祁宏亮，李莎莎，武彥秋，趙宏偉，李俊喬，周啟立

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

新生兒敗血癥是因細(xì)菌或真菌侵入新生兒血液循環(huán)，并通過(guò)繁殖經(jīng)血流擴(kuò)散引起的全身性疾病，其常伴有血流動(dòng)力學(xué)變化以及呼吸暫停、體溫不穩(wěn)、黃疸等臨床表現(xiàn)，是全球范圍內(nèi)新生兒死亡的主要原因之一[1-2]。新生兒敗血癥可在短時(shí)間內(nèi)分泌大量促炎因子，進(jìn)而誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，增加多器官功能障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。然而臨床對(duì)于新生兒敗血癥炎癥反應(yīng)及器官功能障礙發(fā)生機(jī)制的研究仍不充分。近幾年臨床研究越來(lái)越關(guān)注microRNA(miRNA)與新生兒敗血癥病理機(jī)制的相關(guān)性，有研究發(fā)現(xiàn)miR-15a、miR-16與新生兒敗血癥密切相關(guān)，miR-15a/16基因轉(zhuǎn)染下調(diào)了經(jīng)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理的細(xì)胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1的轉(zhuǎn)錄水平，并且二者可被長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG16下調(diào)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4]。因此，本研究擬通過(guò)分析新生兒敗血癥樣本，探討血清miR-16與新生兒敗血癥患兒心功能障礙及炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，以期為臨床實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診療提供靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析119例2016年1月1日至2020年6月1日于我院確診為新生兒敗血癥的患兒(敗血癥組)臨床資料，胎齡25～42周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《新生兒敗血癥診療方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，伴有呼吸急促、心動(dòng)過(guò)速或胃腸道反應(yīng)等非特異性臨床表現(xiàn)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)<5×109/L或>20×109/L，血小板計(jì)數(shù)<100×109/L，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)>100 mg/L；②血培養(yǎng)結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前接受過(guò)抗感染治療；②合并窒息、血液疾病或凝血功能障礙；③伴有先天性心臟病、消化道畸形等嚴(yán)重先天性畸形、遺傳代謝疾病或免疫缺陷疾病。另選取100例同期住院的普通感染新生兒作為對(duì)照組，胎齡26～41周。2組新生兒臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。根據(jù)左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)判斷住院期間患兒有無(wú)心臟收縮功能障礙，將敗血癥組患兒分為心功能障礙組(LVEF<50%)及無(wú)心功能障礙組(LVEF≥50%)2個(gè)亞組。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017028)，所有新生兒的法定監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情，并簽署同意書。

表1 2組新生兒臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 敗血癥組及對(duì)照組患兒入組后分別取外周靜脈血11 mL、5 mL置于促凝管中，在室溫下使用離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，收集上清液，再以15 000 r/min離心30 min除去細(xì)胞碎片，置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。

1.2.2 血清miR-16表達(dá)檢測(cè) 按照miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen公司，德國(guó))及miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司，德國(guó))說(shuō)明書分離血清miRNA及mRNA。采用FastQuant RT試劑盒(TianGen公司，中國(guó))將miRNA、mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min獲得cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒(TransGen公司，中國(guó))依照說(shuō)明書在Applied Biosystems 7300 Sequence Detection系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR，擴(kuò)增條件為95 ℃變性10 min，95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用U6基因作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT公式對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)樣本平均檢測(cè)3次。miR-16引物序列：正向5’-TCGGCGTAGCAGCACGTAAAT-3’，反向5’-GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6基因引物序列：正向5’-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3’，反向5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3’。

1.2.3 血清炎癥因子檢測(cè) 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)血清炎癥因子CRP、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平。

1.2.4 超聲心動(dòng)圖及心肌損傷標(biāo)志分子檢測(cè) 應(yīng)用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，取胸骨旁左心室長(zhǎng)軸和標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔心切面，測(cè)量QT離散度，計(jì)算Tie指數(shù)和LVEF；采用邁瑞B(yǎng)S-200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶心肌同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ，cTnⅠ)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid-binding protein，H-FABP)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組新生兒血清miR-16表達(dá)水平比較

經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，敗血癥組患兒的血清miR-16表達(dá)水平為(1.836±0.951)，顯著高于對(duì)照組的(1.080±0.230)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.759，P<0.001)。

2.2 新生兒敗血癥患兒血清miR-16表達(dá)水平與心功能障礙的關(guān)系

敗血癥組患兒中有62例被診斷為心功能障礙，其余57例患兒則被納入無(wú)心功能障礙組。2組患兒的臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；心功能障礙組患兒的血清miR-16表達(dá)、IL-6、CRP、cTnⅠ、LDH、CK-MB、H-FABP水平及QT離散度、Tie指數(shù)均顯著高于無(wú)心功能障礙組患兒，而LVEF則顯著低于無(wú)心功能障礙組患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 心功能障礙組和無(wú)心功能障礙組新生兒基線臨床資料比較

2.3 多因素Logistic回歸分析新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的影響因素

經(jīng)多因素Logistic回歸分析，血清miR-16表達(dá)水平是新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的影響因素

2.4 ROC曲線分析血清miR-16表達(dá)水平診斷新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，采用血清miR-16表達(dá)水平診斷新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的AUC為0.901(95%CI：0.846～0.956)，cut-off值為1.496，在該閾值下，特異度和靈敏度分別為80.7%和85.5%，約登指數(shù)為0.662，見圖1。

圖1 血清miR-16表達(dá)水平診斷新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的ROC曲線

2.5 新生兒敗血癥患兒血清miR-16表達(dá)水平與炎癥因子和心肌損傷標(biāo)志分子水平的關(guān)系

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，新生兒敗血癥患兒的血清miR-16表達(dá)水平與IL-6、CRP、cTnⅠ、LDH、CK-MB、H-FABP水平呈顯著正相關(guān)性(r=0.439、0.341、0.325、0.842、0.683、0.705，P<0.001)，見圖2。

3 討論

敗血癥是新生兒死亡的重要原因之一，由于新生兒器官還未發(fā)育成熟，且特異性及非特異性免疫反應(yīng)功能低下，病菌侵入新生兒血液系統(tǒng)后，會(huì)大量繁殖造成全身感染性疾病，導(dǎo)致病情進(jìn)展迅速，病死率高[6-7]。全身炎癥反應(yīng)為敗血癥病理生理過(guò)程的表現(xiàn)之一，大量炎癥因子釋放后，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入組織、器官，從而引起器官功能障礙[3]。本研究結(jié)果顯示，敗血癥組新生兒的血清miR-16表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組新生兒，因此我們進(jìn)一步探究了血清miR-16在新生兒敗血癥患兒中的差異表達(dá)是否與炎癥因子、心功能障礙相關(guān)。

新生兒敗血癥的易感性、嚴(yán)重程度受多方面影響，包括母體因素、環(huán)境暴露、新生兒免疫狀態(tài)以及炎癥反應(yīng)等。革蘭氏陽(yáng)性菌可通過(guò)外毒素及細(xì)胞抗原啟動(dòng)新生兒敗血癥的炎癥反應(yīng)，革蘭氏陰性菌則通過(guò)細(xì)胞壁內(nèi)LPS的釋放啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。有研究表明，新生兒敗血癥患兒CRP、TNF-α、IL-6、PCT等多個(gè)生化、免疫學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)水平均有差異[8]。CRP為發(fā)生感染或炎癥時(shí)在肝中合成的急性期蛋白，但其也在胎兒窘迫、產(chǎn)婦發(fā)熱等情況下升高，因此特異性較低；IL-6由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌感染而產(chǎn)生，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)早期增加，同時(shí)IL-6還可引起包括分泌CRP在內(nèi)的急性期反應(yīng)，在敗血癥早期感染時(shí)就能檢測(cè)到其水平增加，但I(xiàn)L-6半衰期較短，臨床常將其與其他指標(biāo)聯(lián)合輔助診斷[9-10]。臨床常使用上述兩個(gè)指標(biāo)對(duì)新生兒敗血癥進(jìn)行輔助診斷，以減少確診時(shí)間，同時(shí)IL-6、CRP還可反映患兒全身炎癥反應(yīng)程度，與新生兒敗血癥的發(fā)展息息相關(guān)[7]。在本研究中，血清miR-16表達(dá)水平與IL-6、CRP水平表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，說(shuō)明miR-16表達(dá)上調(diào)可能與機(jī)體炎癥反應(yīng)加重有關(guān)。

a:血清miR-16表達(dá)水平與IL-6水平的相關(guān)性；b:血清miR-16表達(dá)水平與CRP水平的相關(guān)性；c:血清miR-16表達(dá)水平與cTnⅠ水平的相關(guān)性；d:血清miR-16表達(dá)水平與LDH水平的相關(guān)性；e:血清miR-16表達(dá)水平與CK-MB水平的相關(guān)性；f:血清miR-16表達(dá)水平與H-FABP水平的相關(guān)性

既往研究證實(shí)miRNA參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，新生兒敗血癥患兒的血清miR-96-5p低表達(dá)可抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞中核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路、靶向煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶來(lái)減輕新生兒敗血癥的炎癥反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a過(guò)表達(dá)有部分通過(guò)靶向TLR4抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；miR-129-5p過(guò)表達(dá)也可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-8水平升高，減輕新生兒敗血癥患兒的炎癥反應(yīng)[12-13]。Cheng等[14]的研究也顯示新生兒敗血癥患兒血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞及血清中的IL-6顯著上調(diào)，可能與miR-26下調(diào)有關(guān)，證實(shí)了miR-26參與新生兒敗血癥的發(fā)病和免疫應(yīng)答。而Wang等[15]的研究中新生兒敗血癥患兒的miR-15a/16表達(dá)均較正常新生兒上調(diào)，同時(shí)該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)miR-15a/16模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，證明miR-15a/16轉(zhuǎn)染下調(diào)TLR4、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1的轉(zhuǎn)錄水平，western blot檢測(cè)也顯示miR-15a/16能抑制TLR4和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1的表達(dá)，說(shuō)明miR-16表達(dá)與新生兒敗血癥炎癥反應(yīng)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在敗血癥或全身炎癥反應(yīng)綜合征患者血清中伴有miR-15a/16高表達(dá)[16]，本研究也具體分析了miR-16表達(dá)與IL-6及CRP水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示新生兒敗血癥患兒的血清miR-16表達(dá)水平與IL-6、CRP水平表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性。

心臟被認(rèn)為是新生兒敗血癥炎癥反應(yīng)累及最嚴(yán)重的臟器，往往表現(xiàn)為心肌損傷、左心收縮能力下降[17]。本研究將新生兒敗血癥患兒分為心功能障礙組及無(wú)心功能障礙組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心功能障礙組患兒的血清miR-16表達(dá)、IL-6、CRP、cTnⅠ、LDH、CK-MB、H-FABP水平及QT離散度、Tie指數(shù)均顯著高于無(wú)心功能障礙組患兒，而LVEF則顯著低于無(wú)心功能障礙組，且新生兒敗血癥患兒的血清miR-16表達(dá)水平與cTnⅠ、LDH、CK-MB、H-FABP水平表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，說(shuō)明血清miR-16表達(dá)水平與新生兒敗血癥患兒心肌損傷密切相關(guān)；通過(guò)ROC進(jìn)一步證實(shí)血清miR-16表達(dá)水平對(duì)新生兒敗血癥患兒心功能障礙有診斷價(jià)值。

綜上所述，新生兒敗血癥患兒伴血清miR-16高表達(dá)，并且血清miR-16高表達(dá)與新生兒敗血癥患兒全身炎癥反應(yīng)及心臟等器官的功能障礙密切相關(guān)。血清miR-16表達(dá)水平是新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙的獨(dú)立臨床因素，因此檢測(cè)血清miR-16表達(dá)水平對(duì)新生兒敗血癥患兒發(fā)生心功能障礙有一定診斷價(jià)值。