唐嘉城 梁毅珉 馬葭思 彭桂香 譚志遠(yuǎn)

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

植物內(nèi)生菌（endophyte）是指在健康植物的細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)存活且可在不同時(shí)期或不同組織間存在的各種微生物［1］。雖然進(jìn)入植物體內(nèi)的方法和時(shí)間不盡相同，但其一旦定植于植物體內(nèi)的便可以與植物形成穩(wěn)定地共生關(guān)系［2-3］。大部分植物體內(nèi)均有植物內(nèi)生菌存在，雖然其定植于植物體內(nèi)的方式不盡相同，但是其在植物體內(nèi)對(duì)寄主植物都具有多種作用，一些具有生防作用的有益內(nèi)生細(xì)菌不僅能夠起到與化學(xué)農(nóng)藥相似的作用，還能減少農(nóng)藥濫用對(duì)環(huán)境和人類健康的危害，在植物保護(hù)方面有很大的應(yīng)用價(jià)值［4］。植物內(nèi)生菌的研究與生物肥料及相關(guān)菌劑制造息息相關(guān)，通過生物肥料和菌劑改善土壤條件有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展，并可改善長期施用化肥而帶來的土壤酸化、重金屬污染等負(fù)面影響。因此，了解百香果內(nèi)生菌的種群特點(diǎn)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并對(duì)其內(nèi)生菌的生物學(xué)功能與促生特性進(jìn)行研究，挖掘菌種資源，從而將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

百香果（Passiflora edulia Sims）屬于西番蓮科西番蓮屬，主要生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，常見品種有黃金、滿天星等。在種植1到2年后開始結(jié)果，花期較長一年多季，可種植10年左右。百香果具有食用、藥用和觀賞等多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值。果瓤內(nèi)含大量汁液，加入糖和其他添加劑，可制成芳香可口的飲料，現(xiàn)多用于添加在各種飲品中以提供酸甜爽口的味覺體驗(yàn)和富含維生素C與多種微量元素的營養(yǎng)價(jià)值。百香果花的花瓣多且柱頭有3個(gè)分裂水平分開，顏色多為白色和紫色，作為藤本植物可種植于庭園中以作觀賞，具有很大的市場潛力。我們從百香果根莖葉中分離純化內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，之后進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和相關(guān)功能性試驗(yàn)以期望找到對(duì)植物生長具有促生作用，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用且具有多種促生特性于一體的微生物種質(zhì)資源，從而更好地服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 百香果（Passiflora edulia Sims）取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場，選用百香果的根、莖、葉作為分離內(nèi)生細(xì)菌的主要部位。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 使用NFB無氮培養(yǎng)基［5］、DN無氮培養(yǎng)基［6］和LB培養(yǎng)基對(duì)百香果內(nèi)生菌株分離純化。PKO培養(yǎng)基、鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基和MSA-CAS培養(yǎng)基等［6］進(jìn)行促生試驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑和儀器 氣象色譜儀，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司；分光光度計(jì)，PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；3-吲哚乙酸，合肥博美生物公司；2×Taq PCR Mix、DNA Marker，北京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 參考譚志遠(yuǎn)等［7］的方法。將采集到的健康百香果植株用清水洗去表面灰塵和泥土，根、莖取2-3 cm左右的小段若干，葉取3 cm×3 cm左右的葉片若干放入滅過菌的培養(yǎng)皿內(nèi)置于超凈臺(tái)中進(jìn)行表面滅菌，先用75%的酒精浸泡植物組織塊2-3 min，期間可用滅菌鑷子晃動(dòng)組織塊使表面滅菌更充分，重復(fù)兩次，之后用無菌水洗滌2-3 min，重復(fù)兩次，將組織塊用4%次氯酸鈉浸泡4-7 min（根、莖浸泡時(shí)間偏長，葉浸泡時(shí)間偏短），之后再次用無菌水洗滌2-3 min，重復(fù)3次，保留最后一次洗滌的無菌水涂布在LB平板上作為對(duì)照，以確定植物組織塊外表面是否消毒徹底。將表面消毒完成的根、莖用滅菌的剪刀剪去兩端各約0.5 cm，保留1-2 cm的中間部分，同樣對(duì)葉片組織周圍減去約0.5 cm寬的葉片，保留2 cm×2 cm的中間部分，目的是將根、莖兩端及葉片周圍過度消毒的部分去除。之后將組織塊放入滅好菌的研缽中，加入無菌水，用研磨棒充分研磨，吸取0.1 mL研磨液于1.5 mL EP管中，加入0.9 mL無菌水充分混勻，然后將其濃度梯度稀釋為10-3、10-4、10-5，分別取50 μL稀釋液用涂布平板法涂布于NFB、LB、DN固體培養(yǎng)基上，倒置裝袋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況，挑取生長狀況良好的單菌落以平板劃線法培養(yǎng)多代，直至獲得表型特征一致的純化菌株。

1.2.2 IS-PCR插入序列指紋圖譜聚類 以各菌株的全基因組DNA為模板，通過指紋圖譜（IS-PCR）方法［8］，使用通用引物J3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，50 μmol/L J3 1.0 μL，模板 DNA（40 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)條件為 ：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃50 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。參照劉麗輝等［6］的方法。之后使用GIS與TREECONW軟件對(duì)所得電泳圖譜進(jìn)行聚類［9］。

1.2.3 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 16S rRNA基因擴(kuò)增使用通用引物27F 和1492R。PCR反應(yīng)體系 為（25.0 μL）：ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，DNA 模板（40 ng/μL）1 μL，PCR 反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 50 s，32 個(gè)循環(huán) ；72℃ 5 min。由廣州天一輝遠(yuǎn)公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)所得序列進(jìn)行16S rRNA BLASTN比對(duì)，將同源性最高的模式菌株與代表菌株用MEGA X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 百香果內(nèi)生菌生理生化鑒定 革蘭氏染色、甲基紅測(cè)定、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)、脲酶測(cè)定、明膠液化測(cè)定、H2O2酶測(cè)定、NO3-還原實(shí)驗(yàn)等均參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［10］進(jìn)行。

1.2.5 菌株固氮酶活測(cè)定及nifH基因擴(kuò)增與分析 固氮能力的測(cè)定：將各類群代表菌株分別置于LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中，120 r/min培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋成OD600為1的菌液，取10 μL接種于有3 mL半固體DN培養(yǎng)基的10 mL試管中，用經(jīng)H2O2滅菌的膠塞密封，并用封口膜封住膠塞與試管連接處，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，確定菌株定植于試管中后，用乙炔還原法（ARA）對(duì)其進(jìn)行固氮酶活性測(cè)定，先抽取剩余空氣1/100體積的試管內(nèi)氣體，之后向試管中注入等體積的100%乙炔氣體以確保氣壓一致。在37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h后，用1 mL注射器從試管中抽取0.5 mL氣體注入氣相色譜，用氣相色譜儀測(cè)定乙烯與乙炔峰面積，進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。

nifH基因的擴(kuò)增參照Zehr等［11］的方法，引物使 用 Zehr-F（5′-TGYGAYCCNAARGCNGA-3′） 和Zehr-R（5′-NDGCCATCATYTCNCC-3′）（D：A，G 或 T；N：A，C，G或 T；Y：C或 T；R：A或 G）。PCR反應(yīng)程序 ：97℃ 3 min ；97℃ 60 s，55℃ 50 s，72℃35 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 菌株的促生特性 溶磷試驗(yàn)：將菌株活化后用過滅菌的牙簽點(diǎn)種到PKO培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5 d，通過觀察菌落周圍是否形成透明圈，判斷菌株是否具有溶磷能力，有透明圈則說明菌株具有溶磷能力。采用鉬銻抗比色法對(duì)各菌株溶磷能力大小進(jìn)行測(cè)量［12］。

解鉀試驗(yàn)：將菌株活化后用過滅菌的牙簽點(diǎn)種到鉀細(xì)菌固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5 d，通過觀察菌落周圍是否有透明圈，判斷菌株是否具有解鉀能力，有透明圈則說明菌株具有解鉀能力。采用四苯和硼酸鈉法對(duì)各菌株溶磷能力大小進(jìn)行測(cè)量［13］。

分泌生長素試驗(yàn)：定性分析：將菌株活化后接種至King液體培養(yǎng)試管中，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于搖床中28℃、120 r/min培養(yǎng)2 d。吸取50 μL菌懸液于陶瓷比色板上，加入等量比色液，設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，陰性對(duì)照加入50 μL未接菌的King液體培養(yǎng)基，陽性對(duì)照中加入50 μL濃度為10 mg/L的植物生長激素（IAA），之后在黑暗條件下靜置半個(gè)小時(shí)，觀察顏色變化，能產(chǎn)生生長素的菌株其混合液在靜置后會(huì)變?yōu)榉奂t或紅色；定量分析：使用純的3-吲哚乙酸（3-IAA）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Salkowski比色法［6］，對(duì)代表菌株分泌生長素的能力進(jìn)行測(cè)定。

產(chǎn)鐵載體試驗(yàn)：將菌株接種于MSA-CAS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，120 r/min培養(yǎng)3-5 d，觀察培養(yǎng)基變色情況，未變色則菌株不具有產(chǎn)鐵載體能力，如果培養(yǎng)基顏色變?yōu)榉奂t色則菌株具有分泌鐵載體的能力。

產(chǎn)蛋白酶實(shí)驗(yàn)：用脫脂奶粉瓊脂固體培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶能力測(cè)定。A組分：Skimmed milk powder 35.0 g，500 mL H2O，B組分：Agar 20.0 g，500 mL H2O，A與B組分在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌30 min，A與B組分分開滅菌以防止結(jié)塊，滅菌完成后待其溫度降至60℃左右時(shí)快速混勻后制備產(chǎn)蛋白酶檢測(cè)平板。用滅過菌的牙簽將菌株點(diǎn)種在培養(yǎng)基中央，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，觀察菌落周圍是否有透明圈形成，有透明圈出現(xiàn)則說明菌株具有產(chǎn)蛋白酶能力，通過計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值確定菌株產(chǎn)蛋白酶能力大小。

2 結(jié)果

2.1 百香果內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

經(jīng)分離純化后共得到51株百香果內(nèi)生細(xì)菌。具體結(jié)果如表1所列。51株內(nèi)生菌是從不同組織中分離得到的，其中根中分離到31株，莖中分離到13株，葉中分離到7株。

表1 百香果內(nèi)生細(xì)菌菌株統(tǒng)計(jì)表Table 1 Strains isolated from P. edulia Sims

2.2 分離菌株IS-PCR指紋圖譜聚類分析

根據(jù)IS-PCR指紋圖譜的結(jié)果（圖1），使用TREECONW軟件將51株細(xì)菌聚為12類（圖2）。不同類群菌株指紋圖譜的條帶位置及數(shù)量之間存在明顯區(qū)別，顯示出各類群之間分子水平上的差異。

圖1 百香果51株內(nèi)生菌IS-PCR指紋圖譜電泳圖Fig.1 IS-PCR fingerprinting patterns of 51 endophytes in P. edulia Sims

圖2 百香果51株內(nèi)生菌的IS-PCR指紋圖譜聚類（UPGMA）Fig.2 Dendrogram of IS-PCR fingerprinting patterns（UPGMA method）of 51 endophytes in P. edulia Sims

2.3 菌株16S rRNA基因序列分析

對(duì)12個(gè)類群的代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLASTN進(jìn)行相似度比對(duì)，結(jié)果見表2，使用MEGA X將相似性最高的模式菌株與代表菌株的基因序列用鄰接法進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

圖3 各類群代表菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Fig.3 Phylogenetic dendrogram of 16S rRNA gene sequences for representative strains（Neighbor-joining method）

表2 百香果各類群代表菌株16S rRNA基因序列相似性比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison results of 16S rRNA gene sequence similarity of representative strains of various groups of P. edulia Sims

2.4 代表菌株生理生化鑒定

通過對(duì)各類群代表菌株所做的生理生化試驗(yàn)得到結(jié)果如下（表3）。具有固氮酶活性的代表菌株有 BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71、BXG53，其中BXJ71具有最高的固氮酶活性，達(dá)到447.93 nmol C2H4/（mL·h）。固氮酶nifH基因電泳圖見圖4，可見菌株BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71和BXG53在約360 bp處擴(kuò)增出的nifH基因條帶。

圖4 代表菌株nifH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 PCR products of the nifH gene in representative strains

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2.5 代表菌株的促生長特性

對(duì)各類群代表菌株進(jìn)行可溶性磷定量測(cè)定，可溶性鉀定量測(cè)定，產(chǎn)蛋白酶定性試驗(yàn)，產(chǎn)鐵載體能力試驗(yàn)，產(chǎn)生長素定量試驗(yàn)，結(jié)果見表4。菌株 BXG111、BXY92、BXG212、BXG101、BXJ71、BXG53具有溶磷能力，菌株BXG129、BXY92、BXJ201、BXG81、BXG212、BXJ71、BXG53 具有解鉀能力，菌株 BXG95、BXG129、BXG92、BXY92、BXG81、BXG212、BXG101、BXG201、BXJ71、BXG53具有產(chǎn)生長素能力，菌株BXG81、BXJ71、BXG53具有產(chǎn)鐵載體能力，菌株BXG95、BXG129、BXY92、BXG201、BXJ71具有產(chǎn)蛋白酶能力。其中BXJ71具有各試驗(yàn)測(cè)試的促生能力，BXG53、BXY92和BXG212也具有多種促生能力（圖5）。

圖5 部分代表菌株促生特性Fig.5 Growth-promoting characteristics of some representative strains

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3 討論

本研究以百香果為材料從中分離純化出了51株菌株。這51株內(nèi)生菌系統(tǒng)發(fā)育分析聚類為12類，10個(gè)屬12個(gè)種，分離部位是從百香果植株不同部位獲得的，體現(xiàn)了百香果內(nèi)生菌的遺傳多樣性，同時(shí)具有多種促生長特性，內(nèi)生菌的固氮酶活性隨分離部位及其種屬不同而顯示出一定的差異，分布在21.11-477.93 nmol C2H2/（mL·h）之間。Farhana等［14］對(duì)小麥內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，得到了7個(gè)屬15種不同的內(nèi)生菌，對(duì)其進(jìn)行了植物促生和促進(jìn)植物抗逆性的試驗(yàn)，得出小麥內(nèi)生菌可通過分泌大量有益的促生代謝物促進(jìn)植物生長并幫助寄主植物在逆境下生存；Bram等［15］對(duì)楊樹根際細(xì)菌和植株內(nèi)生菌群落的結(jié)構(gòu)變異及生態(tài)位分化的研究表明，楊樹內(nèi)生菌在屬及以上的OUT水平顯示，根中以Rhizobiales、Rhizobium屬為主，莖中主要以Pseudomonas、Methylobacterium、Deinococcus屬為主，葉中以Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium屬為主，同時(shí)證明了田間生長的楊樹內(nèi)生微生物組的結(jié)構(gòu)變異性遠(yuǎn)高于根際微生物組，這種更高的變異性可能與植物不同組織部位的生理環(huán)境差異和植物因外界環(huán)境變化而導(dǎo)致的體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、水分、激素等的變化有關(guān)。本研究的百香果屬于藤本植物，我們從其中分離得到了10屬12個(gè)種的內(nèi)生菌，證明百香果內(nèi)生菌具有豐富的遺傳多樣性，上述研究表明在草本和木本植物中也都有豐富的內(nèi)生菌存在，這些不同種屬的內(nèi)生菌有著多樣的生物學(xué)功能，可通過自身代謝和生長對(duì)植物產(chǎn)生促生及抗逆境脅迫等多種影響，對(duì)微生物多樣性研究和具有特異性功能菌株的開發(fā)有著重要的意義，同時(shí)更高的變異性也意味著植物內(nèi)生菌對(duì)拓展微生物種質(zhì)資源和研究不同微生物群落間相互作用有著極高的價(jià)值。進(jìn)一步可將百香果功能菌株回接作物進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)和大田實(shí)驗(yàn)，研究功能菌株對(duì)作物促生、抗病等功能的效果，進(jìn)而使其能服務(wù)于農(nóng)業(yè)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)。

本文分離純化得到的Ⅰ類群Bacillus altitudinis細(xì)菌最早是從收集高海拔空氣樣品的低溫管中分離得到的［16］，與類群Ⅱ的Bacillus circulans位于同一個(gè)屬，其都有產(chǎn)生長素的能力且在12個(gè)類群中最強(qiáng)，說明它們?cè)诖龠M(jìn)植物生長發(fā)育方面優(yōu)勢(shì)更加明顯，且類群Ⅰ的代表菌株BXG95產(chǎn)蛋白酶能力在12個(gè)類群中最強(qiáng)，而類群Ⅱ的BXG129又具有解鉀能力。Baliyan等［17］在對(duì)可促進(jìn)鷹嘴豆生長的菌株研究中發(fā)現(xiàn)，從鷹嘴豆根際土壤分離出的MRN16同Bacillus altitudinis有99%的相似性，而此菌株在最優(yōu)環(huán)境下的產(chǎn)生長素能力在2 d時(shí)約為30-40 mg/L，同本研究得出的24.32 mg/L較為接近，本試驗(yàn)結(jié)果偏低的原因可能為菌株生長環(huán)境并非為最優(yōu)導(dǎo)致的，同時(shí)MRN16菌株對(duì)鷹嘴豆種子發(fā)芽的促進(jìn)作用明顯，我們推斷類群Ⅰ的代表菌株BXG95也具有良好的促生作用。

類群Ⅴ的Paenibacillus illinoisensis細(xì)菌是由F. E.Clark［18］從土壤中發(fā)現(xiàn)的，Paenibacillus屬和Bacillus屬最早在分類學(xué)上同屬于一個(gè)屬，后來于1993年由Ash等［19］提議將部分菌劃分為Paenibacillus屬。本試驗(yàn)類群Ⅴ代表菌株BXY92具有溶磷、解鉀、產(chǎn)生長素和產(chǎn)蛋白酶多種能力，且解鉀和產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)。Liu等［20］對(duì)Paenibacillus illinoisensis細(xì)菌促進(jìn)花生生長的能力進(jìn)行了田間試驗(yàn)，結(jié)果表明接種Paenibacillus illinoisensis細(xì)菌的植株莢果產(chǎn)量比對(duì)照提高了37.05%，對(duì)植株全氮、磷、鉀的積累具有促進(jìn)作用，這同本研究對(duì)類群Ⅴ代表菌株BXY92進(jìn)行的促生特性試驗(yàn)結(jié)果相符合。

類群Ⅶ的Rhizobium pusense細(xì)菌是由Digvijay等［21］于2011年從鷹嘴豆的根際分離并命名的，其屬于根瘤菌屬，雖然大眾會(huì)有根瘤菌是同豆科植物根莖共生的印象，但是其共生特性在遺傳上是不穩(wěn)定的，這增加了非共生根瘤菌在其他植物根莖、土壤中發(fā)現(xiàn)的可能性，因此一些從其他植物根莖、土壤中發(fā)現(xiàn)根瘤菌的現(xiàn)象有被報(bào)道，Soberon-Chavez，Quigley等［22-23］在土壤中發(fā)現(xiàn)過根瘤菌，Segovia，Yanni和Mónica等［24-26］在根際土壤和其他植物根莖中發(fā)現(xiàn)過根瘤菌。本試驗(yàn)類群Ⅶ的代表菌株BXG81分離部位是百香果植株的根系，這也驗(yàn)證了根瘤菌可在豆科植物根瘤以外的植物組織存在，其具有生物固氮、解鉀、產(chǎn)生長素和分泌鐵載體能力，微生物通過合成分泌自身生存需要的鐵載體使其能在低鐵環(huán)境中螯合環(huán)境或宿主細(xì)胞中的鐵，為其生長提供了鐵元素，有研究表明具有產(chǎn)鐵載體能力的細(xì)菌可以降低土壤重金屬含量［27］，還對(duì)植物具有促生能力［28］，并能增強(qiáng)植物抵抗病原菌的能力［29］。

類群Ⅷ的Beijerinckia fluminensis細(xì)菌最早是從巴西不同地區(qū)收集的土壤樣品中分離得到的［30］。本試驗(yàn)類群Ⅷ的代表菌株BXG212具有生物固氮、溶磷、解鉀和產(chǎn)生長素的能力。Krupali等［31］對(duì)多種藥用植物進(jìn)行內(nèi)生菌分離和純化后得到了5株具有促生作用的菌株，其中從姜黃根莖中分離出的C-1菌株經(jīng)鑒定為Beijerinckia fluminensis細(xì)菌，促生功能試驗(yàn)結(jié)果同本研究結(jié)果一致，同時(shí)其對(duì)C-1菌株也擴(kuò)增出了nifH基因，再次從基因?qū)用孀C明了其具有生物固氮的功能。

類群Ⅺ的Klebsiella michiganensis細(xì)菌最初報(bào)道是從美國密歇根州一個(gè)家庭的牙刷架上分離得到的，后來也有從植物組織中分離出來的報(bào)道［32］，與類群Ⅻ的Klebsiella pneumoniae細(xì)菌同屬Klebsiella屬，K.pneumoniae有從多種植物中分離出的報(bào)道［33-35］。付思遠(yuǎn)等［36］對(duì)泓森槐內(nèi)生固氮菌的分離中得到了和K. michiganensis細(xì)菌相似度為100%的菌株，其分離部位是植株的莖稈部分，具有固氮酶活性和多種促生作用，本實(shí)驗(yàn)類群Ⅺ也主要由莖中分離同樣具有固氮酶活性且所具有的促生作用相似，而本試驗(yàn)類群Ⅺ中有一株菌為根系中分離，可能表明K.michiganensis細(xì)菌主要分布于植物莖中但也有少數(shù)情況可在植物根系中定植。龔鳳娟等［37］對(duì)杜仲內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離得到了5株內(nèi)生細(xì)菌，其中分離出了和K. pneumoniae細(xì)菌相似度為99%的菌株，其具有ACC脫氨酶活性和抑菌作用，具有ACC脫氨酶活性的植物根際和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)提高植物抗逆境脅迫中有重要作用，而其抑菌作用可能與其具有分泌鐵載體能力有關(guān)。本試驗(yàn)這兩個(gè)類群的代表菌株BXJ71和BXG53都具有生物固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)生長素和分泌鐵載體的能力，BXJ71又具有產(chǎn)蛋白酶能力且生物固氮能力在12個(gè)類群中最強(qiáng)，說明其對(duì)植物氮素的提供上有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而BXG53的溶磷和解鉀能力在12個(gè)類群中最強(qiáng)，說明其對(duì)植物磷、鉀元素的提供上有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究分離得到百香果內(nèi)生菌51株分屬于12個(gè)類群，為10個(gè)屬的12個(gè)種，其中從根中分離得到31株，莖中分離得到13株，葉中分離得到7株，通過各促生特性試驗(yàn)結(jié)果表明從百香果中分離得到的內(nèi)生菌不但具有種群多樣性，而且具有功能多樣性，百香果內(nèi)生菌除了具有溶磷、解鉀、分泌生長素功能，還有具有生物固氮和產(chǎn)鐵載體等促生功能于一體的菌株，其中菌株K. michiganensis BXJ71有最高的固氮酶活性，與K. pneumonia BXG53、Beijerinckia fluminensis BXG212在各方面的促生能力都很強(qiáng)，是集多種功能于一體的微生物種質(zhì)資源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。