魯青蓮, 劉林莉, 蔣亞輝, 楊和榮, 孟 君, 鄧玲俐, 房 慧

(四川省遂寧市中心醫(yī)院皮膚科, 四川 遂寧 629000)

皮膚鱗狀細胞癌簡稱皮膚鱗癌.是一種皮膚上皮的惡性增生,占皮膚癌的20%-50%[1]。其中大部分腫瘤通過手術切除可成功根除,但仍有部分腫瘤手術切除后表現(xiàn)較高的復發(fā)性、轉(zhuǎn)移性甚至可至死亡[2]。臨床治療皮膚鱗癌常用全身化療的方案,鉑類抗癌藥物的單獨用藥或聯(lián)合用藥是化療的標準藥物[3]?；熕幬锏母弊饔?、耐藥性成為限制藥物的治療效果,因此迫切需要新安全藥物。天然中草藥是最佳的毒副作用小、安全有效的抗癌藥物。最近發(fā)現(xiàn),四腳草黃酮抑制皮膚鱗癌細胞蛋白酶體發(fā)揮抗癌作用[4],扁蓄苷通過抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/NF-êB信號通路活性發(fā)揮抗皮膚鱗癌細胞增殖遷移侵襲功能[5]。紅芪是一種豆科植物的干燥根部,與黃芪同科,功效也與黃芪相似。紅芪的化學成分十分復雜,包括多糖、黃酮類、皂苷類、糖苷類等,其功效也十分廣泛,如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等[6,7]。紅芪多糖是其有效成分之一,具有抗口腔鱗癌、膠質(zhì)瘤、肝癌的治療作用[8～10]。但是其在皮膚鱗癌中的作用尚未有研究報道。本研究擬以皮膚鱗癌細胞SCL-1為研究對象,觀察紅芪多糖對SCL-1細胞存活、凋亡的影響,揭示紅芪多糖抑制SCL-1細胞增殖,促進凋亡的機制與激活線粒體凋亡途徑有關,以期為皮膚鱗癌的臨床治療提供新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1材料:人皮膚鱗癌細胞SCL-1購自美國菌種保藏中心；紅芪多糖(純度87.44%)來自本醫(yī)院藥理研究室；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青；細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)購自北京康為世紀公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素-碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TAKERA；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自北京雷根生物公司；兔抗Cleaved PARP單抗、兔抗Cleaved Caspase-3單抗、兔抗Cleaved Caspase-9單抗、兔抗Cytochrome c單抗、兔抗Smac單抗、兔抗Bax單抗、兔抗Bak單體、HRP標記的二抗均購自上海艾博抗公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng):用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SCL-1細胞,同時混有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天更換一次細胞培養(yǎng)液。

1.2.2分組與處理:將正常培養(yǎng)的SCL-1細胞,添加不含紅芪多糖的PBS緩沖液培養(yǎng),標記為對照組。紅芪多糖(25、50、100μg/mL,PBS溶液作為稀釋液)處理的SCL-1細胞標記為25μg/mL組、50μg/mL組、100μg/mL組,篩選最適濃度50μg/mL處理的SCL-1細胞標記為HPS組。SCL-1細胞培養(yǎng)24h后,取紅芪多糖(25、50、100μg/mL)100μL混入培養(yǎng)液作為新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

1.2.3CCK8法檢測細胞增殖抑制率:收集對照組、25μg/mL組、50μg/mL組、100μg/mL組培養(yǎng)了24、48、72h的待檢測細胞,調(diào)整5×104個/mL,取200μL置于96孔板。每孔加入20μL的CCK溶液,充分混勻。室溫下避光孵育1.5h,上酶標儀,在490nm波長下檢測細胞的吸光度(A490值)。細胞增殖抑制率=[1-A490實驗組/A490對照組]×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率[11]:收集培養(yǎng)48h的對照組、25μg/mL組、50μg/mL組、100μg/mL組細胞,使用PBS洗滌3次,調(diào)至5×105個/mL,再用500μL的結(jié)合緩沖液重懸細胞。取Annexin V-FITC(10μL)和PI(5μL)充分混合后,室溫避光孵育30min。結(jié)束后在1h內(nèi)上流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測分析?？偟蛲雎?%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位:收集培養(yǎng)48h的對照組、HPS組細胞,用PBS液充分清洗,加入JC-1染色液500μL,輕微震蕩混勻,置于37℃孵育20min。結(jié)束后,加入結(jié)合緩沖液重懸細胞,離心取沉淀細胞,再用PBS懸浮細胞。將懸浮的細胞加入流式細胞儀檢測分析細胞線粒體膜電位。使用FL2通道紅色熒光與FL1通道綠色熒光的比值表示線粒體膜電位。

1.2.6WB實驗檢測細胞漿和線粒體的Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cytochrome c、Smac、Bax、Bak的蛋白表達:收集培養(yǎng)48h的對照組、HPS組細胞,RIPA冰上裂解30 min,提取細胞總蛋白?；蛘甙凑瞻|(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒要求操作提取蛋白。使用Bradford 法蛋白定量,沸水浴10 min進行蛋白變性。取60μg變性蛋白上清液用于SDS-PAGE電泳上樣。配置的凝膠上層為10%的濃縮膠,下層為5%的分離膠。恒壓電泳時,濃縮膠使用80 V-45 mA,電泳40～45 min,分離膠使用120 V-60 mA,電泳1.5h。結(jié)束后進行恒流轉(zhuǎn)膜,200mA-100V。轉(zhuǎn)膜時需在0℃低溫條件下操作。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將膜用2.5%的脫脂奶粉37℃封閉處理1h。充分洗膜,浸入稀釋過的一抗溶液(兔抗Cleaved PARP單抗,1∶800；兔抗Cleaved Caspase-3單抗，1∶1000；兔抗Cleaved Caspase-9單抗，1∶1500；兔抗Cytochrome c單抗1∶1000；兔抗Smac單抗,1∶500；兔抗Bax單抗,1∶1000；兔抗Bak單抗,1∶1000),4℃孵育12 h。取出膜充分清洗后再浸入稀釋過的二抗溶液(HRP標記的二抗,1∶500),37℃孵育1.5 h。用ECL電化學發(fā)光試劑盒曝光顯影、定影。Image J軟件處理各組蛋白條帶的灰度值,以目的條帶與內(nèi)參(GAPDH)條帶的比值表示蛋白表達。

2 結(jié) 果

2.1紅芪多糖對SCL-1細胞增殖的影響:與對照組相比,25μg/mL組、50μg/mL組、100μg/mL組細胞在24、48、72h的增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與25μg/mL組相比,50μg/mL組、100μg/mL組細胞在24、48、72h時增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與50μg/mL組相比,100μg/mL組細胞在24h的增殖抑制率顯著升高(P<0.05),48、72h時增殖抑制率差異不顯著(P>0.05)故選用紅芪多糖處理48h的SCL-1細胞最合適。見表1。

表1 不同濃度紅芪多糖調(diào)控SCL-1細胞的增殖

2.2紅芪多糖對SCL-1細胞凋亡的影響:與對照組相比,25μg/mL組、50μg/mL組、100μg/mL組SCL-1細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。與25μg/mL組相比,50μg/mL組、100μg/mL組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與50μg/mL組相比,100μg/mL組細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)。故選用50μg/mL紅芪多糖處理的SCL-1細胞最合適。見圖1、表2。

2.3紅芪多糖對SCL-1細胞線粒體膜電位的影響:與對照組相比,HPS組細胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。見表3。

圖1 不同濃度紅芪多糖處理的SCL-1細胞凋亡圖

表2 不同濃度紅芪多糖處理的SCL-1細胞凋亡率

表3 紅芪多糖對SCL-1細胞線粒體膜電位的調(diào)控

2.4紅芪多糖對SCL-1細胞線粒體凋亡相關蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達的影響:與對照組相比,HPS組細胞Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 紅芪多糖處理的SCL-1細胞Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的蛋白圖

2.5紅芪多糖對SCL-1細胞線粒體釋放Cytochrome c、Smac的影響:與對照組相比,HPS組細胞漿Cytochrome c、Smac的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖3、表5。

表4 紅芪多糖處理的SCL-1細胞Cleaved PARP Cleaved Caspase-3Cleaved Caspase-9的蛋白表達

圖3 紅芪多糖處理的SCL-1細胞漿Cytochrome c、Smac的蛋白圖

表5 紅芪多糖處理的SCL-1細胞漿Cytochrome c Smac的蛋白表達量

2.6紅芪多糖對SCL-1細胞Bax、Bak轉(zhuǎn)位至線粒體的影響:與對照組相比,HPS組細胞漿Bax、Bak的蛋白表達差異不顯著,線粒體Bax、Bak的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖4、表6。

表6 紅芪多糖處理的SCL-1細胞漿 線粒體中Bax Bak蛋白的表達量

圖4 Bax、Bak在紅芪多糖處理的SCL-1細胞漿、線粒體中的蛋白表達

3 討 論

紅芪多糖是中藥紅芪的多糖提取物,隨著藥理研究技術的不斷提高,其在疾病中的新功能也不斷被發(fā)現(xiàn)。曾素娟等[8]研究發(fā)現(xiàn),紅芪多糖、硒化紅芪多糖呈濃度依賴性抑制口腔癌細胞的增殖,并通過激活死亡受體Fas/Fasl基因發(fā)揮促凋亡作用,揭示了紅芪多糖在促進癌細胞凋亡的精準治療中的潛在價值。Du等[9]發(fā)現(xiàn),紅芪多糖能夠在體內(nèi)和體外抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,促進其凋亡,并通過調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路抑制腫瘤生長,展示了紅芪多糖的抗膠質(zhì)瘤功能。本研究發(fā)現(xiàn),紅芪多糖呈時間、濃度依賴性抑制皮膚鱗癌細胞SCL-1的增殖,促進其凋亡,這揭示了紅芪多糖潛在的抗皮膚鱗癌功能。為了進一步探究紅芪多糖的凋亡促進機制,實驗檢測了SCL-1細胞線粒體膜電位發(fā)現(xiàn),紅芪多糖處理的SCL-1細胞線粒體膜電位明顯降低,這暗示紅芪多糖的抗癌功能可能與線粒體相關。

據(jù)報道,在肝癌的研究中,中藥落葉松脂素通過降低線粒體膜電位,誘導線粒體釋放細胞色素C,激活線粒體介導的凋亡信號通路,進而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖,促進凋亡的抗癌作用[10]。雖然紅芪多糖在皮膚鱗癌中的抗癌功能雖得到實驗證實,但是其作用機制仍需繼續(xù)探討。鑒于落葉松脂素的抗肝癌線粒體凋亡途徑,推測紅芪多糖的抗皮膚鱗癌功能機制可能也與誘導線粒體介導的癌細胞凋亡有聯(lián)系。通過凋亡(程序性細胞死亡)途徑用于抵抗癌癥已成為臨床癌癥治療研究的焦點,開發(fā)高效的促凋亡藥物成了腫瘤基礎醫(yī)學研究的重點。Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成員控制凋亡蛋白的平衡,維持線粒體膜的通透性[11]。抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl)位于線粒體外膜,抑制細胞色素C、Smac釋放,而促凋亡蛋白(如Bax、Bak)位于細胞漿,當細胞接收到外部凋亡信號,促凋亡蛋白會轉(zhuǎn)移至線粒體,釋放細胞色素C、Smac至細胞漿[12]。值得注意的是,在現(xiàn)有的細胞凋亡途徑中,線粒體膜電位的降低代表了細胞凋亡的起始,該過程的發(fā)生早于DNA斷裂、細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、Caspase-3蛋白酶的激活和細胞形態(tài)的改變[13]。大量研究報道,線粒體途徑凋亡參與多種癌細胞的增殖、遷移侵襲、靶向效應、耐藥性、放療敏感性等,其中包括皮膚鱗癌。但是該途徑在皮膚鱗癌中與紅芪多糖之間的聯(lián)系尚未有人研究。本研究檢測了紅芪多糖處理的SCL-1細胞的線粒體膜電位發(fā)現(xiàn),紅芪多糖可明顯降低癌細胞的線粒體膜電位,升高線粒體凋亡相關蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達,促進線粒體釋放Cytochrome c、Smac,促進Bax、Bak轉(zhuǎn)移至線粒體,這些實驗結(jié)果驗證了紅芪多糖治療皮膚鱗癌的機制與線粒體凋亡途徑之間的緊密聯(lián)系,這也暗示了線粒體凋亡作為抗癌靶點的巨大潛力。本研究下一步計劃展開紅芪多糖在皮膚鱗癌動物模型中的深入研究,為紅芪多糖提高皮膚鱗癌患者預后提供更充分的實驗證據(jù)。

總之,紅芪多糖具有抑制皮膚鱗癌細胞增殖,促進凋亡的抗癌作用,產(chǎn)生這種治療效果的機制為激活癌細胞的線粒體凋亡途徑緊密相關,為紅芪多糖用于臨床治療皮膚鱗癌奠定理論基礎。