熊剛，曹丹 ，劉艷婷，趙思涵，肖光軍 （通信作者）

1 三臺縣婦幼保健院檢驗科 （四川綿陽 621100）；2 遂寧市中心醫(yī)院檢驗科（四川遂寧 629000）

腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）是一種與機體嘌呤代謝和免疫功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)[1]，其在淋巴細胞的發(fā)育及成熟過程中起重要作用，并在免疫細胞的增殖、分化、功能等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。相關(guān)研究表明，多種感染、腫瘤、代謝性疾病及免疫相關(guān)性疾病患者的血清ADA 水平增高，且ADA 水平與患者病情嚴重程度及預(yù)后密切相關(guān)，故ADA 被大量應(yīng)用于臨床診療及預(yù)后評估中[1-8]。目前，臨床實驗室常用紫外速率法和酶偶聯(lián)顯色法檢測機體外周血中的ADA水平，但因我國未發(fā)布基于多中心的中國人群ADA 參考區(qū)間，故臨床實驗室常使用試劑盒說明書提供的血清參考區(qū)間[9-11]。相關(guān)研究顯示，血漿與血清中的ADA 水平存在一定差異，且不同文獻報道的研究結(jié)果也存在一定差異[12-13]，但均推薦使用血清標(biāo)本進行外周血ADA 水平的檢測，以便于使用血清參考區(qū)間來解釋檢測結(jié)果。然而，大部分國產(chǎn)試劑盒說明書均注明可使用血清或血漿標(biāo)本進行外周血ADA 水平的檢測，故本研究對肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的一致性進行了評估，并對ADA 檢測試劑盒的血清參考區(qū)間在肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本中的適宜性進行了評估，從而為臨床實驗室ADA 的檢測及參考區(qū)間的引用提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以遂寧市中心醫(yī)院住院患者同時送檢的肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本和血清標(biāo)本檢測后剩余樣本為研究對象，每天收集8份，連續(xù)5 d，共收集40份，用于血漿樣本與血清樣本ADA 檢測結(jié)果的一致性評估；同時，參照衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》及相關(guān)文獻的要求[9-11]，通過問卷調(diào)查、體格檢查、B 超檢查、影像檢查及實驗室篩查排除等方法[9-11]，從2019年1—12月體檢科20～79歲健康體檢成人中篩選表觀健康成人組成參考人群，以驗證血清參考區(qū)間的適宜性。本研究共納入?yún)⒖紓€體1 483名，剔除離群值后剩余1479名，其中男731例，年齡為42（31，53）歲；女748例，年齡為39（30，50）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 儀器與試劑

日立7600全自動生化分析儀；四川邁克生物股份有限公司提供的ADA 檢測試劑盒（過氧化物酶法）、配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，嚴格按照試劑盒說明書的要求設(shè)置生化分析儀的檢測參數(shù)；血漿標(biāo)本使用肝素鈉抗凝真空采血管采集，血清標(biāo)本使用不含任何添加劑的紅色真空采血管采集，真空采血管及其配套采血針均由成都瑞琦醫(yī)療科技有限公司提供。需注意檢測前檢查儀器狀態(tài)良好并對其進行定期校準(zhǔn)和常規(guī)維護保養(yǎng)，且室內(nèi)質(zhì)控正常水平和病理水平均在控。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理

40例住院患者的空腹血漿和血清標(biāo)本均由住院部護士使用相應(yīng)真空采血管規(guī)范采集，每管各3 ml；所有參考個體的標(biāo)本均由檢驗科工作人員在體檢科使用肝素鈉抗凝真空采血管規(guī)范采集，每管3 ml。標(biāo)本采集后，充分混勻，然后垂直放置于泡沫板上，及時送檢，運輸中避免劇烈震蕩。實驗室收到樣本后，以4 000 r/min、5 min 的參數(shù)離心，然后使用1.5 ml 的離心管盛裝分離后的血漿和血清，并于采樣后2 h 內(nèi)完成所有標(biāo)本的檢測。

1.3.2 血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的一致性評估

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會EP9-A2文件的要求，以同一患者的血清標(biāo)本為參考標(biāo)本（X），肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本為待評價標(biāo)本（Y）進行檢測結(jié)果的對比[14-15]，并繪制兩標(biāo)本間檢測結(jié)果的偏倚圖，采用配對t檢驗對兩標(biāo)本檢測結(jié)果的均值進行分析。線性回歸分析顯示相關(guān)系數(shù)r≥0.975時，表示X取值范圍合適，可通過線性回歸方程來評估兩標(biāo)本間檢測結(jié)果的斜率（b）和截距（a），然后計算4 、10、22 U/L（其中4、22 U/L 分別為血清參考區(qū)間的下限和上限）水平處血漿標(biāo)本的預(yù)期偏倚（SE%）[15]，并以2021年國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)中ADA 總允許誤差（TEa）的1/2為臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，評估兩標(biāo)本間ADA 檢測結(jié)果的一致性。SE%={(b-1)×X+a}×100/X，不同水平處的SE%均≤1/2TEa則表示兩標(biāo)本間檢測結(jié)果具有一致性。ADA 的TEa為靶值±25%。

1.3.3 參考區(qū)間的驗證與建立

采用Dixon法對參考人群血漿ADA 的檢測結(jié)果進行離群值檢驗[9-11]，然后通過1.3.2的一致性評估結(jié)果來判斷是否需要自建參考區(qū)間。當(dāng)肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果具有一致性時，則使用參考人群血漿ADA 檢測結(jié)果來驗證血清參考區(qū)間的適宜性，驗證通過則表示可直接引用試劑盒說明書提供的血清參考區(qū)間，驗證未通過則根據(jù)參考人群血漿ADA 水平采用非參數(shù)法自建參考區(qū)間（P2.5～P97.5）[9-11]；而兩標(biāo)本間檢測結(jié)果不具有一致性時，則根據(jù)參考人群血漿ADA 水平采用非參數(shù)法自建參考區(qū)間（P2.5～P97.5）[12-13，15]。各組血漿檢測結(jié)果落在血清參考區(qū)間內(nèi)的比例≥90%，則參考區(qū)間驗證通過；反之，則驗證未通過[9-11]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件及Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料正態(tài)性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov檢驗，P＜0.05表示呈非正態(tài)分布，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，而呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則使用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的一致性

經(jīng)離群值檢驗，組內(nèi)和組間均未見離群值；同一患者肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 的檢測結(jié)果分別為（12.01±5.78）U/L 和（12.35±5.95）U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.602，P＜0.05）；但經(jīng)線性回歸分析，回歸方程為Y=0.9663X+0.0752，相關(guān)系數(shù)r為0.9952，說明可使用線性回歸方程來計算血漿標(biāo)本的SE%，從表1可見不同水平處兩標(biāo)本間的SE%均滿足臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果具有一致性。血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的散點圖和偏倚圖見圖1、圖2，不同水平處肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本的SE%見表1。

圖1 血清與血漿標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的散點圖

圖 2 血漿與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的偏倚圖

表1 不同水平處肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本的SE%

2.2 血清參考區(qū)間的適宜性驗證

經(jīng)Dixon檢驗剔除離群值后剩余1 479名參考個體，其性別和年齡分布見表2。根據(jù)年齡和性別將參考人群分為12個亞組，各組血漿檢測結(jié)果落在血清參考區(qū)間內(nèi)的符合率均≥90%，故各組參考區(qū)間驗證均通過，見表2。

表2 血清參考區(qū)間在遂寧地區(qū)表觀健康成人肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本中的適宜性驗證

3 討論

由于我國ADA 檢測試劑盒的生產(chǎn)廠家較多，檢測原理及性能指標(biāo)均存在一定差異，與不同廠家或不同型號的生化分析儀組成不同的檢測系統(tǒng)后，導(dǎo)致各實驗室間的檢測結(jié)果存在較大差異；同時，由于ADA 檢測缺少統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致在試劑盒性能驗證、實驗室內(nèi)儀器間對比、實驗室間對比等活動中，各臨床實驗室所使用的可接受標(biāo)準(zhǔn)也存在一定的差異，從而導(dǎo)致相關(guān)文獻的研究結(jié)論也存在一定差異[12-13]。本研究在進行肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果一致性評估時也受此因素的影響，因缺少統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而選擇募集本地區(qū)20～79歲表觀健康成人來自建參考區(qū)間，但因國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心在2020年新增了ADA 檢測的室間質(zhì)量評價活動，并發(fā)布了質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，故對血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果一致性評估的數(shù)據(jù)重新進行了分析，并根據(jù)分析結(jié)果評估了血清參考區(qū)間在血漿標(biāo)本中的適宜性。

本研究結(jié)果顯示，肝素鈉抗凝血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但線性回歸分析結(jié)果顯示兩標(biāo)本的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性（r=0.9952），其回歸方程為Y=0.9663X+0.0752。在研究初期，因ADA 檢測無質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，故采用譚延國等[13]的檢驗結(jié)果一致性評估方案來評估其一致性，其初步研究結(jié)果顯示血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本ADA 檢測結(jié)果缺乏一致性，故推薦使用血清標(biāo)本檢測血液中ADA 的水平，若使用血漿標(biāo)本則需自建血漿參考區(qū)間或進行血清參考區(qū)間的轉(zhuǎn)換驗證[13]。隨著2020 年國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心ADA 檢測質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，我們通過線性回歸方程計算血漿標(biāo)本在不同水平處的SE%，從表1可見其SE%均＜1/2TEa，說明血漿標(biāo)本與血清標(biāo)本的ADA 檢測結(jié)果具有一致性，可使用血漿標(biāo)本代替血清標(biāo)本來檢測機體外周血的ADA 水平，并可使用血清參考區(qū)間來解釋血漿標(biāo)本的檢測結(jié)果。但因參考區(qū)間受檢測系統(tǒng)、服務(wù)人群、飲食結(jié)構(gòu)、地理環(huán)境等多種因素的影響，相關(guān)文件均要求各臨床實驗室開展新項目或引用新的參考區(qū)間時需對其適宜性進行評估，故本研究通過前期準(zhǔn)備自建血漿參考區(qū)間而收集的遂寧地區(qū)1 479名20～79歲表觀健康成人血漿ADA的檢測結(jié)果，來驗證血清參考區(qū)間在血漿標(biāo)本中的適宜性，從表2可見，男性和女性各年齡段的符合率均≥90%，說明參考區(qū)間驗證通過，該血清參考區(qū)間可用于該地區(qū)20～79歲成人血漿ADA 檢測結(jié)果的解釋。同時，從表2可發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)男性和女性外周血ADA 的水平均隨年齡的增長緩慢上升，且同年齡段女性的ADA 水平高于男性，其原因需進一步研究，但臨床結(jié)果解釋時需考慮性別、年齡等因素對檢測結(jié)果的影響。相關(guān)研究表明，部分檢測項目在老年人、孕婦、兒童血液中的水平及其變化情況與成年人存在一定差異，臨床實驗室應(yīng)重視其參考區(qū)間的調(diào)查與制定，但本研究納入的研究對象為20～79歲的健康成人，未能對ADA 血清參考區(qū)間在孕婦、兒童等特殊人群中的適宜性進行評估，仍需進一步研究，必要時可采用直接法或間接法自建參考區(qū)間[16-20]。

綜上所述，我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或試劑盒說明書常規(guī)生化檢測項目的參考區(qū)間均為血清參考區(qū)間，故大部分臨床實驗室使用血清標(biāo)本進行常規(guī)生化項目的檢測，若擬使用血漿標(biāo)本代替血清標(biāo)本進行檢測時，即使試劑盒說明書注明兩種標(biāo)本均可使用，臨床實驗室也應(yīng)對兩標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性及血清參考區(qū)間的適宜性進行評估；同時，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測技術(shù)、試劑盒質(zhì)量及臨床實驗室質(zhì)量水平均不斷提高，為進一步滿足臨床診療需求，檢驗質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)也可能會不斷提高，當(dāng)發(fā)生改變時，臨床實驗室應(yīng)重新進行評估。