賀誼紅 朱 瑋
(吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江西 吉安 343000)
1.1.1 供試菌絲來自吉安市青原山松乳菇子實體組織分離
1.1.2 供試馬尾松種子來自江蘇如意種業(yè)
1.1.3 供試培養(yǎng)基
馬鈴薯、蔗糖、瓊脂、麩皮、蛋白胨、vb1、煙酸、松針?biāo)?/p>
1.2.1 松乳菇母種制備
2018年10月31日在超凈工作臺以無菌操作,取本地市場上野生松乳菇菌柄組織接入由馬鈴薯、蔗糖、瓊脂、麩皮、蛋白胨、vb1、煙酸、松針?biāo)M成的已消毒冷卻的松乳菇母種培養(yǎng)基6支試管(20×20),1管不接松乳菇菌柄組織做空白對照。26℃閉光培養(yǎng)。2管菌絲于2018年11月10日以乳狀態(tài)長于試管培養(yǎng)基斜面;1管菌絲以絲絨狀生長于試管培養(yǎng)基斜面;1管菌絲于2018年11月10日(10d)以白毛絮狀鋪滿試管培養(yǎng)基斜面;2管無菌絲萌發(fā);空白對照管無雜菌感染。三種形態(tài)各轉(zhuǎn)接2次。轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后的三種菌絲形態(tài)如圖1所示。
圖1
1.2.2 松樹種苗處理
1.2.2.1 松樹種子處理
用0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡當(dāng)年種子2h,再用無菌清水沖洗數(shù)次。然后用43℃溫水浸種1晝夜,種皮吸水膨脹后撈 (1)白毛絮狀 (2)絲絨狀 (3)乳狀
出置于已消好毒的河沙中,放于已消好毒的25℃培養(yǎng)箱中催芽,并每天用無菌水淘洗2次直至7天后有30%種子裂嘴露白時,于2018年12月1日在超凈工作臺上將裂嘴露白種子以每瓶1粒,播入裝好已消好毒的壤土基質(zhì)240ml組培瓶中。
壤土基質(zhì)配制:黃心土4份河沙6份攪拌均勻。每130g配好的基質(zhì)壤土加水20ml,分裝240ml組培瓶。126℃高溫高壓消毒1.5h。
1.2.2.2 出苗管理
將播完馬尾松種子的114個組培瓶,放于已消好毒的21℃光照培養(yǎng)箱中出苗。光照1500lxs,每天通風(fēng)2次。經(jīng)18d(2018年12月1日至2018年12月18日)培養(yǎng),106瓶長出松樹苗,出苗率93%。其中18粒種子發(fā)芽初期都有白色菌絲萌發(fā)且全發(fā)育成松樹苗無死亡。
1.2.3 接菌種培養(yǎng)
于2018年12月18日在超凈工作臺上將轉(zhuǎn)接2次將三種形態(tài)的松乳菇菌種(試管種20×20)每管用15ml無菌水稀釋接入已出苗的組培瓶(每瓶1ml)中。絲絨狀菌絲接種松樹苗32株,絲絨狀菌絲接種已長有白色菌絲的松樹苗6株,白毛絮狀菌絲接種松樹苗6株,乳狀菌絲接種松樹苗46株,乳狀菌絲接種已長有白色菌絲的松樹苗12株,4株松樹苗不接松乳菇菌種作空白對照。將接好菌種的松樹苗放于已消好毒的24℃,1500lks光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d,觀察在光照培養(yǎng)箱中不同菌絲狀態(tài)感染馬尾松苗的成活情況。
1.2.4 育苗
定植已感染的菌根苗,用花卉小鏟插入容器袋中央,右手提住帶有土壤基質(zhì)(注意已感染的菌根苗從組培瓶中起苗時根部土球定不要散落)的芽苗放入穴內(nèi),使育苗袋中土壤與芽苗根部土球密合。自然環(huán)境培育,淋水要看天氣或土壤狀況,一般一星期一次,晴天干燥1天要澆2次水,寒流天氣吹北風(fēng)更應(yīng)注意淋透水,既要防干旱,又要防積水爛根,45天后,每隔2周施一次肥(0.4斤尿素+1斤過磷酸鈣兌水100斤),噴施。分別于第10d、第96d、第106d、第133d對已接種菌種松樹苗觀察。
由表1可知不同菌絲狀態(tài)在人工培養(yǎng)環(huán)境下感染馬尾松苗20d,對馬尾松苗的成活率有影響,白毛絮狀菌絲感染馬尾松苗成活率最高,其次是乳狀菌絲感染馬尾松苗成活率高,乳狀(松樹苗已長有白色菌絲)、絲絨狀、絲絨狀(松樹苗已長有白色菌絲)菌絲感染馬尾松苗成活率兼低,未接菌空白株無死亡。綜上所述乳狀菌絲在感染馬尾松苗過程中對馬尾松苗有傷害作用。白毛絮狀菌絲在感染馬尾松苗過程中對馬尾松苗無傷害作用。
表1 不同菌絲狀態(tài)感染馬尾松苗成活率(2018年12月18日至2019年1月7日)
已感染松乳菇不同菌絲狀態(tài)的馬尾松苗經(jīng)過133d在自然環(huán)境下的培養(yǎng),結(jié)果如表2、圖2所示。通過以下圖表可以發(fā)現(xiàn)絲絨狀已有毛感染馬尾松苗、乳狀已有毛感染馬尾松苗在自然環(huán)境下成活率相對絲絨狀感染馬尾松苗、乳狀感染馬尾松苗、白毛絮狀感染馬尾松苗、空白對照馬尾松苗要高。白毛絮狀感染馬尾松苗、空白對照馬尾松苗在自然環(huán)境下存活株數(shù)為0。由上述可見絲絨狀已有毛感染馬尾松苗、乳狀已有毛感染馬尾松苗在自然環(huán)境中抗逆性強。絲絨狀感染馬尾松苗、乳狀感染馬尾松苗、白毛絮狀感染馬尾松苗、空白對照馬尾松苗在自然環(huán)境中易死亡抗逆性弱。
表2 自然環(huán)境培育不同時間段各種已感染不同形態(tài)菌種馬尾松苗成活狀況
圖2
本實驗中白毛絮狀菌絲感染馬尾松苗在人工潔凈條件下培養(yǎng)20d成活率高,而移植于自然環(huán)境中抗逆性弱易死亡。絲絨狀已有毛感染馬尾松苗、乳狀已有毛感染馬尾松苗在人工潔凈條件下培養(yǎng)20d成活率相對不高,在自然環(huán)境下133d成活率高抗逆性強。18粒種子發(fā)芽初期都有白色菌絲萌發(fā)且全發(fā)育成松樹苗無死亡。以上結(jié)果都與許多植物的種子缺乏菌根真菌就很難萌發(fā),即使萌發(fā)也生長不正常甚至夭亡;莫美華報道紅汁乳菇提取物有抑制某些植物的發(fā)芽及生長,[1]相接近符合。絲絨狀已有毛感染馬尾松苗、乳狀已有毛感染馬尾松苗在人工潔凈條件下培養(yǎng)20d成活率相對不高,在自然環(huán)境下133d成活率高抗逆性強,此與植物種子發(fā)芽幾周后外生菌根便在二級菌系形成相符合。由此可見白毛絮狀菌絲及馬尾松種子發(fā)芽初期的白色菌絲具有向還無完整根系的馬尾松苗輸送營養(yǎng)的作用,而絲絨狀菌絲有利于菌根的形成,利于馬尾松苗自然環(huán)境下生長。本實驗因是初實驗樣本數(shù)量偏少,為增加高可信度,在以后的實驗中還需加大樣本數(shù)。至于白毛絮狀菌絲、馬尾松苗已有白色菌絲、絲絨狀菌絲、乳狀菌絲之間的鑒定及關(guān)系還需要出菇及分子生物學(xué)方面的實驗來驗證。