是分子模式觸發(fā)的免疫（pattern-triggered immunity，PTI）和效應子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI）［2-3］。其中 PTI是基于定位在植物細胞細胞膜上的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）對病原物相關分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs） 或 損 傷 相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）進行識別并響應的免疫過程，該免疫過程可以幫助植物抵御大部分病原微生物［4-5］。

PAMPs廣泛存在于微生物中，是其生存所必需的一類進化上保守的分子［6］。flg22是其中一種已被深入研究的PAMP，它是一種由22個氨基酸組成的高度保守的細菌鞭毛蛋白，可誘導多種植物的廣譜的PTI反應［7-9］。擬南芥的相關研究表明植物細胞表面的模式識別受體FLS2可以識別flg22［10］，此后在水稻以及其他植物中也發(fā)現同源的FLS2受體也可以識別 flg22 誘導 PTI反應發(fā)生［8，11-12］。植物感受PAMPs后誘導活性氧（ROS）爆發(fā)、MAPKs激活、防衛(wèi)基因表達以及植保素合成等一系列的防衛(wèi)響應，抑制病原物生長，從而實現植物對病原物的廣譜抗性［10，13］。

在基因編輯領域，分子生物學家一直在找尋并完善對基因組進行精確編輯和改造的高效便利的新工具，繼鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術之后，利用基于細菌以及古菌抵御病毒侵染的CRISPR/Cas系統(tǒng)，使得基因編輯更為簡單［14-15］。其中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是當前最為主流的基因編輯技術，其設計流程簡單、操作方便、基因編輯效率高，被廣泛應用到了各種植物的基因編輯當中，在提高作物產量、改良作物品質、培育抗病及抗逆境脅迫新品種等領域都具有良好的應用前景［16-17］。

二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是溫帶一年生禾本科早熟禾亞科植物。二穗短柄草同禾本科最基本的常用模式植物水稻相比，其生長周期短，對生長環(huán)境要求較低，同時與早熟禾亞科之間的親緣關系更近，是理想的冷季型草坪草模式植物，二穗短柄草 Bd21 已被廣泛應用到科學研究中［18-19］。

目前對冷季型草坪草的先天免疫的研究開展十分有限，相關研究的突變體材料十分有限。因此本研究利用基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術，在冷季型草坪草模式植物二穗短柄草中對抗病免疫相關的重要基因BdFLS2進行了定向編輯，通過篩選轉基因植株，對編輯后的bdfls2 突變體植株進行測序分析，我們發(fā)現該突變體中bdfls2 基因編碼序列由于堿基的缺失導致提前終止，從而獲得了敲除突變體bdfls2。同時基于此前擬南芥和水稻的FLS2的相關研究，我們發(fā)現該突變體在flg22 處理后相比于野生型，無顯著的ROS爆發(fā)或防衛(wèi)基因的激活，暗示二穗短柄草的FLS2也參與識別病原相關分子模式flg22激活PTI的過程中。進而也證明該突變體植株相關基因FLS2確實是植物中保守存在的識別病原相關分子模式flg22的關鍵組分，該突變體的構建為此后進一步研究冷季型草坪草FLS2的先天免疫奠定了材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用二穗短柄草生態(tài)型均為BD21，由中國科學院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞研究組提供。

1.1.2 菌株和載體 本研究載體構建使用大腸桿菌菌株為DH5α，轉化所用根癌農桿菌菌株為AGL1，利用的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)載體為pHUE411，以上菌株及載體均由中國科學院微生物研究所邱金龍研究組提供。

1.1.3 實驗試劑 Taq DNA 聚合酶等PCR 相關實驗試劑以及RNA提取所用的Trizol試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT 和染料法熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ均購自TaKaRa；活性氧檢測試劑Luminol 和Peroxidase 購自Sigma-Aldrich 公司；激發(fā)子肽段flg22（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；其他實驗試劑均為國產試劑分析純。實驗相關的引物合成以及測序工作均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 靶位點的選取 首先從NCBI數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得 BdFLS2基因序列（BRADI5g21960）。并登陸CRISPR-P 網站（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）輸入本研究目的基因BdFLS2的基因序列，獲得該基因上一系列含有PAM序列備選的潛在靶位點［20］?；诖饲皩M南芥FLS2 蛋白相關的研究報道［21］，顯示FLS2蛋白的N端在識別PAMP的過程中具有重要作用，因此我們在眾多備選位點中最終選擇了位于FLS2 胞外區(qū)功能結構域的sgRNA 靶位點序列bdfls2-sgRNA（5′-GCCGGCTTCAGTCCCTCGAAGGG-3′）進行BdFLS2基因的定向編輯。

1.2.2 CRISPR/Cas9-bdfls2載體構建 首先根據選擇的靶位點序列，合成含對應靶位點序列的一對引物Tfls2-F（5′-GGCGCCGGCTTCAGTCCCTCGAA-3′）和Tfls2-R（5′-AAACTTCGAGGGACTGAAGCCGG-3′），將靶位點序列引物溶解成100 μmol/L母液，各取1 μL 加入到 98 μL 超純水中稀釋到 1 μmol/L，90℃孵育約30 s后移至室溫冷卻完成退火。最后如表1所示將完成退火后的靶點序列與pHUE411載體通過酶切連接構建表達載體CRISPR/Cas9-bdfls2［22］。

表1 酶切-連接體系Table 1 Enzyme digestion-connection system

1.2.3 二穗短柄草的轉化與陽性株檢測 將載體CRISPR/Cas9-bdfls2通過電激轉化法轉入農桿菌AGL1中，然后通過農桿菌介導的方法對二穗短柄草胚性愈傷進行轉化。農桿菌轉化后2周再將愈傷組織轉接至新的選擇誘導培養(yǎng)基上，該過程在設置為16 h光照，8 h黑暗的25℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此后每2周繼代1次，在第2次繼代后將篩選出的抗性愈傷組織轉移到選擇再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)。之后當抗性再生綠苗長至4 cm時將陽性苗轉移至壯苗培養(yǎng)基內，同時取少量葉片提取基因組DNA通過PCR對含目標位點的序列進行擴增并測序鑒定陽性植株。待抗性再生苗具有較健壯的根后，轉入花盆中，于溫室內種植［23］。相應PCR擴增引物如下：bdfls2-F（5′-CGTTCCTAGCACTAGCAGCACTG-3′），bdfls2-R（5′-GGTTCCGTGGAGCGAGTTGT-3′）。

1.2.4 實時熒光定量PCR 利用TRIzol試劑參照RNA提取試劑說明書提取植物的總RNA。取等量植物總RNA并通過DNaseⅠ對提取的植物總RNA進行前處理后，將處理后的RNA樣品用反轉錄試劑盒根據說明書進行反轉錄。參考2014年郭葳等［24］在擬南芥PTI實驗中的實時熒光定量PCR反應分析的方法，使用TaKaRa公司的染料法熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ通過伯樂（Bio-Rad）公司的CFX96熒光定量PCR儀進行PCR反應。本實驗中以BdAct（Bradi4g41850）作為內參基因，基因相對表達量根據2-ΔΔCt公式的計算方法。本實驗中實時熒光定量PCR反應所使用的引物見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequence of primer for qRT-PCR

1.2.5 ROS的測定 挑選14 d大的正常生長的二穗短柄草為材料，用植物葉片打孔器取直徑大小為4 mm 的二穗短柄草葉圓片并用鑷子小心放入各孔已加入去離子水200 μL 的96 孔酶標板中。室溫下靜置避光過夜，第2天小心吸去各孔的去離子水，并加入200 μL ROS測定溶液，然后用酶標儀（Centro XS3LB 960微孔板式發(fā)光檢測儀）按2 min 一次計數，記錄總計50 min 內的相關吸光值［25］。本實驗中ROS的測定每種樣品設8個生物學重復，統(tǒng)計分析作圖表示為平均值±標準誤。

2 結果

2.1 CRISPR/Cas9介導的bdfls2突變體構建與分子鑒定

在二穗短柄草BdFLS2 基因序列473 bp對應的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）位置設計一對引物（Tfls2-F和Tfls2-R），通過pHUE411載體相應的酶切連接體系，將該靶序列插入到Bsa I酶切后的pHUE411載體中（圖1）。

圖1 二穗短柄草CRISPR/Cas9-bdfls2基因編輯載體示意圖Fig. 1 Illustration of CRISPR/Cas9-bdfls2 gene editing vector in B. distachyon

通過電激法轉化將構建好的帶有BdFLS2基因靶序列的CRISPR/Cas9-bdfls2載體質粒轉入農桿菌菌株AGL1，用于此后二穗短柄草愈傷的轉化。同時利用PCR的方法，通過pHUE411植物表達載體上對應的一對鑒定引物OsU3p-F3（5′-GACAGGCGTC TTCTACTGGTGCTAC-3′）和 OsU3t-R（5′-TATTCACTA GCTCGGGATAGTTGGC-3′）進行PCR擴增，發(fā)現成功轉化的菌株對應的條帶大小和預期片段大小一致，表明基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向編輯敲除二穗短柄草BdFLS2的基因組編輯載體已構建成功（圖2-A）。在獲得了一批經過轉化再生后成功通過篩選的植株后，為了驗證是否成功靶向編輯對野生型Bd21中的FLS2 基因，以及確定編輯后的基因型，我們選取轉化篩選再生后的植株葉片，提取基因組DNA，并利用一對基因型鑒定引物bdfls2-F和bdfls2-R擴增包含編輯位點的片段進行測序分析（圖2-B）。如圖3-B所示，我們在其中2株不同的轉基因植株中發(fā)現BdFLS2靶位點處測序結果呈現雙峰，利用2015年劉耀光課題組開發(fā)的目標靶點突變的分析程序DSDecodeM對測序結果進行解讀［26］，發(fā)現這2株不同的轉基因植物的BdFLS2等位基因上均發(fā)生了不同大小片段的堿基缺失，導致原有序列提前終止，因此獲得了bdfls2 的基因敲除突變體。

圖2 編輯載體和編輯后靶基因的鑒定Fig. 2 Identification of gene editing vector and edited target gene

圖3 二穗短柄草bdfls2 突變體基因型檢測Fig. 3 Genotyping of bdfls2 mutants in B. distachyon

2.2 bdfls2突變體在病原相關分子模式flg22誘導下的ROS檢測

為了檢測二穗短柄草BdFLS2 是否參與了植物抗病的PTI 過程，我們用5 μmol/L flg22 去處理二穗短柄草野生型（WT）和bdfls2 突變體植物葉片?；钚匝醣l(fā)是植物細胞一個早期的應對PAMP的反應，因此我們首先檢測了flg22 處理后激發(fā)的活性氧（ROS）的變化。發(fā)現在野生型中flg22 能明顯誘導的活性氧的爆發(fā)，且在15 min左右相對水處理的對照有顯著峰值產生，此后下降并于24 min后趨于平穩(wěn)。而bdfls2 突變體在flg22處理后則與未誘導的水處理野生型的曲線基本一致，無明顯的活性氧爆發(fā)發(fā)生（圖4）。以上結果表明，BdFLS2 參與了二穗短柄草識別flg22激活PTI的過程。

圖4 二穗短柄草野生型和bdfls2 突變體在flg22處理下的ROS檢測Fig. 4 ROS burst of wild-type B. distachyon and bdfls2 mutants under flg22 treatment

2.3 bdfls2突變體在病原相關分子模式flg22誘導下的抗病相關基因檢測

抗病相關基因表達的檢測是PTI研究中常用的一種檢測手段［27］，為了進一步證明BdFLS2 參與了二穗短柄草識別flg22激活PTI的過程，我們通過RT-PCR的方法檢測了抗病相關基因表達情況。用5 μmol/L flg22分別處理二穗短柄草野生型（WT）和bdfls2 突變體植物葉片，并檢測未處理的對照及處理1、3、6 h后不同時間的抗病相關基因BdChit8和PR2的的表達情況，發(fā)現在bdfls2 突變體中兩種抗病基因在flg22處理后無顯著變化，而在野生型中在處理后3 h顯著增加，并在6 h呈現顯著的峰值（圖5-A）。同時我們利用另一種可以激發(fā)植物PTI的被廣泛研究的真菌類PAMP 幾丁質（chitin）進行了相同的檢測實驗，如圖5-B所示，發(fā)現在100 μg/mL chitin 處理下bdfls2 突變體植物的抗病相關基因有顯著的變化，其中BdChit8的變化模式野生型基本一致。以上結果表明，BdFLS2 參與了二穗短柄草特異性識別flg22激活PTI的過程。

圖5 實時熒光定量RT-PCR 對PAMPs誘導的防衛(wèi)基因的檢測Fig. 5 Detection of defense gene expression induced upon different PAMPs treatment by real-time quantitative RT-PCR

3 討論

相對于早期研究基因功能時常用的T-DNA插入技術無法定向編輯研究中的目的基因，以及盡管可以進行靶向編輯但操作及構建較為復雜的鋅指核酸內切酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALENs）這兩種基因編輯技術。CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡便，可編輯區(qū)域大，靶向編輯效率高。同時隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)研究的日益深入，諸如單堿基編輯以及多位點編輯等技術勢必都能夠更好地應用到提高作物產量、改良作物品質、培育抗病及抗逆境脅迫新品種等領域中［16-17］。本研究利用該技術成功地對二穗短柄草的單一目的基因FLS2進行了編輯，并在第一代便獲得了完全的基因敲除突變體，可見通過該方法可以大大縮短突變體材料獲得的時間。而在冷季型草坪草領域基因編輯目前主要仍受限于材料的遺傳轉化再生體系仍不完善，直接在目的材料上進行直接的遺傳操作耗費巨大，也因此利用好已有的模式植物二穗短柄草進行相關研究，在獲得一定基礎后進而定向擴展到相應草坪草植物的基因編輯育種中勢必能取得更好的突破。

在PAMPs處理植物后防衛(wèi)基因響應的測定中，我們同時發(fā)現bdfls2突變體植株的某些防衛(wèi)基因在flg22誘導下仍會顯著變化，這表明除BdFLS2外可能還有其他的模式識別受體可以識別flg22并激活PTI響應。而在chitin的誘導下其防衛(wèi)基因PR2的表達模式也與野生型有顯著差別（圖5-B），這表明在敲除BdFLS2后可能由于其他模式識別受體參與相關信號的識別傳遞發(fā)生了改變從而導致了這一變化。所以對于本研究中獲得的bdfls2突變體植株，可作為研究FLS2相關植物免疫通路的模式植物，更好地研究FLS下游信號通路的具體傳導過程，對于開發(fā)相關的細菌型病害的抗病策略或新抗病品種的開發(fā)都有著重要意義。同時關于flg22的最新研究表明flg22的種類也會與不同種類的FLS2有特異性的識別關系［28］，而本研究中使用的只是此前廣泛應用于擬南芥研究當中并在水稻PTI研究中被證明可以激發(fā)PTI相應的單一一種flg22，所以要更深入有效地進行草坪草相關的抗病研究可能仍需要針對當前草坪草生長環(huán)境中天然存在的特異性的細菌病害所含的flg22進行相關研究，從而獲得更實際的研究結果。

4 結論

本研究利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術成功獲得了二穗短柄草bdfls2的基因敲除突變體。通過檢測突變體相應的PTI響應指標，發(fā)現bdfls2突變體植株ROS爆發(fā)和相關防衛(wèi)基因的表達相較于未誘導的野生型均無明顯變化，表明獲得的bdfls2突變體確實未參與相應的PAMP的識別和誘導PTI響應的過程中。證明利用該技術在模式植物二穗短柄草中可以較快速地定向獲得新的突變體并進行相應的功能研究，也為研究冷季型草坪草植物的先天免疫奠定了重要的遺傳材料基礎。